Name: Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Explore ferramentas microfluídicas para investigar interações fúngicas-microbianas com alta resolução celular. Este método permite visualizar dinâmicas entre fungos e bactérias, contribuindo para a compreensão do microbioma do solo e práticas agrícolas sustentáveis.

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Reconhecemos o apoio financeiro do Departamento de Bioengenharia do Imperial College London e do Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Este artigo apresenta um protocolo para o estudo das interações fúngicos-microbianas utilizando microfluidos de canal. Os autores visam demonstrar a versatilidade desses dispositivos e incentivar a adaptação para atender aos interesses do pesquisador. Usando os dispositivos BFI e FFI exemplares, as interações fúngicos-microbianas podem ser estudadas com mais detalhes do que previamente acessíveis. Ao remover a complexidade de fundo e a heterogeneidade do solo, moderando o crescimento da hifa de tal forma que eles estão c...

O solo é um ambiente excepcionalmente diverso que contém uma abundância de microrganismos que são instrumentais para os ciclos de carbono e fósforo 1,2. Os fungos filamentosos são um componente importante de inúmeros ecossistemas como decomposição de matéria orgânica e inorgânica e podem melhorar a nutrição das plantas através da formação de relações simbióticas 3,4. Dentro do solo, os fungos interagem dinamicamente com uma infinidade de micróbios como outros fungos5, bactérias6, vírus7 e nematoides8. Essas interações têm consequências significativas para a saúde do solo e das plantas. No entanto, devido à falta de sistemas experimentais apropriados capazes de imagens interagindo microrganismos com alta resolução, muitos permanecem indefinidos.
Investigações relativas às interações bacteriana-fúngica (BFIs) e interações fúngicas (FFIs) têm aplicações valiosas em uma variedade de campos, incluindo antimicrobianos na medicina e agentes de controle biológico na agricultura. Por exemplo, o fungo Coprinopsis cinerea produz o peptídeo copsin, que tem sido mostrado para exibir atividade antibacteriana contra o patógeno humano Listeria monocytogenes9. Da mesma forma, o composto derivado de fungos, griseofulvin, é amplamente utilizado como tratamento para infecções fúngicas humanas e é adicionalmente capaz de inibir o crescimento do fungo patogênico da planta Alternaria solani10,11. Várias cepas da bactéria bacillus subtilis também foram demonstradas como agentes de biocontrole eficazes do patógeno fúngico da planta Rizoctonia solani12,13. No entanto, devido às limitações associadas às metodologias tradicionais, os BFIs e os FFIs são mal compreendidos ao nível de células únicas.
Estudos convencionais normalmente exploram BFIs e FFIs na macroescala usando placas de ágar com duas ou mais espécies em confronto. Sua interação é avaliada pela medição das taxas de crescimento e produção metabólica das espécies confrontantes 14,15,16; no entanto, essa metodologia só é resolvida ao nível da colônia. Para estudar interações no nível celular, inoculantes bacterianos e fúngicos podem ser cultivados em lâminas de microscópio de vidro revestidas com ágar que são então imagens sob um microscópio17. No entanto, pode ser difícil seguir uma única higifia usando slides de microscópio devido à falta de confinamento, o que significa que imagens com lapso de tempo são mais difíceis de obter. Além disso, a oportunidade de confinar espacialmente outros microrganismos dentro de regiões definidas do micélio fúngico ou criar ambientes químicos definidos que podem ser perturbados, por exemplo, não é possível nessas configurações. A natureza "caixa preta" do solo também aumenta a complexidade de estudar interações fúngicos-microbianas ao nível de células únicas18. Observando espécies interagindo longe da incrível diversidade do microbioma do solo, a maneira exata pela qual os membros interagem pode ser avaliada. Assim, há uma necessidade contínua de plataformas versáteis que permitem imagens unicelulares de alta resolução de BFIs e FFIs.
