Name: Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação de DNA plasmídeo no músculo esquelético de ratos C57BL/6. Este método permite transferência genética eficiente sem comprometer a contratilidade muscular, facilitando estudos de fisiologia e expressão gênica.

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Todos os experimentos com animais foram realizados no Penn State College of Medicine, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Penn State University, e realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores. Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas de 12 semanas de idade para este procedimento. Todas as ferramentas cirúrgicas foram autoclavadas para esterilidade antes da experimentação.
1. Preparação de injeção/eletroporação ta e EDL
NOTA: Estes passos são idênticos para a preparação de injeção/eletroporação TA e EDL.
<ol><li>Purificar construções plasmídeos de expressão a uma concentração de 1 μg/μL diluída em PBS estéril antes do experimento. Para este procedimento, foi utilizado um kit de purificação comercialmente disponível sem endotoxinas para purificar o vetor vazio pcDNA3-EGFP (GFP) ou o pcDNA3 vazio (controle).</li>
	<li>Calcule a concentração plasmida para garantir o volume adequado de injeção (TA 50 μg de DNA em 50 μL de PBS estéril; EDL 10 μg de DNA em 10 μL de PBS estéril) e amostras de alíquota.</li>
	<li>Programe as configurações do eletroporador utilizando a roda selecionada e deprimindo a roda para escolher os parâmetros da seguinte forma: Modo - LV, Tensão - 12,5 V/mm (a ser ajustado no momento da injeção), comprimento do pulso - 20 ms, número de pulsos - 5, intervalo - 200 ms, polaridade - unipolar.</li>
	<li>Anestesiar os ratos usando gás isoflurane. Coloque os ratos em uma caixa de indução com 5% de isoflurane. Confirme o plano cirúrgico da anestesia pela ausência do reflexo do dedo do pé usando fórceps e reduza a isoflurane para 2% de dose de manutenção. Transfira os ratos para um cone de nariz apropriado descansando em uma placa de água circulante a 37 °C para o resto do procedimento.</li>
	<li>Remova o cabelo de ambos os traseiros usando pequenos cortadores de cabelo. Esfregue os membros inferiores com 70% de etanol/betadina alternados para higienizar a área de injeção.</li>
</ol>2. Injeção/eletroporação de TA
<ol><li>Com o rato em posição supina, localize o tendão ta visível através da pele no lado lateral da perna inferior. Utilizando uma microeringa de 50 μL com uma agulha destacável de 30 G, insira a agulha 1-2 mm superior à junção miotendinous em um ângulo raso de 5° até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo. NOTA: A injeção no meio do músculo é o objetivo.</li>
	<li>Deprimir lentamente o êmbolo enquanto retrai lentamente a agulha ao longo do caminho da injeção para fornecer 50 μL de solução plasmida. O músculo deve inchar.</li>
	<li>Coloque o temporizador por 1 min e meça a espessura da perna no TA. Dependendo do tamanho do mouse, isso pode ser de 5 a 10 mm. Coloque os eletrodos de pinça na espessura medida e coloque a tensão eletroporante em 12,5 V/mm.</li>
	<li>Depois de 1 min, coloque os eletrodos de pinça ao redor do membro inferior. Os eletrodos devem ser aconchegantes, mas não muito apertados. Entregue 5 pulsos de ondas quadradas, com 20 ms de duração e intervalos de 200 ms (o músculo deve se contrair com cada pulso).</li>
	<li>Repita com o membro alternativo usando o vetor de controle.</li>
	<li>Remova o mouse da anestesia e deixe que ele se recupere em uma almofada de aquecimento a 37 °C. Uma vez recuperado, devolva o rato para sua gaiola.</li>
</ol>3. Injeção/eletroporação de EDL
<ol><li>Com o rato em uma posição supina, localize a crista anterior do osso da tíbia visualmente e através de uma palpação suave.<ol>
<li>Usando um bisturi, faça uma incisão rasa através da pele no lado lateral da crista anterior da tíbia 5 mm inferior ao joelho até 2 mm superior à junção miotendinous TA.</li>
		<li>Usando uma tesoura pequena, disseque a fáscia, expondo o músculo TA.</li>
		<li>Novamente, usando dissecção sem corte com tesoura, separe o músculo TA da tíbia suavemente puxando o músculo lateralmente, expondo o EDL. Fórceps pequenos e curvos podem ser usados para manter o TA afastado do EDL durante o procedimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando uma micro-seringa de 50 μL com uma agulha destacável de 30 G, insira a agulha no EDL longitudinalmente até que a agulha atinja a extremidade superior do músculo.</li>
	<li>Deprimir lentamente o êmbolo enquanto retrai lentamente a agulha ao longo do caminho da injeção para injetar 10 μL da solução plasmida (o músculo deve inchar).</li>
	<li>Defina um temporizador por 1 min e meça a espessura da perna no EDL. Dependendo do tamanho do mouse, isso pode ser de 5 a 10 mm. Coloque os eletrodos de pinça na espessura medida e coloque a tensão eletroporante em 12,5 V/mm.</li>
	<li>Depois de 1 min, coloque os eletrodos de pinça ao redor do membro inferior. Os eletrodos devem ser aconchegantes, mas não muito apertados. Entregue 5 pulsos de ondas quadradas, com 20 ms de duração e intervalos de 200 ms (o músculo deve se contrair com cada pulso).</li>
	<li>Feche a incisão usando suturas descartáveis de nylon 4/0 não absorvíveis.</li>
	<li>Repita com o membro alternativo ou deixe o membro intocado como controle absoluto.</li>
	<li>Remova o mouse da anestesia e deixe que ele se recupere em uma almofada de aquecimento a 37 °C. Administre um analgésico subcutâneo apropriado imediatamente após a cirurgia e 12-24 h após a cirurgia. Uma vez recuperado, devolva o rato para sua gaiola. NOTA: Estudos anteriores mostraram um déficit de contratilidade muscular no TS imediatamente após a eletroporação e que a recuperação contratil ocorre ao longo de 3 dias 13,15. Por essa razão, a análise dos músculos TA e EDL para histologia, expressão proteica ou contralidade muscular é realizada de 3 a 10 dias após a eletroporação. A expressão prolongada de EGFP foi observada até 3 semanas após o procedimento13.</li>
</ol>

