Name: Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a caracterizar propriedades mecânicas de paredes celulares primárias em órgãos de plantas vivas usando microscopia de força atômica. Este método permite analisar amostras não fixadas e não desidratadas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Dmitry Suslov (Universidade Estatal de São Petersburgo, São Petersburgo, Rússia) e à Prof. Mira Ponomareva (Instituto de Pesquisa Científica Tártara de Agricultura, FRC KazSC RAS, Kazan, Rússia) pelo fornecimento de sementes de milho e centeio, respectivamente. O método apresentado foi desenvolvido no âmbito do Projeto da Fundação Científica Russa No. 18-14-00168 concedido à LK. A parte do trabalho (obtenção dos resultados apresentados) foi realizada pela AP com o apoio financeiro da atribuição do governo para o Centro Científico FRC Kazan da RAS.

1. Preparação da amostra para medições de AFM
<ol><li>Material vegetal: Esterilizar as sementes de milho (Zea mays L.) e centeio (Secale cereale L.) com uma solução de NaOCl a 0,35% por 10 min, lavar 3x com água destilada e, em seguida, crescer hidroponicamente no escuro a 27 °C por 4 dias e 2 dias, respectivamente. Raízes primárias foram utilizadas para o experimento.</li>
	<li>Preparação de soluções e amostras para seccionamento de vibratomos<ol><li>Preparar a solução de agarose para incorporação de raízes dissolvendo 3% (p/p) de agarose de baixo ponto de fusão em água usando um forno de micro-ondas. NOTA: Todos os experimentos foram realizados em água. Se o tampão ou qualquer outro tipo de meio for necessário para o estudo, é melhor usar o mesmo meio para a preparação de agarose, durante a secção, e na célula líquida do AFM para evitar danificar a amostra.</li>
		<li>Despeje uma camada de 4 mm de agarose derretida a 3% no fundo da placa de Petri (diâmetro = 35 mm) e deixe esfriar um pouco para evitar danos térmicos à amostra.</li>
		<li>Coloque três ou quatro pequenos pedaços (cerca de 5 mm de comprimento) do órgão vegetal estudado horizontalmente sobre a agarose. NOTA: As amostras devem estar semi-imersas, mas não submersas na camada de agarose. Se a amostra não estiver imersa, ela pode sair da agarose durante a seção do vibratome. Se a amostra afundar para o fundo, ela estará muito perto da borda da seção e se tornará inconveniente para outras etapas.</li>
		<li>Quando um filme fino e semissólido aparecer no topo da primeira camada de agarose (30-60 s), despeje cuidadosamente uma segunda camada no topo. NOTA: A camada inferior de agarose não deve solidificar completamente. Caso contrário, as duas camadas podem se separar uma da outra durante o trabalho posterior.</li>
		<li>Depois que a agarose estiver completamente solidificada, corte o bloco que contém o espécime. Molde o bloco em uma pirâmide truncada hexagonal para garantir sua estabilidade durante o seccionamento adicional (Figura 1A). NOTA: A amostra pode ser orientada vertical ou horizontalmente dentro deste bloco, dependendo do tipo de seção necessária. Ao preparar o bloco, deixe 2-3 mm de agarose ao redor do espécime. Neste caso, a seção da amostra será retida pela camada de acarose a 3%, o que facilitará sua posterior imobilização (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Seccionando a amostra com o vibratome<ol><li>Cole o bloco no estágio vibratório com adesivo de cianoacrilato. Coloque o palco no vibratome de modo que um dos cantos da pirâmide fique voltado para a lâmina do vibratome. Despeje água no banho de vibratome.</li>
		<li>Defina os parâmetros de seccionamento (espessura da seção, velocidade da lâmina e frequência de vibração) e corte a amostra. NOTA: Use as espessuras de seção entre 200 e 400 μm. Uma seção que é muito fina pode introduzir erros na avaliação de propriedades mecânicas, enquanto uma seção que é muito grossa é propensa a quebra. Uma velocidade de lâmina de 1,3 mm·s-1 e uma frequência de oscilação de 90 Hz foram utilizadas para as raízes de centeio e milho.</li>
		<li>Usando uma escova fina, mova a seção do banho de água para uma lâmina de vidro e coloque uma gota de água na seção para evitar que ela seque. Verifique a qualidade da seção sob um microscópio de luz. NOTA: Seções oblíquas não podem ser usadas para medir o módulo de elasticidade. As paredes celulares devem ser perpendiculares ao plano de secção, caso contrário podem dobrar-se ou dobrar-se sob a ponta AFM.</li>
	</ol></li>
	<li>Imobilização da secção para medições de AFM (Figura 1B)<ol><li>Despeje uma camada de agarose derretida a 1% (p/p) (~1 mL) no fundo da tampa da placa de Petri usando uma pipeta. NOTA: Certifique-se de que os lados da tampa da placa de Petri não impeçam que a ponta se aproxime da amostra. A camada de agarose deve ter 1 mm de espessura e deve cobrir todo o fundo da tampa.</li>
		<li>Depois que a agarose de 1% tiver se solidificado, remova o excesso de água da seção, trazendo o papel de filtro para sua borda. NOTA: Não toque na secção da planta com o papel para evitar danos e secagem completa da amostra.</li>
		<li>Transfira cuidadosamente a seção do slide para o centro da tampa da placa de Petri usando um pincel. Usando uma pipeta de 20 μL, adicione cuidadosamente 1% de agarose ao redor da seção (Figura 1B). NOTA: A agarose a 1% não deve entrar no espécime em si. Deve cobrir apenas as bordas da camada de agarose a 3% que retém o espécime da planta. A agarose a 1% deve formar pequenos nós nas bordas desta camada de agarose a 3%. Grandes nós podem impedir que o cantilever se aproxime da amostra.</li>
