Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos

Usando este protocolo, visualizamos a organização de proteínas fisomantes citoesqueléticos em substratos de padrão exibindo várias curvaturas. Podemos testar a sensibilidade da curvatura. A resolução de imagens de microscópio eletrônico de varredura é alta o suficiente para que as organizações de escala de nanômetros sejam visualizadas.

Os métodos que usamos para fixação são leves o suficiente para preservar a organização intraestrusa da proteína. Isso permanece no âmbito de pesquisas fundamentais para entender o comportamento dos filamentos citoesqueléticos. Comece projetando um adesivo óptico ondulado norland, ou noa réplica, em um ambiente de sala limpa a partir de padrões ondulados de polidimtilsiloxano ondulado ondulado de 250 nanômetros de amplitude e dois micrômetros de periodicidade lateral.

Para isso, deposite cinco microliters de NOA líquido em um deslizamento circular de tampa de vidro de um centímetro de diâmetro e, em seguida, coloque o modelo PDMS na gota. Trate a montagem com luz UV a 320 nanômetros por cinco minutos para fotopolammerizar o LÍQUIDO NOA em uma fina película de polímero. Uma vez feito, retire suavemente o modelo PDMS do deslizamento da tampa com o NOA recém-polimerizado.

Trate o filme NOA usando um limpador de plasma de ar por cinco minutos para tornar a superfície hidrofílica. Prepare uma solução de pequenas vesículas unilamellares, ou SUVs, conforme descrito no manuscrito, e obtenha os SUVs reutilizando um filme lipídico seco no tampão de observação sob a sônica em um sonicator de banho por cinco a 10 minutos até que a solução seja transparente. Mais tarde, insira os deslizes de cobertura que suportam os padrões NOA dentro dos poços das caixas de cultura celular e incubar os padrões NOA recém-lançados com 100 microlitres de uma solução de SUV miligrama por mililitro por 30 minutos à temperatura ambiente para gerar uma bicamada lipídica suportada.

Para remover o SUV não afusado, enxágue as laterais completamente seis vezes com o tampão de sal baixo septin sem deixar a amostra completamente seca entre duas lavagens. Diluir a solução de estoque de septina octomérica em um tampão de sal baixo septin para concentrações finais, variando de 10 a 100 nanomolares e volumes de um mililitro. Em seguida, incubar a solução de proteína nos slides por uma hora em temperatura ambiente.

Lave os slides NOA contendo bicamadas lipídicas apoiadas fundidas e incubar proteína com tampão de sal baixo septin. Substitua o tampão de sal baixo septina por uma solução fixativa de 2%glutaraldeído em 0,1 tampão de cacodilato de sódio molar, prewarmed a 37 graus Celsius, e deixe a reação prosseguir por 15 minutos, e lave a amostra fixa três vezes, cinco minutos cada com 0,1 cacodilato de sódio molar. Após a lavagem, incubar a amostra na solução fixativa do tetroxida de ósmio, depois o ácido tânnico filtrado e, finalmente, o acetato de urântiz filtrado por 10 minutos cada.

Lave a amostra três vezes em água destilada após cada solução. Incubar a amostra em série em soluções de etanol a partir de 50% a 100% por dois a três minutos cada. Transfira as lâminas de vidro dentro do secador de ponto crítico pré-preenchido com etanol e siga as instruções do fabricante para a secagem.

Como as amostras secas são altamente hidroscópicas, cubra-as imediatamente anexando o deslizamento da tampa aos stubs. Em seguida, adicione uma tira de tinta prateada na face superior da tampa sem criar desglomerados de tinta. Certifique-se de que a conexão com o stub é satisfatória.

Quando a amostra evaporar completamente, use um aparelho equipado com uma cabeça de magnetron de plasma e um estágio planetário rotativo, e siga os protocolos padrão fornecidos pelo fabricante. Realize o pré-sputtering a 120 miliamperes por 60 segundos para remover a camada de óxido na superfície. Em seguida, deposite 1,5 nanômetros de tungstênio com um monitor de espessura de filme a 90 miliamperes e uma distância de trabalho de 50 mililitros.

Posteriormente, armazene as amostras sob um vácuo para protegê-las do ar ambiente até e ao longo das análises sem. Para obter imagens de alta solução detectando os elétrons secundários com o detector interior, defina a tensão acelerada para três quilovolts e a corrente do feixe até 20 micrômetros de abertura. Para observações, use resoluções que variam de 21,25 nanômetros por pixel a 1.224 nanômetros por pixel.

Use uma resolução de 5,58 nanômetros por pixel para análise de dados. Defina a distância de trabalho entre um a dois milímetros para observação de alta resolução e cerca de três milímetros se for necessária uma profundidade de campo aumentada. Ajuste a velocidade de varredura e a integração da linha continuamente para garantir uma relação sinal constante para ruído com um tempo de aquisição de cerca de 30 a 45 segundos por imagem.

A análise representativa ilustra o efeito do material depositado nos filamentos de septina em padrões PDMS ondulados com 1,5 nanômetros de platina e 1,5 nanômetros de tungstênio. Observou-se que vesículas unilamellar gigantes nuas, ou GUVs, eram perfeitamente esféricas. Após a deformação induzida por septina, as vesículas apareceram facetadas e as deformações permaneceram estáticas e, portanto, não flutuaram.

Em maiores concentrações dos septinos, foram observadas deformações periódicas nas vesículas. A auto-montagem dos filamentos de septina ligados a grandes vesículas unilamellar, ou LUVs, foi examinada com uma imagem de microscopia crio-elétron e a reconstrução 3D foi obtida a partir de uma série inclinada. O arranjo dependente da curvatura dos filamentos de septina foi visualizado pela microscopia eletrônica de varredura.

Na baixa ampliação, visível um padrão ondulado com periodicidade de curvaturas negativas e positivas. A organização ultraestrusa dos filamentos de septina foi vista em maior ampliação. O NOA tem que ser gentilmente descascado para evitar a degradação.

Após a imagem, algumas análises de imagem podem ser realizadas para quantificar as características de ultraestru estrutura visualizadas pelo SCM, como espaçamento de filamentos e orientação do filamento. O presente método tem sido aplicado aos septinos, mas também pode ser usado para outras proteínas citoesqueletal ou proteínas que se organizem tanto tempo de filamentos quanto os filamentos longos e, portanto, sensíveis à curvatura.