<ol><li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li>
<li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp27+inhibits+IKK%CE%B2-induced+NF-%CE%BAB+activity+and+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li>
<li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory%2C+Integregrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li>
<li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li>
<li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li>
<li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle%3A+studies+on+isolated+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li>
<li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li>
<li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li>
<li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li>
<li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li>
<li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732(2015).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li>
<li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li>
<li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficacy%2C+longevity%2C+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li>
</ol>

B.A.H. e D.L.W alegam não haver conflitos de interesse.

A transferência genética in vivo no músculo esquelético reforçada pela eletroporação é uma ferramenta útil e relativamente simples para modular a expressão proteica no músculo. Mostramos as etapas necessárias para alcançar uma transferência genética eficiente nos músculos EDL e TA e demonstramos que a medição da contratilidade do EDL é viável após o procedimento. Esta técnica não requer vetores virais mais complicados e permite a comparação de fibras transfeinadas e não transfectadas transfectadas de fibras tran...

A eletroporação de DNA plasmídeo no músculo esquelético in vivo é uma ferramenta importante para avaliar alterações na fisiologia muscular esquelética e na sinalização molecular, modulando a expressão genética em uma variedade de condições fisiológicas e fisiofisiológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . A transferência genética experimental para o músculo esquelético foi demonstrada já em 1990 por Wolff et al., onde tanto o RNA quanto o DNA foram transferidos com sucesso sem eletroporação, e a expressão da luciferase foi mantida por pelo menos 2 mesese 10. A eficiência relativamente baixa de transfecção com injeção é apenas problemática, e Aihara e Miyazaki demonstraram aumento da transferência genética com eletroporação em 1998, eletroporando uma construção pCAGGS-IL-5 no músculo tibialis anterior (TA) e medindo a expressão sérica IL-511. Desde então, muitos estudos têm investigado a eficácia de diferentes concentrações de DNA, volumes e parâmetros de eletroporação para garantir a eficiência máxima da transferência genética. Mir et al. testaram diferentes parâmetros de eletroporação, incluindo tensão, número de pulso, duração do pulso e frequência, bem como concentração de DNA, e determinaram que maior tensão, número de pulso e concentração de DNA contribuíram para o aumento da eficiência da eletroporação12. Uma grande ressalva à alta tensão eletroporação é que, embora facilite o aumento da absorção de DNA em miofibers, também causa danos musculares, o que pode confundir resultados. Schertzer et al. mostraram que a eletroporação a 200 V causou danos em cerca de 50% dos myofibers 3 dias após a eletroporação, enquanto apenas 10% dos myofibers foram danificados em 50 V13. Levamos em consideração as variáveis que afetam a transferência eficiente de DNA versus dano muscular e descobrimos que uma tensão de 125 V por centímetro de largura de pinça é suficiente para realizar uma transferência genética eficaz.
A análise da área transversal da fibra muscular e da contralidade muscular inteira após a eletroporação são aspectos importantes do método para medir mudanças no tamanho e função muscular devido à modulação genética. Nós e outros já demonstramos anteriormente que a eletroporação de vetores de controle por si só não causa uma diminuição na área de miofibra. A construção da proteína fluorescente verde (EGFP) foi um indicador fluorescente útil da transfecção de DNA nestes estudos13,14. Vários estudos investigaram a contração in situ do TA após a eletroporação e encontraram resultados variados. Um estudo mostrou que a eletroporação de 75 V/cm causou uma redução de cerca de 30% na força tetanica 3 dias após a eletroporação, e em 7 dias após a eletroporação, a força tetanica voltou ao nível de controle, enquanto a eletroporação de 50 V/cm não comprometeu a força13,15. Outro estudo mostrou que houve uma perda de 30% da força tetanica 3h após a eletroporação de 180 V/cm, que se recuperou para os níveis de força falsa após 7 dias16.
No procedimento detalhado a seguir, demonstramos injeção e eletroporação de um plasmídeo pcDNA3-EGFP nos músculos TA e extensor digitorum longus (EDL) de camundongos. Também demonstramos que este método não afeta a contratude muscular total edl. O objetivo é demonstrar uma absorção plasmida eficiente em myofibers sem causar perda de função.