		<li>Deitar a água ou outra solução a utilizar para o AFM na tampa da placa de Petri com a secção imobilizada.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação e calibração do AFM
NOTA: O método força-volume do AFM gera uma matriz espacialmente resolvida de curvas força-distância obtidas em cada ponto da área estudada. Obtenha todos os parâmetros para o modo força-volume (rigidez cantilever, IOS, etc.) no modo de contato. Procedimentos semelhantes para instrumentos de outros fabricantes foram descritos anteriormente10,20.
<ol><li>Selecione o tipo apropriado de balanço. NOTA: A rigidez do cantilever deve ser comparável à rigidez do provete21. Um cantilever que é muito mais rígido do que o espécime não desviará muito, enquanto um cantilever que é muito macio não deformará a amostra o suficiente. Uma frequência de ressonância típica deve ser suficiente para balançar o cantilever no líquido (ou seja, ser pelo menos algumas dezenas de kHz). A área de contato deve ser pequena em comparação com o tamanho da parede celular, uma vez que a amostra em estudo nos cálculos do módulo de Young é assumida como um meio-espaço infinito. Os seguintes balanços foram utilizados para as raízes de centeio e milho: balanços afiados com uma frequência de ressonância típica de 60 kHz, uma constante de mola média de 1,5 N·m-1 e um raio de ápice de 10 nm, ou balanços esféricos com uma frequência de ressonância típica de 75 kHz, uma constante de mola média de 2,8 N·m-1, e um raio de ápice de 150 nm.</li>
	<li>Ligue o dispositivo AFM e o software associado (Tabela de Materiais). Monte o cantilever no suporte da ponta para a célula líquida. Coloque uma gota de líquido na ponta para evitar a formação de bolhas de ar na ponta enquanto a mergulha no líquido. NOTA: Em caso de formação de bolhas, o líquido pode ser removido com uma limpeza de precisão e, em seguida, uma nova gota pode ser colocada.</li>
	<li>Monte o suporte da ponta na cabeça de digitalização.</li>
	<li>Coloque uma amostra dura (lâmina de vidro fresco) em uma tampa de placa de Petri. Despeje o líquido nele, garantindo que ele cubra o slide. Coloque a cabeça de varredura no palco e levante a amostra de modo que o líquido cubra o balanço.</li>
	<li>Escolha a guia Cabeças no menu suspenso Ferramentas . Certifique-se de que a cabeça de digitalização da célula líquida está selecionada.</li>
	<li>Clique no botão Apontando para abrir a janela Mira a Laser . Clique no botão Câmera para abrir a janela Microscópio Óptico . Posicione o laser na ponta do balanço, usando os parafusos na cabeça AFM e a janela do Microscópio Óptico para orientação.</li>
	<li>Escolha o modo Semicontato no menu suspenso na janela principal do programa.</li>
	<li>Abra a guia Ressonância e escolha o tipo de cantilever que está sendo usado no menu Sondas . Clique no botão Auto para determinar a frequência de ressonância. NOTA: Se o cantilever que está sendo usado não estiver listado, abra Ferramentas > Probe Passport. Crie um novo arquivo, insira os parâmetros do cantilever e salve-o. Em seguida, escolha-o no menu suspenso Sondas .</li>
	<li>Escolha o modo Contato no menu suspenso na janela principal do programa.</li>
	<li>Clique no botão N_Force Cal para abrir a janela de calibração do cantilever. Escolha o cantilever que está sendo usado e clique no botão Varrer e , em seguida, no botão Spect Meas para determinar a constante de mola do cantilever usando o procedimento de sintonia térmica. Feche a janela.</li>
	<li>Defina o SetPoint como 1 nA. Abra a guia Aproximação e clique no botão Pouso para se aproximar da amostra.</li>
	<li>Abra a guia Digitalização . Defina a taxa de varredura para 0,5 Hz. Clique no botão Área e defina o tamanho da varredura para 10 μm x 10 μm e o ponto de varredura para 256 x 256. Clique no botão Executar e digitalize cerca de 20 linhas para verificar se não há contaminação no vidro. Clique no botão Parar para encerrar a verificação sem perder dados.</li>
	<li>Abra a guia Curvas . Defina parâmetros para retração e aproximação a 500 nm e -100 nm, respectivamente.</li>
	<li>Escolha a última varredura no menu suspenso Selecionar quadro para observar a superfície.</li>
	<li>Encontre uma área limpa no vidro e indique o ponto onde a curva força-deformação deve ser tomada, e clique no botão Executar para obter a curva. Registre de três a cinco curvas de força em locais diferentes na varredura.</li>
	<li>Clique no botão Dados para abrir a janela de análise e selecione o quadro com a curva força-deformação.</li>
	<li>Clique no botão Emparelhar Marcadores e indique a parte linear da curva de retração para calcular a razão entre o sinal DFL e o deslocamento, que é a Sensibilidade Óptica Inversa (IOS, nA nm-1) ou sensibilidade de deflexão.</li>
	<li>Repita a etapa 2.17 para todas as curvas registradas e anote todos os valores calculados da relação sinal/deslocamento DFL. Devem ser os mesmos.</li>
	<li>Feche a janela de análise, clique na guia Abordagem e, em seguida, no botão Remover para retirar a sonda da amostra.</li>
</ol>3. Aquisição de dados
<ol><li>Guie a amostra sob o cantilever AFM usando o microscópio óptico. Clique na guia Aproximação e, em seguida, no botão Pouso para abordar a amostra no modo de contato com um SetPoint de 1 nA.</li>