As tecnologias microfluídicas, os chamados sistemas lab-on-a-chip, fornecem uma plataforma ideal para o estudo de BFIs e FFIs ao nível de células únicas. O campo dos microfluidos, originários de tecnologias desenvolvidas para análise química e microeletrônica, tem sido adotado pelas ciências biológicas19. As tecnologias microfluidas regulam pequenos volumes de fluidos dentro de uma rede sob medida de canais miniaturizados, tendo pelo menos uma dimensão na escala de micromítre, e seu uso em pesquisas biológicas está expandindo20. Em particular, foram desenvolvidos dispositivos microfluidos para examinar o crescimento de fungos filamentosos 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Um benefício do uso dessa tecnologia é que o confinamento da hifa e a distribuição de nutrientes dentro dos microcanais se assemelham mais à estrutura do ambiente do solo do que os métodos convencionais de ágar31. Recentemente, plataformas microfluidas têm sido usadas para investigar interações entre neutrófilos humanos e patógenos fúngicos32, bactérias e raízes vegetais33, além de fungos e nematoides34,35.
Uma das muitas vantagens do uso de microfluidos para o estudo de interações microbianas inclui o controle específico do ambiente microcanal. Por exemplo, regimes de fluxo laminar podem ser explorados para gerar gradientes de concentração definidos, o que é especialmente útil ao examinar a quimiotaxis bacteriana36. Outra vantagem é que a natureza transparente do poli(dimetilsiloxano) (PDMS), um polímero elastomérico barato e biocompatível comumente utilizado na fabricação de dispositivos microfluidos, facilita a imagem de alta resolução de células únicas usando microscopia de campo brilhante e fluorescência37. Da mesma forma, o confinamento de micróbios dentro de microcanais significa que experimentos de lapso de tempo que rastreiam células únicas podem ser realizados, permitindo que respostas celulares individuais sejam registradas e quantificadas37. Por fim, como os dispositivos microfluidos podem ser projetados para serem fáceis de usar, eles podem ser facilmente empregados por não-especialistas38.
O aprofundamento do conhecimento das interações entre microrganismos que habitam o solo é importante para melhorar as práticas sustentáveis de manejo do ecossistema que mantêm a biodiversidade e mitigar o impacto das mudanças climáticas nos ambientes terrestres39. Assim, o desenvolvimento de novas ferramentas microfluídicas é fundamental para ampliar a compreensão dos fungos e suas interações no nível celular. O protocolo aqui se concentrará em dois dispositivos microfluidos produzidos para o estudo das BFIs40 e FFIs41, representadas na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Figura 1: Representação visual e esquemática dos dispositivos de interação bacteriana-fúngica (BFI) e interação fúngico (FFI). Um plugue mycelial é colocado na entrada de uma extremidade dos microcanais para permitir o crescimento de hifas no dispositivo. A entrada bacteriana está na extremidade oposta. Barra de escala = 5 mm. (B) Visão geral esquemática do dispositivo BFI, representando o posicionamento das entradas bacterianas e a direção do crescimento hifál através dos microcanais de interação. Os canais têm 10 μm de profundidade, 100 μm de largura e 7 mm de comprimento, com 28 canais de observação no total. (C) Ensaio de confronto na placa de ágar entre Coprinopsis cinerea e Bacillus subtilis NCIB 3610, barra de escala = 20 mm (esquerda). Imagens de microscopia mostrando a interação entre C. cinerea e B. subtilis NCIB 3610 dentro do microcanal (médio e direito), ou seja, fixação polar de bactérias à hifa fúngica. Barra de escala = 25 μm (médio) e 10 μm (direita). (D) Imagem do dispositivo FFI ligado a uma placa de Petri com fundo de vidro, duplamente inoculada com plugues miceliais. Barra de escala = 1 cm. (E) Visão geral esquemática do dispositivo FFI. Dois plugues inoculantes fúngicos são introduzidos nas entradas em cada extremidade do dispositivo, permitindo a exploração higfálica dos microcanais. Os canais de controle são conectados apenas a uma entrada fúngica e têm um canal sem saída, impedindo interações entre os fungos de teste. Os canais de interação conectam ambas as entradas fúngicas e permitem interações hifais entre os sujeitos do teste dentro do microcanal. Cada canal de interação consiste em 18 seções em forma de diamante, medindo um comprimento total de 8,8 mm (490 x 430 μm por diamante), 10 μm de profundidade e tendo uma região de conexão entre cada diamante de 20 μm. Os tipos de canal são duplicados, barras de escala = 1 mm. (F) Zona de interação entre duas frentes hifais que se aproximam, crescendo a partir de extremidades opostas do canal de interação interconectada. Imagem de microscopia de