<table><tbody><tr><td>Sutura de nylon 4-0 (não absorvível)</td> <td>Sutura Ethicon</td><td>662G</td><td>para fechar a incisão na pele</td></tr><tr><td>50&micro; l Seringa Hamilton</td><td>Microsseringa</td><td>Hamilton</td><td>80501</td></tr><tr><td>C57BLl/6NHsd camundongos</td><td>Envigo</td><td>044</td><td>Camundongos fêmeas de 12 semanas usados para experimentação</td></tr><tr><td>Eletrodo de paquímetro</td><td>BTX</td><td>45-0102</td><td>1,0 cm x 1,0 cm de aço inoxidável</td></tr> Controle <tr><td>Muscular Dinâmico Aquisição/análise de dados</td><td>Aurora Scientific</td><td>605A</td><td>Software usado para medição e análise da contratilidade muscular</td></tr><tr><td>ECM 830 Sistema de Eletroporação</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td>eletroporador</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Kit de purificação de plasmídeo</td></tr><tr><td>Tesoura extra estreita</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>14088-10</td><td>Tesoura para dissecção romba</td></tr><tr><td>Transdutor de força</td><td>Aurora Scientific</td><td>407A</td><td>Para medir a força de</td></tr><tr><td>EDL Micro-Masquito Hemastats</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>13010-12</td><td>Hemastatos para suturtura</td></tr><tr><td>do vetor de expressão de mamíferos pcDNA3.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>V79020</td><td>Vetor de controle</td></tr><tr><td>plasmídeo de expressão pcDNA3-EGFP</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>Plasmídeo para expressão de GFP</td></tr><tr><td>Pinça curva Semken</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11009-13</td><td>Pinça para cirurgia</td></tr><tr><td>Lâminas cirúrgicas de aço inoxidável nº 10</td><td>Becton Dickinson</td><td>37 1210</td><td>Lâminas de bisturi</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. mídia</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Mídia de congelamento para histologia</td></tr><tr><td>Aglutinina de Gérmen de Trigo- Texas Red</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>W21405</td><td>Coloração de membrana para seção transversal muscular</td></tr></tbody></table>

eletroporação do dna plasmídeo no músculo esquelético do rato

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

A modulação da expressão genética transitória no músculo esquelético murino por eletroporação plasmida é uma ferramenta útil para avaliar a fisiologia normal e patológica. A superexpressão ou derrubada de genes-alvo permite aos pesquisadores manipular eventos moleculares individuais e, assim, entender melhor os mecanismos que afetam a massa muscular, o metabolismo muscular e a contralidade. Além disso, a eletroporação de plasmídeos de DNA que codificam etiquetas fluorescentes permite aos pesquisadores medir mudanças na localização subcelular de proteínas no músculo esquelético in vivo. Uma avaliação funcional chave do músculo esquelético inclui a medição da contralução muscular. Neste protocolo, demonstramos que estudos de contratude muscular ainda são possíveis após injeção de DNA plasmid, eletroporação e modulação da expressão genética. O objetivo deste procedimento instrucional é demonstrar o método passo-a-passo da eletroporação plasmóide de DNA no músculo esquelético do camundongo para facilitar a absorção e a expressão nos miofibers dos músculos tibialis anterior e extensor digitorum longus, bem como demonstrar que a contratilação muscular esquelética não está comprometida pela injeção e eletroporação.