	<li>Clique na guia Varredura e, em seguida, no botão Área . Selecione o Tamanho da área de 70 μm x 70 μm para digitalizar.</li>
	<li>Clique no botão Mover sonda e verifique toda a área de digitalização movendo o scanner sobre ela. Com base no grau de protrusão do scanner, encontre o ponto mais alto.</li>
	<li>Abra a guia Abordagem e clique no botão Remover para se retirar da amostra. Usando o ponto mais alto como alvo, clique no botão Aterrissagem para se aproximar da amostra novamente. Em seguida, verifique a superfície novamente clicando no botão Mover sonda e movendo o scanner sobre ela. Nenhum dos pontos na área deve exigir que o scanner seja totalmente levantado. NOTA: Idealmente, a faixa z do scanner deve exceder a diferença de altura da amostra. No entanto, é aceitável se alguns pontos na área de digitalização estiverem abaixo da capacidade do scanner. Ao mesmo tempo, não deve haver muitos desses pontos. Grandes áreas que não podem ser alcançadas pelo scanner podem causar o aborto de varredura.</li>
	<li>Defina a taxa de varredura para 0,5 Hz. Defina o tamanho da varredura para 70 μm x 70 μm e o ponto de varredura para 64 x 64. Clique no botão Executar e digitalize para verificar a superfície da amostra e sua possível contaminação com agarose. NOTA: Se a amostra tiver células com um grande lúmen, o tamanho da área de varredura pode ser reduzido ou deve ser movido para que haja mais paredes celulares na varredura.</li>
	<li>Clique no botão Ativado na parte superior da janela principal para desligar o loop de feedback.</li>
	<li>Escolha o modo HDPlus (método força-volume) no menu suspenso na janela principal do programa. Uma janela adicional (janela HD) aparecerá.</li>
	<li>Defina o SetPoint como 0.1 nA na janela principal do programa.</li>
	<li>Na aba Principal da janela HD, defina os parâmetros de varredura (amplitude e frequência de movimento do cantilever sinusoidal) apropriados para a amostra estudada. NOTA: Cada tipo de amostra e cantilever requer a seleção de parâmetros de digitalização. Alguns experimentos preliminares são necessários. Para as raízes de milho ou centeio, foram utilizados balanços afiados e esféricos a uma amplitude de 400 nm e uma frequência de 300 Hz.</li>
	<li>Abra a guia Ruídos na janela HD e insira a frequência de ressonância do balanço.</li>
	<li>Abra a guia Quant da janela HD e insira o IOS, a rigidez do cantilever e o raio e o ângulo da ponta. Selecione o modelo de contato que será usado para cálculos dependendo da geometria da ponta. NOTA: O modelo DMT leva em consideração a força de adesão existente entre a sonda e a amostra, sendo mais comumente utilizado em mecanobiologia21.</li>
	<li>Abra a guia Digitalização da janela HD e selecione os sinais a serem gravados. Selecione a direção em que o sinal é gravado. Marque a caixa Forçar volume para obter um registro de todas as curvas de força. NOTA: Registre o sinal do módulo de elasticidade nas direções para frente e para trás. Ele fornecerá mais pontos para calcular.</li>
	<li>Clique no botão Off na parte superior da janela principal do programa para ativar o loop de feedback.</li>
	<li>Clique no botão PhaseCorr na janela HD principal para corrigir a sensibilidade do sistema óptico.</li>
	<li>A aba vs Time da janela HD principal apresenta a função do sinal DFL vs. tempo em tempo real; selecione as partes dessa função que serão usadas para a determinação do nível de linha de base e para ajustar o modelo de contato para cálculos adicionais.</li>
	<li>Defina o valor do ponto de verificação para 256 x 256 na janela principal do programa. Defina a taxa de varredura para 0,2 Hz e clique no botão Executar para digitalizar a amostra.</li>
	<li>Depois que a digitalização parar, clique no botão Ativado na parte superior da janela principal para desligar o loop de feedback.</li>
	<li>Escolha o modo Contato no menu suspenso, abra a guia Abordagem e clique no botão Remover para se retirar da amostra.</li>
	<li>Clique no botão Dados para abrir o software de análise e salvar a saída.</li>
	<li>No final do dia de medição, remova o suporte da ponta do cantilever da cabeça e lave-o cuidadosamente com água ultrapura várias vezes. Cada vez, remova a água com uma limpeza de precisão.</li>
</ol>4. Avaliação e pós-processamento dos dados
Observação : não confie em valores de módulo elástico calculados automaticamente. Como a superfície varia muito em altura, muitas curvas de artefatos devem ser expelidas.
<ol><li>Abra o arquivo salvo no software de análise.</li>
	<li>Selecione o quadro HDForceVolume .</li>
	<li>Mantenha pressionada a tecla Ctrl e selecione um quadro visual obtido na mesma direção da digitalização. Clique no botão Carregar Mapa Externo para ver onde as paredes celulares estão localizadas. NOTA: Qualquer mapa de sinal pode ser usado como um quadro visual, mas usar o mapa de sinal DFL (diferentes instrumentos podem se referir a ele como um sinal de deflexão ou sinal de erro) pode ser a maneira mais fácil.</li>
	<li>Verifique os valores de Rigidez InvOptSens (IOS) e cantilever na guia Principal .</li>
	<li>Abra a guia Adicional e verifique os parâmetros de dica e o modelo de contato.</li>
	<li>Clique em vários pontos nas paredes celulares do quadro visual e selecione apenas as curvas que são bem descritas pelo modelo. Consulte Resultados do Representante para obter detalhes.</li>
	<li>Anote os valores obtidos.</li>
</ol>