contraste de fase, barra de escala = 250 μm. Os painéis desta figura foram modificados a partir de Stanley et al., 2014 (A-C)40 e Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td>Usado para solidificar o meio de cultura para cultivo bacteriano e fúngico dentro de placas</td></tr> de <tr><td>Petri Folha de alumínio</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11759408</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD 2021</td><td>Autodesk, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave (VX-75)</td><td>Centrífuga Systec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5810R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorotrimetilsilano</td><td>Merck Life Sciences</td><td>386529</td><td>CUIDADO: O clorotrimetilsilano é uma substância perigosa. Use EPI adequado e manuseie com cuidado. Evite o contato com a pele e os olhos e evite a inalação. Mantenha longe de fontes de ignição e use em uma área bem ventilada.</td></tr><tr><td>Broca de cortiça</td><td>SLS</td><td>COR1000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de revelação (mr-Dev 600)</td> <td>Microresist Technologies</td><td></td><td>CUIDADO: A solução de revelação mr-Dev 600 é inflamável</td></tr><tr><td>Frascos Erlenmeyer</td><td>VWR</td><td>214-1108</td><td>por exemplo, 200 mL; escolha o tamanho para atender às suas necessidades exatas</td></tr><tr><td>Etanol (70% v/v)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>E/0650DF/15</td><td>Diluído a partir de 99,8% (Grau de Reagente Analítico)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Pacote de software exemplar para processamento de imagens</td></tr><tr><td>Ar</td><td></td><td></td> comprimido filtrado <td>Disponível como padrão na maioria dos laboratórios. Alternativamente, um compressor isento de óleo com regulador de ar pode ser usado.</td></tr><tr><td>Pinças de wafer de cabeça chata</td><td>SLS</td><td>INS5026</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10008051</td><td>Placa</td></tr> de <tr><td>Petri com fundo de vidro</td> dobrada <td>e afiada World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Placa de Petri com fundo de vidro</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td>50 mm</td></tr><tr><td>Placas de cristalização de vidro</td><td>VWR</td><td>216-1865</td><td>Usado para lavagem de placas PDMS</td></tr><tr><td>Pratos de cristalização de vidro</td><td>VWR</td><td>216-1866</td><td>Utilizados no desenvolvimento de moldes mestres</td></tr><tr><td>Garrafas de vidro Fisher</td><td>Scientific Ltd</td><td>15456113</td><td>por exemplo, 250 mL; escolha o tamanho para se adequar às suas necessidades exactas</td></tr><tr><td>Seringa de vidro (Hamilton)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10625251</td><td>Utilizada para dispensar clorotrimetilsilano</td></tr><tr><td>Placa quente (HP 160 III BM)</td><td>SAWATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop</td><td>VWR</td><td>COPA175CS01</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Capa de fluxo laminar</td><td>Air Science (PCR)</td><td></td><td>Capa de fluxo laminar exemplar usada para fabricação de dispositivos</td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP9723-500</td><td>Caldo nutriente exemplar para cultura</td></tr> <tr><td>bacteriana durante a noiteMotor de luz de diodo emissor de luz (LedHUB)</td><td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td><td></td><td>Fonte de luz exemplar que pode ser usada para imagens de interações fúngico-microbianas (fluorescência)</td></tr><tr><td>MA6 Alinhador de máscara ultravioleta</td><td>Suss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrato de malte</td><td>VWR</td><td>84618</td><td>Usado para fazer meio de cultura fúngico exemplar (ágar extrato de malte)</td></tr><tr><td>Mask Writer</td><td>Applied Materials</td><td>4700DP</td><td>Exemplo de um escritor de máscara que pode ser usado para imprimir foto-máscara para fotolitografia</td></tr><tr><td>Molde mestre de montagem</td><td></td><td></td> de plástico <td>impresso em 3D suporte sob medida fabricado internamente</td></tr><tr><td>Armário de segurança microbiológico&nbsp; (BioMat2)</td>Soluções <td></td><td>de ar contido</td><td>Exemplar MSC usado para cultura microbiana e inoculação de dispositivos</td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td> purificada Milli-Q <td>Disponível como padrão em laboratórios de biologia.