A eletroporação para facilitar a transferência genética no músculo esquelético é uma técnica útil usada para avaliar alterações na fisiologia muscular. Demonstramos um procedimento detalhado passo a passo para realizar uma transferência genética eficiente nos músculos TA e EDL. As diferenças na eficiência da transfecção ocorrem devido a uma série de variáveis. Entre essas variáveis estão parâmetros de eletroporação (pulsos, tensão, duração do pulso, etc.), tamanho da construção genética e concentração/volume de DNA injet...

A eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético é um método viável para modular a expressão genética sem comprometer a contratilidade muscular em camundongos.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

A transferência genética mediada por eletroporação no músculo é uma técnica fácil e eficiente para investigar mudanças na fisiologia muscular. Descobrimos que a eletroporação não compromete a contratude muscular. A eletroporação de construções genéticas em in vivo muscular é um procedimento simples e eficiente que não requer embalagens mais extensas de construções genéticas em vetores virais.É difícil visualizar, isolar e injetar o EDL devido à sua localização e tamanho pequeno. Praticar em uma carcaça de rato e injeção de tinta biológica, como a tinta da Índia, pode ajudar a fornecer evidências de injeção suficiente. Demonstrando o procedimento será Brian Hain, um pós-doutor do meu laboratório.Antes de injetar o rato, confirme o plano cirúrgico da anestesia usando fórceps com a ausência do reflexo do dedo do pé, em seguida, transfira o rato para um cone de nariz descansando em uma placa de água circulante a 37 graus Celsius para o resto do procedimento. Uma vez que o rato é colocado em uma posição supina, remova o cabelo de ambos os membros traseiros usando pequenos cortadores de cabelo, em seguida, higienize a área de injeção com 70% de etanol e betadina alternadas. Para a injeçã

electroporation-of-plasmid-dna-into-mouse-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos os procedimentos detalhados para a transfecção eficiente de DNA plasmidial nas fibras dos músculos do pé de ratos ao vivo usando o eletroporação ea visualização posterior de expressão da proteína através de microscopia de fluorescência.

Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação

Este vídeo demonstra a entrega de DNA de plasmídeo em células neuronais cerebelares de embriões murinos usando eletroporação in utero. Este método é útil para obter compreensão da função in vivo dos genes no desenvolvimento normal do cérebro e as mudanças na expressão gênica das células dos neurônios durante a progressão do tumor.

Entrega de genes baseada em eletroporação in utero: uma técnica para injetar DNA de plasmídeo em células cerebelares embrionárias de embriões murinos

Progenitores miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são candidatos promissores para estratégias de terapia celular para tratar distrofias musculares. Este protocolo descreve transplantes e medidas funcionais necessárias para avaliar o enenxerto e diferenciação dos mesoangioblastos derivados do iPSC (um tipo de progenitores musculares) em modelos de camundongos de regeneração muscular aguda e crônica.

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Este artigo descreve a microinjecção e a electroporação de testículo do rato in vivo, como uma técnica para a transfecção de células de testículo de rato para estudar os processos exclusivos da espermatogénese. O protocolo apresentado envolve os passos de preparação de capilar de vidro, através da conduta de microinjecção eferente, e transfecção por electroporação.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

Este protocolo utiliza eletroporação para introduzir e expressar proteínas marcadas com fluorescência em fibras musculares de camundongos. Após a recuperação após a eletroporação, as fibras são isoladas. As fibras individuais são então visualizadas usando microscopia confocal de alta resolução para visualizar a estrutura muscular.

DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

A fluorometria sítio-dirigida funcional é um método para estudar movimentos do domínio de proteínas em tempo real. A modificação desta técnica para sua aplicação em células nativas agora permite a detecção e rastreamento de movimentos de sensores de voltagem únicos a partir de canais de Ca2+ dependentes de voltagem em fibras musculares esqueléticas isoladas de murino.

Fluorometria Sítio-Dirigida Funcional em Células Nativas para Estudo da Excitabilidade do Músculo Esquelético

Aqui, apresentamos um protocolo que combina eletroporação in vivo e desnervação do músculo levantador do auro longo do crânio (LAL). Este procedimento permite o estudo do papel potencial das proteínas derivadas do músculo na regeneração da sinapse neuromuscular.

Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris

Aqui, apresentamos uma abordagem de terapia gênica que fornece quitosana revestida com ABE diretamente na medula óssea por injeção intraóssea.

Entrega e expressão gênica aprimoradas usando injeção intraóssea de nanopartículas de quitosana encapsuladas em plasmídeos editores de base de adenina

Aprenda a técnica de eletroporação de DNA plasmídeo no músculo esquelético de ratos C57BL/6. Este método permite transferência genética eficiente sem comprometer a contratilidade muscular, facilitando estudos de fisiologia e expressão gênica.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

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