<ol><li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813(2013).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li>
<li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161(2018).</li>
<li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li>
<li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li>
<li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9%2C+IRX9L%2C+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83(2013).</li>
<li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li>
<li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li>
<li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls%3A+at+tissue%2C+cellular%2C+and+subcellular+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317(2014).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li>
<li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li>
<li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li>
<li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li>
<li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+%28Helianthus+annuus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li>
<li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls%3A+implications+for+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li>
<li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope%3A+methods%2C+theory+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li>
<li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plants-Basel%22%5BJournal%5D)">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172(2019).</li>
<li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674(2019).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Physics%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li>
<li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Note%3A+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. O método baseado em AFM aqui apresentado complementa as técnicas existentes que são usadas para estudar as propriedades das paredes celulares das plantas. Permite que a elasticidade das paredes celulares, que pertencem aos tecidos internos da planta, seja investigada. Utilizando o método apresentado, as propriedades mecânicas das paredes celulares ...

As propriedades mecânicas da parede celular da planta determinam a forma da célula e sua capacidade de crescer. Por exemplo, a ponta de crescimento do tubo de pólen é mais macia do que as partes não crescentes do mesmo tubo1. A formação de primórdios no meristema Arabidopsis é precedida por uma diminuição local da rigidez da parede celular no local do futuro primordium 2,3. As paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que são paralelas ao eixo principal de crescimento e crescem mais rapidamente, são mais macias do que aquelas que são perpendiculares a este eixo e crescem mais lentamente 4,5. Na raiz do milho, a transição das células da divisão para o alongamento foi acompanhada por uma diminuição dos módulos elásticos em todos os tecidos da raiz. Os módulos permaneceram baixos na zona de alongamento e aumentaram na zona de alongamento tardio6.
Apesar da disponibilidade de vários métodos, as grandes matrizes de informações bioquímicas e genéticas sobre a biologia da parede celular obtidas anualmente raramente são comparadas com as propriedades mecânicas das paredes celulares. Por exemplo, mutantes em genes relacionados à parede celular frequentemente têm crescimento e desenvolvimento alterados 4,7,8, mas raramente são descritos em termos de biomecânica. Uma das razões para isso é a dificuldade de realizar medições nos níveis celular e subcelular. A microscopia de força atômica (AFM) é atualmente a principal abordagem para tais análises9.
Nos últimos anos, numerosos estudos baseados em AFM sobre biomecânica da parede celular vegetal foram realizados. As propriedades mecânicas das paredes celulares dos tecidos externos de Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 e cebola 12, bem como de células cultivadas 13,14,15, têm sido investigadas. No entanto, as células superficiais de uma planta podem ter paredes celulares cujas propriedades mecânicas diferem das dos tecidos internos6. Além disso, as células vegetais são pressurizadas por turgor, o que as torna mais rígidas. Para se livrar da influência da pressão de turgor, os pesquisadores têm que utilizar soluções plasmolizantes 2,3,4,5,10,11 ou decompor os valores obtidos em aportes de turgor e parede celular 12. A primeira abordagem leva à desidratação da amostra e altera a espessura e as propriedades da parede celular16, enquanto a segunda abordagem requer medidas adicionais e matemática complicada, e se aplica apenas a células de forma relativamente simples12. As propriedades da parede celular dos tecidos internos podem ser avaliadas em criosecções17 ou seções de material vegetal impregnado com resina8. No entanto, ambos os métodos envolvem desidratação e / ou impregnação de amostras, o que inevitavelmente leva a mudanças nas propriedades. As propriedades de células isoladas ou cultivadas são difíceis de relacionar com a fisiologia de toda a planta. Tanto o cultivo quanto o isolamento de células vegetais podem afetar as propriedades mecânicas de suas paredes celulares.
O método aqui apresentado complementa as abordagens supracitadas. Usando ele, as paredes celulares primárias de qualquer tecido e em qualquer estágio do desenvolvimento da planta podem ser examinadas. As observações de seccionamento e AFM foram realizadas em líquido, o que evita a desidratação da amostra. O problema do turgor foi resolvido à medida que as células são cortadas. O protocolo descreve o trabalho com raízes de milho e centeio, mas qualquer outra amostra pode ser examinada se for adequada para o corte de vibratome.
Os estudos de AFM aqui descritos foram realizados utilizando-se a técnica força-volume. Diferentes instrumentos usam nomes diferentes para este método. No entanto, o princípio básico é o mesmo; um mapa força-volume da amostra é obtido por um movimento sinusoidal ou triangular do cantilever (ou amostra) para atingir uma certa força de carga em cada ponto analisado, enquanto se registra a deflexão do cantilever18. O resultado combina uma imagem topográfica da superfície e a matriz de curvas força-distância. Cada curva é usada para calcular a deformação, rigidez, módulo de Young, adesão e dissipação de energia em um ponto específico. Dados semelhantes podem ser obtidos por espectroscopia de força ponto a ponto após a varredura no modode contato 19, embora seja mais demorado.