&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research software</td><td>Nikon</td><td></td><td>Exemplar pacote de software para aquisição</td></tr><tr><td>de imagens NIS-Elements Free Viewer</td><td>Nikon</td><td></td><td>Exemplar pacote de software para visualização de imagens adquiridas</td></tr><tr><td>Forno (Binder BD115)</td> <td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15602126</td><td>Usado para curar poli (dimetilsiloxano) (PDMS)</td></tr><tr><td>Forno (CLO-2AH-S)</td><td>KOYO</td><td></td><td>Usado para preparar pastilhas de silício</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>HS234526B</td><td>placas de Petri de filme transparente</td></tr><tr><td>, quadradas estéreis</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11708573</td> placas de Petri de <td>120,5 mm</td></tr><tr><td>, estéreis</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15370366</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Máscara de fotolitografia</td><td>Micro Lithography Services Ltd. Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma (Zepto)</td> <td>Diener Copo de</td> plástico <td>100012601</td><td></td>eletrônico</tr><tr><td></td><td>Semadeni</td><td>8323</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de plástico</td><td>Semadeni</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>Balança de precisão portátil (OHAUS Scout)</td> <td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15519631</td><td>Usado para pesar PDMS, mídia componentes etc.</td></tr><tr><td>Cortador de precisão</td><td>Syneo</td><td>HS1251135P1183</td><td>Diâmetro da aresta: 3,18 mm</td></tr><tr><td>Cortador de precisão&nbsp;</td><td>Syneo</td><td>HS1871730P1183S</td><td>Diâmetro da aresta de corte: 4,75 mm</td></tr><tr><td>Perfilômetro&nbsp;</td>Lâminas de barbear <td>Bruker</td><td></td><td>Dektak XT-stylus</td></tr><tr><td></td><td>H&auml; berle Labortechnik</td><td>9156110</td><td></td></tr><tr><td>Refridgerator</td><td>Haden</td><td></td><td>4-6 &deg; C</td></tr><tr><td>Retiga R1 Câmera CCD</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Exemplar que pode ser usada para imagens de interações fúngico-microbianas</td></tr><tr><td>Fita mágica escocesa</td><td>Office Depot</td><td>3969954</td><td>fita invisível de 19 mm; fita transparente</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação (Cole-Parmer SI500)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10257954</td><td></td></tr><tr><td>Bolacha de silício</td><td>Inseto</td><td></td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Vidro de cal sodada placa</td><td>Inseto</td><td></td><td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Usado para segurar máscara de fotolitografia em máscara alinhador</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Spincoater&nbsp;</td><td>SAWATEC</td><td>SM-180-BM</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2010</td><td>fotorresistente MicroChem</td><td></td><td>CUIDADO: O fotorresistente SU-8 é perigoso, tome cuidado ao manusear e evite a inalação e o contato com a pele. Inflamável, potencialmente cancerígeno e tóxico para o meio ambiente.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de elastómero Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td>Utilizado para a preparação de dispositivos de poli(dimetilsiloxano)(PDMS)</td></tr><tr><td>Incubadora com temperatura controlada</td><td>Okolab</td><td></td><td>Incubadora exemplar que pode ser utilizada para a obtenção de imagens de interacções fúngico-microbianas</td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência invertida Ti2-E Microscópio</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td>Exemplar que pode ser utilizado para a obtenção de imagens de interacções fúngico-microbianas</td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico S-Line</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>FB15050</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10528861</td><td>A silianização e a desgaseificação PDMS devem ser realizadas em dessecadores separados</td></tr><tr><td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL lente objetiva</td><td>Nikon</td><td>MRH20105</td><td>Exemplar que pode ser usada para imagens de interações fúngico-microbianas</td></tr><tr><td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL lente objetiva</td><td>Nikon</td><td>MRH48230</td><td>Exemplar lente objetiva que pode ser usada para imagens de interações fúngico-microbianas</td></tr></tbody></table>

ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Os fungos filamentosos são habitantes bem sucedidos do solo e desempenham um papel importante nos ecossistemas do solo, como na decomposição da matéria orgânica e inorgânica, bem como na regulação dos níveis de nutrientes. Lá eles também encontram inúmeras oportunidades de interagir com uma variedade de outros micróbios, como bactérias ou outros fungos. Estudar interações fúngicas no nível celular, no entanto, pode ser desafiador devido à natureza do solo semelhante à caixa preta. Novas ferramentas microfluídicas estão sendo desenvolvidas para o estudo das interações fúngicas; duas plataformas projetadas para estudar interações bacteriana-fúngicas e fúngicas são destacadas. Dentro desses microcanais, as interações fúngicos-microbianas podem ser monitoradas em ambientes físico-químicos controlados em maior resolução temporal e espacial do que antes possível. A aplicação dessas ferramentas tem rendido inúmeros novos insights biológicos, como a observação do apego polar bacteriano à hifa ou a revelação de antagonismos fúngicos-fúngicos não característicos. Uma característica fundamental dessas metodologias considera a facilidade de uso desta ferramenta por não especialistas, produzindo tecnologias altamente traduzíveis para uso em laboratórios de microbiologia.

Os resultados representativos são apresentados dos dispositivos BFI40 eFFI 41 exemplares. As medidas da taxa de crescimento hiphal podem ser facilmente obtidas usando esses dispositivos em combinação com técnicas básicas de microscopia. A Figura 3A-B ilustra interações bacteriana-fúngicas entre C. cinerea hyphae e B. subtilis NCIB 3610. A presença de B. subtilis interrompe o crescimen...

