Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Utilizando os dispositivos microfluidos apresentados, podemos examinar interações dinâmicas entre fungos e outros micróbios com controle espacial e ambiental preciso, bem como imagens de alta resolução no nível único celular. É importante ressaltar que o crescimento fúngico pode ser confinado e direcionado dentro do canal microfluido. Permitindo a obtenção de imagens de lapso de tempo de alta qualidade.

Portanto, as complexidades das interações fúngica-fúngicas e fúngicas podem ser exploradas. Compreender as interações microbianas fúngicas é um passo essencial na definição e preservação do microbioma do solo. Esse conhecimento pode ser explorado para o desenvolvimento de novos agentes de biocontrole com agricultura sustentável.

Para começar, prepare aproximadamente 40 gramas de poli (dimetilsiloxano)ou PDMs, misturando completamente a base e o agente de cura em uma proporção de 10 a 1 usando uma espátula em um copo plástico limpo. Para remover todas as bolhas de ar, coloque o copo em uma câmara de vácuo por uma hora. Em seguida, usando fita transparente, fixar o molde mestre em um suporte plástico e usar ar filtrado comprimido para remover quaisquer partículas de poeira, em seguida, despeje os PDMs no centro do molde mestre e deixe-o assentar.

Para evitar o assentar partículas de poeira na superfície dos PDMs, cubra livremente o molde mestre com uma tampa plástica, depois transfira o molde mestre para um forno e cure durante a noite a 70 graus Celsius. Depois de remover o molde mestre do forno e permitir que ele esfrie, descasque os PDMs curados longe do molde mestre e da estrutura plástica sem danificar o molde mestre nos PDMs. Em seguida, para manter uma superfície livre de poeira, coloque fita clara sobre os microcanais gravados nos PDMs.

Em seguida, use uma guilhotina montada ou uma lâmina de barbear para cortar os PDMs em lajes conforme designado pelo design. Ao cortar a abertura lateral da laje PDMs usada para o dispositivo de interação bacteriana-fúngica, ou dispositivo BFI, certifique-se de que os microcanais estejam totalmente abertos. No entanto, para as lajes PDMs usadas na montagem do dispositivo de interação fúngico-fúngico, ou FFI, cada canto deve ser aparado para que ele se encaixe em uma placa de Petri de fundo de vidro.

Em seguida, use um cortador de precisão para perfurar furos de entrada ou saída de acordo com o design do dispositivo. Em seguida, submergir as lajes dos PDMs em uma solução de hidróxido de sódio molar de 0,5. Enxágüe as lajes em água destilada dupla estéril antes de transferi-las para uma solução de 70% de etanol.

Depois de remover o etanol e enxaguar as lajes com água estéril duplamente destilada novamente, imergir as lajes em água estéril dupla destilada e sonicato por cinco minutos, em seguida, remova a laje dos PDMs da água, seque-as com ar filtrado comprimido e coloque-as em uma placa de Petri quadrada estéril. Em seguida, incubar a placa de Petri com laje PDMs em um forno a 70 graus Celsius por uma hora. Uma vez que as lajes tenham esfriado em um ambiente livre de poeira, limpe qualquer poeira de sua superfície usando fita adesiva e ar filtrado comprimido.

Para ativar as superfícies das lajes dos PDMs e das placas de Petri de fundo de vidro, que serão posteriormente unidas, coloque-as em um limpador de plasma com as superfícies a serem ativadas voltadas para cima. Depois de remover a laje de PDMs nas placas de Petri do limpador de plasma, uni-los suavemente colocando as superfícies ativadas em contato conformal entre si. Bond BFI e FFI PDMs laje com placas de Petri de 35 milímetros e 55 milímetros de diâmetro, respectivamente para verificar a ligação bem sucedida, tente puxar o laboratório PDMs de sua placa de Petri com pinças.

Visualize o dispositivo cuidadosamente com o olho ou por microscopia genérica para garantir que não haja colapso das entradas ou microcanais. Para condições saturadas de água ou ricas em nutrientes, pipeta 100 microlitres da solução desejada para encher dispositivos BFI imediatamente após a ligação. Para dispositivos FFI, adicione 30 microliters da mídia em cada entrada.

Por fim, adicione 100 a 200 microliters de água dupla destilada estéril à placa de Petri para manter a umidade. No entanto, para condições insaturadas de água, basta adicionar 100 a 200 microliters de água dupla estéril destilada à placa de Petri para manter a umidade. Para a inoculação fúngica, dentro de uma coifa de fluxo laminar, usando um borer de cortiça esterilizado, remova um plugue de ágar de uma colônia na periferia de uma cultura de três dias de idade, garantindo manter intacta a frente de hignêquico em crescimento.

Em seguida, introduza o plugue de ágar na entrada fúngica do dispositivo BFI e/ou FFI com o lado micélio para baixo na frente hiphal orientada para as aberturas microcanais para incentivar a infiltração hifal dos canais. Para o dispositivo FFI, introduza outro plugue de ágar com uma segunda espécie fúngica na entrada oposta. Em seguida, sele a placa de Petri com um filme transparente e incubar a 25 a 28 graus Celsius no escuro até a imagem.

Para a inoculação bacteriana, após a remoção do dispositivo BFI da incubadora, pipeta 10 microliters de uma suspensão bacteriana na entrada bacteriana em um ambiente estéril. Uma vez que a placa de Petri é selada com uma película transparente, armazenado o dispositivo ereto a 25 graus Celsius no escuro até que a imagem comece. Usando este protocolo, a interação entre o fungo Coprinopsis cinerea e a bactéria Bacillus subtilis poderia ser visualizada com sucesso.

Observou-se que, na presença da bactéria, a taxa de crescimento do fungo começou a diminuir drasticamente após cerca de cinco horas de coinoculação. Além disso, a hifa fúngica associada à bactéria tinha uma aparência fina e transparente. A microscopia de fluorescência de lapso de tempo também revelou o colapso da hifafángica após cinco horas de coinoculação com iciclismo bacillus.

No entanto, a partir de seis horas, a população bacteriana também começou a declinar. A visualização das interações fúngicas-fúngicas mostrou que o fusarium graminearum inibiu fortemente o crescimento do Trichoderma rossicum, que ficou evidente usando microscopia de fluorescência. Este protocolo revelou ainda mudanças morfológicas significativas no fungo Verticillium longisporum na presença das bactérias Pseudomonas synxantha e Pseudomonas fluorescens.

A técnica de imagem dinâmica de alta resolução utilizada no estudo também revelou a formação de septa no Fusarium graminearum na presença do fungo Clonostachys rosea. A rotulagem de fluorescência proporcionou a quantificação dinâmica de Clonostachys rosea hyphal proliferação no dispositivo FFI. Esses dispositivos podem ser adaptados e modificados pelo usuário para incorporar diferentes espécies de interesse e abordar suas questões experimentais específicas sobre interações microbianas fúngicas.

Tanto os dispositivos BFI quanto FFI têm empurrado fronteiras científicas, revelando como os fungos propagam sinais de defesa e nutrientes após ataque de fungos, vírus, nematoides e permitindo investigações sobre dispersão bacteriana.