<table><tbody><tr><td>Agarose, baixo ponto de fusão</td><td>Helicon</td><td>B-5000-0.1</td><td>para fixação de amostras</td></tr><tr><td>Escova</td> <td>-</td><td></td> <td>para seção móvel</td></tr><tr><td>Cantilevers</td><td>NanoTools, Alemanha</td><td>NT_B150_v0020-5</td><td>Modelo: Biosphere B150-FM</td></tr><tr><td>Cantilevers</td><td>NT-MDT, Rússia</td><td>FMG01 / 50</td><td>Modelo: FMG01</td></tr><tr><td>Adesivo de cianoacrilato</td> <td>-</td><td></td> <td>para vibratomia</td></tr><tr><td>Corrediças de vidro</td><td>Heinz Herenz</td><td>1042000</td><td>para vibratomia e calibração AFM</td></tr><tr><td>Software ImageAnalysis P9</td><td>NT-MDT,</td> <td>Rússia-para</td> <td>análise de dados</td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência Leica DM1000</td><td>Leica Biosystems, Alemanha</td><td>11591301</td><td>para verificação de seção</td></tr><tr><td>NaOCl</td><td>-</td><td>-</td><td>para esterilização de sementes</td></tr><tr><td>Software Nova PX 3.4.1</td><td>NT-MDT,</td> <td>Rússia-para</td> <td>experimentos conduzindo</td></tr><tr><td>microscópio NTEGRA Prima com controlador HD</td><td>NT-MDT,</td> <td>Rússia-para</td> <td>AFM e aquisição de dados</td></tr><tr><td>Placa de Petri 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>para fixação de amostras</td></tr><tr><td>Pipeta de ponta 1000 &micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Pipeta de</td> <td>4642092-Ponta</td></tr> <tr><td>2-20 &micro; L</td> Água <td>4642062-Ultrapure</td> <td>da Thermo Fisher</td><td></td></tr> <tr><td>Scientific</td><td>-</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Leica VT 1000S</td><td>Leica Biosystems, Alemanha</td><td>1404723512</td><td>para o seccionamento da amostra</td></tr></tbody></table>