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Utilizando os dispositivos microfluidos apresentados, podemos examinar interações dinâmicas entre fungos e outros micróbios com controle espacial e ambiental preciso, bem como imagens de alta resolução no nível único celular. É importante ressaltar que o crescimento fúngico pode ser confinado e direcionado dentro do canal microfluido. Permitindo a obtenção de imagens de lapso de tempo de alta qualidade.Portanto, as complexidades das interações fúngica-fúngicas e fúngicas podem ser exploradas. Compreender as interações microbianas fúngicas é um passo essencial na definição e preservação do microbioma do solo. Esse conhecimento pode ser explorado para o desenvolvimento de novos agentes de biocontrole com agricultura sustentável.Para começar, prepare aproximadamente 40 gramas de poli (dimetilsiloxano)ou PDMs, misturando completamente a base e o agente de cura em uma proporção de 10 a 1 usando uma espátula em um copo plástico limpo. Para remover todas as bolhas de ar, coloque o copo em uma câmara de vácuo por uma hora. Em seguida, usando fita transparente, fixar o molde mestre em um suporte plástico e usar ar filtrado comprimido para remover quaisquer partículas de poeira, em seguida, despeje os PDMs no centro do molde mestre e deixe-o assentar.Para evitar o assentar partículas de poeira na superfície dos PDMs, cubra livremente o molde mestre com uma tampa plástica, depois transfira o molde mestre para um forno e cure durante a noite a 70 graus Celsius. Depois de remover o molde mestre do forno e permitir que ele esfrie, descasque os PDMs curados longe do molde mestre e da estrutura plástica sem danificar o molde mestre nos PDMs. Em seguida, para manter uma superfície livre de poeira, coloque fita clara sobre os microcanais gravados nos PDMs.Em seguida, use uma guilhotina montada ou uma lâmina de barbear para cortar os PDMs em lajes conforme designado pelo design. Ao cortar a abertura lateral da laje PDMs usada para o dispositivo de interação bacteriana-fúngica, ou dispositivo BFI, certifique-se de que os microcanais estejam totalmente abertos. No entanto, para as lajes PDMs usadas na montagem do dispositivo de interação fúngico-fúngico, ou FFI, cada canto deve ser aparado para que ele se encaixe em uma placa de Petri de fundo de vidro.Em seguida, use um cortador de precisão para perfurar furos de entrada ou saída de acordo com o design do dispositivo. Em seguida, submergir as lajes dos PDMs em uma solução de hidróxido de sódio molar de 0,5. Enxágüe as lajes em água destilada dupla estéril antes de transferi-las para uma solução de 70% de etanol.Depois de remover o etanol e enxaguar as lajes com água estéril duplamente destilada novamente, imergir as lajes em água estéril dupla destilada e sonicato por cinco minutos, em seguida, remova a laje dos PDMs da água, seque-as com ar filtrado comprimido e coloque-as em uma placa de Petri quadrada estéril. Em seguida, incubar a placa de Petri com laje PDMs em um forno a 70 graus Celsius por uma hora. Uma vez que as lajes tenham esfriado em um ambiente livre de poeira, limpe qualquer poeira de sua superfície usando fita adesiva e ar filtrado comprimido.Para ativar as superfícies das lajes dos PDMs e das placas de Petri de fundo de vidro, que serão posteriormente unidas, coloque-as em um limpador de plasma com as superfícies a serem ativadas voltadas para cima. Depois de remover a laje de PDMs nas placas de Petri do limpador de plasma, uni-los suavemente colocando as superfícies ativadas em contato conformal entre si. Bond BFI e FFI PDMs laje com placas de Petri de 35 milímetros e 55 milímetros de diâmetro, respectivamente para verificar a ligação bem sucedida, tente puxar o laboratório PDMs de sua placa de Petri com pinças.Visualize o dispositivo cuidadosamente com o olho ou por microscopia genérica para garantir que não haja colapso das entradas ou microcanais. Para condições saturadas de água ou ricas em nutrientes, pipeta 100 microlitres da solução desejada para encher dispositivos BFI imediatamente após a ligação. Para dispositivos FFI, adicione 30 microliters da mídia em cada entrada.Por fim, adicione 100 a 200 microliters de água dupla destilada estéril à placa de Petri para manter a umidade. No entanto, para condições insaturadas de água, basta adicionar 100 a 200 microliters de água dupla estéril destilada à placa de Petri para manter a umidade. Para a inoculação fúngica, dentro de uma coifa de fluxo laminar, usando um borer de cortiça esterilizado, remova um plugue de ágar de uma colônia na periferia de uma cultura de três dias de idade, garantindo manter intacta a frente de hignêquico em crescimento.Em seguida, introduza o plugue de ágar na entrada fúngica do dispositivo BFI e/ou FFI com o lado micélio para baixo na frente hiphal orientada para as aberturas microcanais para incentivar a infiltração hifal dos canais. Para o dispositivo FFI, introduza outro plugue de ágar com uma segunda espécie fúngica na entrada oposta. Em seguida, sele a placa de Petri com um filme transparente e incubar a 25 a 28 graus Celsius no escuro até a imagem.Para a inoculação bacteriana, após a remoção do dispositivo BFI da incubadora, pipeta 10 microliters de uma suspensão bacteriana na entrada bacteriana em um ambiente estéril. Uma vez que a placa de Petri é selada com uma película transparente, armazenado o dispositivo ereto a 25 graus Celsius no escuro até que a imagem comece. Usando este protocolo, a interação entre o fungo Coprinopsis cinerea e a bactéria Bacillus subtilis poderia ser visualizada com sucesso.Observou-se que, na presença da bactéria, a taxa de crescimento do fungo começou a diminuir drasticamente após cerca de cinco horas de coinoculação. Além disso, a hifa fúngica associada à bactéria tinha uma aparência fina e transparente. A microscopia de fluorescência de lapso de tempo também revelou o colapso da hifafángica após cinco horas de coinoculação com iciclismo bacillus.No entanto, a partir de seis horas, a população bacteriana também começou a declinar. A visualização das interações fúngicas-fúngicas mostrou que o fusarium graminearum inibiu fortemente o crescimento do Trichoderma rossicum, que ficou evidente usando microscopia de fluorescência. Este protocolo revelou ainda mudanças morfológicas significativas no fungo Verticillium longisporum na presença das bactérias Pseudomonas synxantha e Pseudomonas fluorescens.A técnica de imagem dinâmica de alta resolução utilizada no estudo também revelou a formação de septa no Fusarium graminearum na presença do fungo Clonostachys rosea. A rotulagem de fluorescência proporcionou a quantificação dinâmica de Clonostachys rosea hyphal proliferação no dispositivo FFI. Esses dispositivos podem ser adaptados e modificados pelo usuário para incorporar diferentes espécies de interesse e abordar suas questões experimentais específicas sobre interações microbianas fúngicas.Tanto os dispositivos BFI quanto FFI têm empurrado fronteiras científicas, revelando como os fungos propagam sinais de defesa e nutrientes após ataque de fungos, vírus, nematoides e permitindo investigações sobre dispersão bacteriana.

