Microfresagem de Controle Numérico Computacional de um Dispositivo Acrílico Microfluídico com uma Restrição Escalonada para Imunoensaios Magnéticos Baseados em Nanoppartículas

Nosso protocolo descreve um método de microfresagem de alta resolução para fabricar um dispositivo microfluídico acrílico para imunodetecção quantitativa de concentrações de analitos comparáveis à técnica ELISA padrão-ouro. O destaque é a fabricação de um dispositivo microfluídico termoplástico simples e de baixo custo, sem sala limpa, o que permite tempos de ensaio mais curtos e bons limites de detecção de forma quantitativa. Comece pela moagem da superfície.

Corte retângulos de 9 x 25 milímetros de PMMA de 1,3 milímetro de espessura com o bit final do moinho de 800 micrômetros. Anexe um desses retângulos cuidadosamente com fita adesiva de dupla face à plataforma piezoelétrica. Conecte e coloque o sensor Z na superfície do retângulo PMMA.

Selecione o pino de detecção e mova-o sobre a superfície do sensor. Abaixe o pino manualmente sem entrar em contato com o sensor. Ative o modo de detecção Z-zero.

Gire o bit final do moinho de 200 micrômetros a 14, 500 rpm. Abaixe lentamente até a coordenada de origem no eixo z. Em seguida, redefina o eixo z 30 micrômetros abaixo da origem.

Defina essa coordenada como a nova origem Z. Clique no botão Cortar no software da máquina de microfresagem para ativar o painel de corte. Clique no botão Adicionar e selecione o arquivo TXT com um código previamente criado para a moagem da superfície acrílica.

Clique no botão Saída para iniciar o processo. Para fresamento da restrição de cinco micrômetros, primeiro, defina a velocidade de rotação do bit do moinho final para 11.000 rpm. Em seguida, eleve a plataforma em 6,5 micrômetros com a interface da plataforma piezoelétrica.

Mova o bit do moinho final ao longo do eixo y em 500 micrômetros. Retorne a plataforma piezoelétrica ao seu valor inicial no eixo z com a interface de controle. Em seguida, execute a fresagem de microcanais abrindo o arquivo de projeto criado anteriormente a partir do software de design.

Clique no botão Imprimir, acesse o menu de propriedades e clique na janela de cores correspondente à camada que contém o desenho a ser usinado. Defina os parâmetros de fabricação no painel de ferramentas. Para fresamento de furos, mude para o bit final do moinho de 800 micrômetros.

Ative a camada de design dos orifícios de 1,2 milímetro de diâmetro clicando na janela de cores correspondente e selecionando os parâmetros de fabricação correspondentes. Máquina dois furos adicionais em cantos contralaterais do retângulo para o alinhamento do acrílico de forma invertida em uma nova plataforma. Vire o acrílico e cole-o com fita adesiva de dupla face sobre o adaptador com os pilares usinados.

Abra o arquivo com o design dos orifícios para a face oposta do software de design. Moer a metade restante dos orifícios de entrada e saída do reagente com um diâmetro de 1,5 milímetros e uma profundidade de 0,7 milímetros. Limpe ambas as folhas de retângulo acrílico com álcool isopropílico e enxágue com água destilada.

Mergulhe o acrílico em um banho ultra-sônico por 10 minutos. Seque ambas as folhas de acrílico e cole-as no interior de uma tampa de placa de Petri de vidro com fita adesiva de dupla face. Em seguida, coloque a base da placa de Petri de vidro dentro de uma placa de Petri de vidro maior.

Despeje um mililitro de clorofórmio na base da placa de Petri e coloque rapidamente a tampa com as folhas de acrílico. Adicione imediatamente água destilada à base da placa de Petri maior até o nível da tampa da placa de Petri. Permitir a exposição do acrílico ao gás clorofórmio por um minuto.

Em seguida, incline a placa de Petri para quebrar o selo de água e descubra imediatamente a placa de Petri. Para a colagem, alinhe ambos os acrílicos com o clorofórmio exposto lado a lado e forme um sanduíche. Coloque os acrílicos na prensa por dois intervalos de dois minutos, alterando o alinhamento do acrílico.

Em seguida, prenda dois a três centímetros de mangueira a cada um dos orifícios do dispositivo com adesivo líquido de secagem instantânea. Encha os canais com água destilada usando uma seringa. Mergulhe o dispositivo em um banho ultra-sônico por 10 minutos.