caracterizando as propriedades mecânicas da parede celular primária em Órgãos de plantas vivas usando microscopia de força atômica

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. Muitas técnicas sofisticadas foram desenvolvidas para medir essas propriedades; no entanto, a microscopia de força atômica (AFM) continua sendo a mais conveniente para estudar a elasticidade da parede celular no nível celular. Uma das limitações mais importantes desta técnica tem sido que apenas células vivas superficiais ou isoladas podem ser estudadas. Aqui, o uso da microscopia de força atômica para investigar as propriedades mecânicas das paredes celulares primárias pertencentes aos tecidos internos de um corpo vegetal é apresentado. Este protocolo descreve medidas do módulo aparente de Young de paredes celulares em raízes, mas o método também pode ser aplicado a outros órgãos vegetais. As medições são realizadas em seções de material vegetal derivadas de vibratomo em uma célula líquida, o que permite (i) evitar o uso de soluções plasmolizantes ou impregnação de amostras com cera ou resina, (ii) tornar os experimentos rápidos e (iii) prevenir a desidratação da amostra. Ambas as paredes celulares anticlinais e periclinais podem ser estudadas, dependendo de como a amostra foi seccionada. Diferenças nas propriedades mecânicas de diferentes tecidos podem ser investigadas em uma única seção. O protocolo descreve os princípios de planejamento do estudo, questões com a preparação e medidas do espécime, bem como o método de seleção de curvas de força-deformação para evitar a influência da topografia nos valores obtidos do módulo elástico. O método não é limitado pelo tamanho da amostra, mas é sensível ao tamanho da célula (ou seja, células com um grande lúmen são difíceis de examinar).

Os mapas típicos de módulo elástico e DFL, bem como as curvas de força obtidas em raízes de centeio e milho pelo método descrito, são apresentados na Figura 2. A Figura 2A mostra o módulo elástico e os mapas DFL obtidos na seção transversal da raiz primária do centeio. As áreas brancas no mapa do módulo (Figura 2A, à esquerda) correspondem a uma superestimação errônea do módulo de Young devido ao scanner atingir seu limite na direçã...

Estudos da biomecânica da parede celular são essenciais para a compreensão do crescimento e morfogênese das plantas. O protocolo a seguir é proposto para investigar paredes celulares primárias finas nos tecidos internos de órgãos de plantas jovens usando microscopia de força atômica.

Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

O crescimento celular das plantas é controlado pelas propriedades mecânicas de suas paredes celulares. Portanto, é importante conhecer essas propriedades em diferentes órgãos e tecidos das plantas. O método aqui apresentado permite a caracterização biomecânica de paredes celulares não fixas e não desidratadas nos tecidos internos de plantas jovens.Comece com a preparação das soluções e da amostra para o seccionamento do vibratome. Despeje uma camada de quatro milímetros de 3% de agarose derretida no fundo da placa de Petri e deixe esfriar um pouco para evitar danos térmicos à amostra. Coloque cerca de cinco milímetros de comprimento três ou quatro pedaços do órgão da planta horizontalmente sobre a agarose.Cerca de 30 a 60 segundos depois, um filme semissólido fino aparecerá no topo da primeira camada de agarose. Em seguida, despeje cuidadosamente uma segunda camada por cima. Depois que a agarose estiver completamente solidificada, corte o bloco que contém o espécime.Molde o bloco em uma pirâmide truncada hexagonal para garantir sua estabilidade durante o seccionamento adicional. Antes de iniciar a seccionamento da amostra com o vibratome, cole o bloco no estágio vibratório com adesivo de cianoacrilato. Coloque o palco no vibratome, de modo que um dos cantos da pirâmide fique de frente para a lâmina do vibratome e despeje água no banho de vibratome.Defina os parâmetros de seccionamento, como espessura da seção, velocidade da lâmina e frequência de vibração, e corte a amostra. Usando uma escova fina, mova a seção do banho de água para uma lâmina de vidro e coloque uma gota de água na seção para evitar que ela seque. Depois de verificar a qualidade da seção sob um microscópio de luz, selecione a seção adequada com parede celular perpendicular ao plano de seção.Em seguida, imobilize a seção para medições de microscopia de força atômica derramando uma camada de um mililitro de agarose derretida a 1% no fundo da tampa da placa de Petri usando uma pipeta. Depois que a agarose se solidificar, remova o excesso de água da seção, trazendo papel de filtro para sua borda. Transfira cuidadosamente a seção do slide para o centro da tampa da placa de Petri usando um pincel.Em seguida, adicione cuidadosamente 1% de agarose ao redor da seção usando uma pipeta de 20 microlitros e despeje a água ou outra solução para a microscopia de força atômica na tampa da placa de Petri com a seção imobilizada. Guie a amostra sob o cantilever de microscopia de força atômica usando o microscópio óptico. Clique no botão Aproximação e, em seguida, no botão Pouso para se aproximar da amostra no modo de contato com um ponto de ajuste de um nanoampere.Clique no botão Digitalização e, em seguida, no botão Área. Selecione o tamanho da área de 50 micrômetros por 50 micrômetros para digitalizar. Clique no botão Mover sonda e verifique toda a área de varredura movendo o scanner sobre ela e encontrando o ponto mais alto com base no grau de protrusão do scanner.Abra a guia Abordagem. Em seguida, clique no botão Remover para se retirar da amostra. Usando o ponto mais alto como alvo, clique no botão Aterrissagem para se aproximar da amostra novamente.Em seguida, verifique a superfície novamente clicando no botão Mover sonda e movendo o scanner sobre ela. Defina a taxa de varredura para 0,5 hertz e defina o tamanho da varredura para 50 micrômetros por 50 micrômetros e o ponto de varredura para 64 por 64. Clique no botão Executar e digitalize para verificar a superfície da amostra e é possível contaminação com agarose.Depois de clicar no botão Ativado, escolha o modo HDPlus no menu suspenso na janela principal do programa e defina o ponto de ajuste para 0,1 nanoamperes na janela principal do programa. Na aba principal da janela HD, defina os parâmetros de digitalização apropriados para a amostra estudada. Em seguida, abra a guia Ruídos na janela HD e insira a frequência de ressonância do balanço.Abra a guia Quant da janela HD e insira o IOS, a rigidez do cantilever, o raio da ponta e o ângulo. Selecione o modelo de contato, que será usado para cálculos dependendo da geometria da ponta. Depois disso, abra a guia Scan da janela HD e selecione os sinais, bem como a direção em que o sinal é gravado.Marque a caixa Forçar Volume para obter um registro de todas as curvas de força e clique no botão Desligar na parte superior da janela principal do programa para ativar o loop de feedback Clique no botão Phase Core na janela HD principal para corrigir a sensibilidade do sistema óptico. A guia Versus Time da janela HD principal apresenta a função do sinal DFL versus tempo em tempo real. Selecione as partes dessa função que serão usadas para a determinação do nível de linha de base e para ajustar o modelo de contato para cálculos adicionais.Agora, defina o valor do ponto de verificação para 256 por 256 na janela principal do programa. Em seguida, defina a taxa de varredura para 0,2 hertz e clique no botão Executar para digitalizar a amostra. Depois que a digitalização parar, clique no botão Ativado na parte superior da janela principal para desligar o loop de feedback.Escolha Modo de contato no menu suspenso, abra a guia Abordagem e clique no botão Remover para se retirar da amostra. Clique no botão Dados para abrir o software de análise e salvar a saída. Abra o arquivo salvo no software de análise.Selecione o quadro de volume de força HD. Mantenha pressionada a tecla Control e selecione um quadro visual obtido na mesma direção de digitalização. Clique no botão Carregar Mapa Externo para ver onde as paredes celulares estão localizadas.Verifique os valores de rigidez InvOptSens e cantilever na guia principal. Abra a guia Adicional e verifique os parâmetros de dica e o modelo de contato. Clique em vários pontos nas paredes celulares do quadro visual e selecione apenas as curvas bem descritas pelo modelo.As áreas brancas no mapa do módulo correspondem a uma superestimação errônea do módulo de Young devido ao scanner atingir seu limite na direção Z. Esta imagem não é conveniente para ser usada como um mapa externo para uma seleção adicional de curvas de força satisfatórias. No entanto, o mapa de sinal DFL apresentado à direita é mais adequado aqui.Diferentes instrumentos podem se referir a sinais DFL como sinais de deflexão ou erro. O scanner que foi totalmente estendido ao tentar chegar ao fundo da amostra pode resultar em medições errôneas e até mesmo varreduras interrompidas. A presença de agarose pode ser verificada durante a obtenção da primeira varredura no modo de contato, pois as paredes celulares e alguns fundos celulares são visíveis em tais varreduras.No entanto, em caso de imobilização imprecisa, a superfície pode ser coberta com agarose, que mascara a topografia da amostra. De quatro curvas de força diferentes registradas em diferentes pontos da mesma parede celular, a curva registrada em 0,1 não mostra linha de base, o que significa que não há separação da ponta do cantilever da parede celular. A curva registrada em 0,3 mostra um ombro na parte que se aproxima indicando flexão da parede celular.Os pontos dois e quatro mostram curvas de força satisfatórias com valores de módulos semelhantes. A preparação da amostra e o exame exigem prática, mas podem ser dominados. Uma parte crucial deste protocolo é filtrar as curvas resultantes.Não confie em módulos, que foram calculados automaticamente. A mesma técnica pode ser usada para medir as forças de adesão ou dissipação de energia. Também pode ser importante para a descrição do comportamento viscose ou viscoelástico de alguns materiais.