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Dispositivos microfluídicos pode ser usado para visualizar os complexos processos naturais em tempo real e nas escalas físico apropriado. Temos desenvolvido um dispositivo simples microfluídicos que imita características-chave de meios porosos naturais para o estudo de crescimento e de transporte de bactérias no subsolo.

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Apresenta-se um método simples para a produção de dispositivos microfluídicos capazes de aplicar semelhantes condições dinâmicas de múltiplas linhagens distintas, sem a necessidade de uma sala de limpeza ou de litografia suave.

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Fonte: Miquel Guennoc, C., et al. Novo método para análise qualitativa multiescala de biofilmes bacterianos em colônias fúngicas filamentosas usando microscopia confocal e eletrônica. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a preparação de uma cultura fúngica em membranas de celofane tratadas para apoiar a formação de colônias e o crescimento radial. Em seguida, mostra o cultivo e preparação das células bacterianas do solo para ensaios de interação. Por fim, ilustra como as células bacterianas...

Estabelecimento de uma Co-cultura Fúngico-Bacteriana para a Formação de Biofilmes

Neste protocolo, é introduzida a fabricação, configuração e operação básica de um biorreator picoliter microfluídico (PLBR) para análise de célula única de microrganismos procarióticos. Microrganismos industrialmente relevantes foram analisados como prova de princípio, permitindo insights sobre taxa de crescimento, morfologia e heterogeneidade fenotípica ao longo de certos períodos de tempo, dificilmente possíveis com métodos convencionais.

Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Defensinas de plantas desempenham um papel importante nas defesas vegetais contra patógenos. Para uma utilização eficaz destes peptides antifúngicos como agentes antifúngicos, compreender seus modos de ação (MOA) é crítica. Aqui, um método de imagem de viver-pilha é descrito para estudar aspectos críticos do MOA destes peptides.

Imagem latente da viver-pilha de células fúngicas para investigar os modos de entrada e localização Subcellular da planta antifúngico defensinas

Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.

Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

Apresentamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida para capturar imagens, analisar e quantificar a cinética de crescimento do fungo filamentoso A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida. Este protocolo pode ser usado em conjunto com microscopia de fluorescência.

Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto

Explore ferramentas microfluídicas para investigar interações fúngicas-microbianas com alta resolução celular. Este método permite visualizar dinâmicas entre fungos e bactérias, contribuindo para a compreensão do microbioma do solo e práticas agrícolas sustentáveis.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

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