Em seguida, esvazie a água dentro dos canais do dispositivo e use uma seringa para introduzir a solução de BSA a 5%. Preparar uma suspensão de micropartículas de ferro de diâmetro a 7,5 micrômetros em BSA a 5%. Incubar o chip e a suspensão de micropartículas com a solução de bloqueio durante, pelo menos, uma hora à temperatura ambiente.

Em seguida, insira as micropartículas no chip com uma agulha de seringa através da mangueira de saída do canal lateral. Coloque o chip verticalmente e, em seguida, gire o chip em duas etapas de 90 graus, de modo que as micropartículas sejam direcionadas e compactadas na restrição de cinco micrômetros. Sele todas as mangueiras do dispositivo acrílico com calor.

Corte a mangueira de entrada até que restem apenas alguns milímetros. Encha a agulha de dosagem com tampão de lavagem e insira-a na mangueira cortada. Deixe a solução pingar e, em seguida, conecte a agulha ao dispositivo.

Corte a mangueira de saída do canal lateral e, em seguida, ligue à bomba da seringa. Em seguida, repita o mesmo procedimento para a mangueira de saída do canal principal. Em seguida, conecte o chip ao ímã.

Para imunodetecção, mantenha o tampão de lavagem fluindo por 10 minutos a 50 microlitros por hora. Remova o tampão de lavagem restante da agulha de dosagem com uma micropipeta e adicione 50 microlitros da suspensão de nanopartículas. Fluidar a suspensão de nanopartículas durante sete minutos a um caudal de 100 microlitros por hora.

Em seguida, altere a taxa de fluxo para 50 microlitros por hora e continue o fluxo por mais 15 minutos. Troque a agulha de dosagem e flua o tampão de lavagem por 10 minutos na mesma taxa. Remova o tampão de lavagem restante da agulha de dosagem com uma micropipeta e adicione 100 microlitros do substrato fluorogênico.

Ajuste a taxa de fluxo e os parâmetros de tempo para entrada de substrato, medição de fluorescência e etapa de lavagem. Ativar o fluxo de entrada do substrato fluorogênico por seis minutos a 50 microlitros por hora. 15 segundos antes de o fluxo do substrato parar, ligue a fluorescência do microscópio.

Inicie a captura de imagem com o software da câmera do microscópio 10 segundos antes de o substrato parar com um tempo de exposição de 1.000 milissegundos. Clique no botão Iniciar do parâmetro de vazão desejado imediatamente após a parada da lavagem do substrato. Realize imagens por seis minutos a um quadro por segundo.

Clique no botão Iniciar do fluxo de lavagem imediatamente após a parada do fluxo de medição selecionado. Nanopartículas conjugadas de lisozima e anticorpo secundário conjugado de rabanete de rábano foram utilizados para o imunoensaio. Um aumento na intensidade de fluorescência para diferentes concentrações de anticorpos primários foi observado comparando regiões antes e após a armadilha, mostrando que a mudança na fluorescência do substrato é diretamente proporcional à concentração de anticorpo primário.

Para uma dada concentração de anticorpo primário, a intensidade de fluorescência foi plotada em função do tempo em diferentes taxas de fluxo do substrato fluorogênico. A capacidade de conversão do substrato pela enzima HRP foi inversamente proporcional à vazão, obtendo-se uma intensidade máxima para uma vazão de um microlitro por hora. Para as diferentes taxas de fluxo para várias concentrações de anticorpos primários, as curvas das diferenças de fluorescência após e antes da imunorreação mostraram que, para uma concentração de 1.000 nanogramas por mililitro, a fluorescência satura para todas as taxas de fluxo avaliadas.

Uma curva de calibração foi elaborada utilizando o valor máximo das diferenças na intensidade de fluorescência obtidas em relação à concentração de anticorpos primários para cada vazão. A alta variabilidade e os altos níveis de fluorescência a um microlitro por hora sugeriram que a taxa não favorece o fluxo do substrato reagente e tende a se acumular logo após a armadilha. Atenção especial deve ser dada às etapas de vedação dos microcanais, uma vez que a exposição ao clorofórmio é muito sensível à temperatura.

Para resultados reprodutíveis, a temperatura deve ser sempre a mesma. Nosso sistema ajuda a entender onde a compacidade e o tamanho das micropartículas, o tamanho das nanopartículas, os antígenos, o anticorpo de detecção e o substrato são fatores determinantes para o limite da detecção no imunoensaio microfluídico à base de nanopartículas.