characterizing-mechanical-properties-primary-cell-wall-living-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Descrevemos um método para mapear propriedades mecânicas de tecidos vegetais usando um microscópio de força atômica (AFM). Nós nos concentramos em como registrar as mudanças mecânicas que ocorrem nas paredes celulares durante o desenvolvimento da planta em mesoescala de campo amplo, permitindo que essas mudanças sejam correlacionadas com o crescimento e a morfogênese.

Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

Aqui, nós apresentamos a microscopia de força atômica (AFM), operada como uma ferramenta do nano-e do micro-Indentation em pilhas e em tecidos. O instrumento permite a aquisição simultânea de topografia de superfície 3D da amostra e suas propriedades mecânicas, incluindo a parede celular módulo de Young, bem como a pressão de turgor.

Uso da microscopia de força atômica para medir propriedades mecânicas e pressão de turgor de células vegetais e tecidos vegetais

Aqui descrevemos um protocolo para imagens de células vivas do citoesqueleto de microtúbulos cortical no meristem apical de tiro e monitorando sua resposta às mudanças nas forças físicas.

Imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da Arabidopsis Shoot Apical Meristem

O protocolo de indentação por microscopia de força atômica oferece a possibilidade de dissecar o papel das propriedades físicas da parede celular de uma determinada célula de um tecido ou órgão durante o crescimento normal ou restrito (ou seja, sob déficit hídrico).

Microscopia de Força Atômica para Estudo das Propriedades Físicas de Células Epidérmicas de Raízes Vivas de Arabidopsis

A quantificação da área de contato e da força aplicadas por uma ponta de sonda de microscópio de força atômica (AFM) à superfície de uma amostra permite a determinação de propriedades mecânicas em nanoescala. As melhores práticas para implementar nanoindentação baseada em balil AFM em ar ou fluido em amostras moles e duras para medir módulo elástico ou outras propriedades nanomecânicas são discutidas.

Nanoindentação baseada em cantilever por microscopia de força atômica: medidas de propriedades mecânicas em nanoescala no ar e fluido

Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na operação de um sistema integrado de força atômica-microscópio óptico de imagem para a estimulação mecânica de células vivas em cultura. Um protocolo passo a passo é apresentado. Um representante conjunto de dados que mostra a resposta de células vivas ao estímulo mecânico é apresentado.

Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada

Desenvolvimento precoce da mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é caracterizada por uma série de alterações nas células forma que são adequados para abordagens de imagem. Este artigo irá descrever as ferramentas básicas e métodos necessários para geração de imagens ao vivo confocal de embriões Drosophila, e incidirá sobre uma mudança a forma da célula chamada celularização.

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

Aprenda a caracterizar propriedades mecânicas de paredes celulares primárias em órgãos de plantas vivas usando microscopia de força atômica. Este método permite analisar amostras não fixadas e não desidratadas.

Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica (Vídeo) | JoVE Journal

Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Explorar mais vídeos