Name: Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a medir o vasorelaxamento endotélio-dependente em aorta de camundongos utilizando miografia tensométrica de pequeno volume. Esta técnica permite avaliar a função vascular com alta reprodutibilidade.

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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (R15HL145646) e da Faculdade de Pós-Graduação da Midwestern University.

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O campo da biologia vascular depende fortemente de ferramentas que ajudam os pesquisadores a avaliar a integridade funcional e estrutural da parede dos vasos sanguíneos. Também requer atenção especial sobre as interações diretas e indiretas entre as três camadas de vasos sanguíneos: a íntima, a mídia e a adventícia. Dentre essas três camadas, a íntima é formada por uma monocamada de células endoteliais e tem uma função muito importante na regulação da saúde vascular e hemostasia.
Está bem esta...

Nas últimas décadas, o sistema de miografia de câmara pequena tem sido usado para medir a reatividade de diferentes camadas de paredes dos vasos sanguíneos em resposta a vários agentes farmacológicos e neurotransmissores em um ambiente ex vivo e em tempo real. A reatividade vascular é um componente importante de um vaso sanguíneo funcional saudável e é fundamental para a regulação do fluxo sanguíneo e da perfusão na vasculatura periférica e cerebral1. Dentro da parede dos vasos sanguíneos, a interação entre as camadas endotelial e muscular lisa é um dos principais determinantes do tônus vascular, que também é constantemente impactado por mudanças estruturais na camada de tecido conjuntivo ao redor da parede dos vasos sanguíneos (adventícia).
A camada endotelial controla o vasomovimento liberando alguns fatores vasodilatadores, incluindo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizador derivado do endotélio (EDHF), ou produzindo agentes vasoconstritores como endotelina-1 (ET-1) e tromboxano (TXA2)2,3,4. Dentre esses fatores, o NO tem sido extensivamente estudado, e seus importantes papéis regulatórios em outras funções celulares críticas, como inflamação, migração, sobrevivência e proliferação, têm sido altamente citados na literatura científica 2,5.
No campo da biologia vascular, a miografia de câmara forneceu aos fisiologistas vasculares e farmacologistas uma ferramenta valiosa e confiável para medir a função endotelial em um sistema semifisiológico rigidamente controlado1. Atualmente, existem dois sistemas de miógrafos diferentes disponíveis para os cientistas: miografia tensométrica (isométrica) de fio (ou pino) e miografia de pressão. Em um sistema de miografia de fio, o vaso sanguíneo é esticado entre dois fios ou pinos, permitindo a medição isométrica do desenvolvimento de força ou tensão na parede do vaso sanguíneo, enquanto a miografia por pressão é uma plataforma preferível para medições de reatividade vascular em artérias de pequena resistência, onde as alterações na pressão arterial são consideradas o principal estímulo para mudanças no tônus vascular e vasomoção. Há um consenso geral de que, para pequenas artérias de resistência, como artérias mesentéricas e cerebrais, a miografia por pressão cria uma condição mais próxima das condições fisiológicas do corpo humano. O miógrafo de câmara pequena pode ser utilizado para vasos com diâmetros muito pequenos (200-500 μm) a vasos muito maiores, como a aorta.
Enquanto o miógrafo de fio é um poderoso sistema para registrar a tensão dos vasos sanguíneos sob condições isométricas, o miógrafo de pressão é um sistema mais apropriado para medir mudanças no diâmetro do vaso em resposta a mudanças nas condições isobáricas. As mudanças de diâmetro no vaso em resposta a mudanças na pressão ou fluxo são muito maiores em uma pequena artéria muscular (arteríola) em comparação com grandes artérias elásticas, como a aorta. Por esses motivos, o miógrafo de pressão é considerado uma ferramenta melhor para pequenos vasos sanguíneos com vasorreatividade substancial1. Um dos outros pontos fortes práticos da miografia tensométrica de câmara de pequeno volume multicâmara é que se pode discernir a contribuição de diferentes mecanismos para a reatividade vascular estudando múltiplos (até quatro) segmentos da mesma artéria e do mesmo animal para reduzir a variabilidade e produzir dados robustos e conclusivos. Também é relativamente fácil de configurar e manter tecnicamente. Vasos de quase qualquer tamanho podem ser estudados com um miógrafo de fio. É uma solução mais econômica para avaliar a função vascular e é uma boa alternativa à miografia por pressão em experimentos em que o comprimento do vaso dissecado é muito curto para o protocolo de miógrafo de pressão.
Este relato fornece um protocolo detalhado para a avaliação da função endotelial no anel aórtico torácico isolado de camundongos utilizando pinos de montagem na técnica de miografia tensométrica de câmara de pequeno volume utilizando o sistema de miógrafo multicâmara DMT-620 (DMT-USA). Este protocolo utiliza um rato C57BL6 macho de 6 meses de idade com um peso médio entre 25-35 g. Felizmente, este protocolo pode ser aplicado a vários tipos e pesos de animais, considerando a ampla gama de tipos de vasos e diâmetros para os quais este protocolo pode ser usado.

<table><tbody><tr><td>Acetilcolina</td><td>SigmaAldrich</td><td>A6625-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C4901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gás Carbogen</td><td></td><td>H103847</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMT 620 Sistema de miógrafo multicâmara</td><td>DMT DMT</td><td>620</td><td>Sistema</td></tr> <tr>de miógrafo multicâmara<td>Fórceps de Dumont</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SigmaAldrich</td><td>E5134-10G</td><td></td></tr><tr><td>glicose</td><td>SigmaAldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7006-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td>LabChart ADI</td><td>Software de aquisição de dados</td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>Volpi</td><td>14363</td><td></td></tr><tr><td>L-Name</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-200-7725</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SigmaAldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td>S6D</td><td>microscópio estéreo</td></tr><tr><td>Zoom NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5886-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de banho de órgão</td><td>DMT</td><td>720MO</td><td></td></tr><tr><td>Fenilepfrina</td><td>SigmaAldrich</td><td>P6126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Bomba</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Instrumentos ADI</td><td>LabChart 8.1.20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit</td><td>Serviços de Microscopia Eletrônica</td><td>24236-10</td><td>kit de elastômero de silicone</td></tr><tr><td>Regulador de tanque</td><td>Fischer Scientific</td><td>10575147</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de banho-maria</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr></tbody></table>

medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume é uma técnica comumente utilizada para avaliar a contratilidade vascular de vasos sanguíneos pequenos e grandes em animais de laboratório e pequenas artérias isoladas do tecido humano. A técnica permite que os pesquisadores mantenham vasos sanguíneos isolados em um ambiente rigidamente controlado e padronizado (quase fisiológico), com a opção de se ajustar a vários fatores ambientais, enquanto desafiam os vasos isolados com diferentes agentes farmacológicos que podem induzir vasoconstrição ou vasodilatação. A câmara miográfica também fornece uma plataforma para medir a reatividade vascular em resposta a vários hormônios, inibidores e agonistas que podem afetar a função do músculo liso e das camadas endoteliais separadamente ou simultaneamente. A parede dos vasos sanguíneos é uma estrutura complexa que consiste em três camadas diferentes: a íntima (camada endotelial), a média (músculo liso e fibras de elastina) e a adventícia (colágeno e outros tecidos conjuntivos). Para obter uma compreensão clara das propriedades funcionais de cada camada, é fundamental ter acesso a uma plataforma e sistema experimental que permita uma abordagem combinatória para estudar todas as três camadas simultaneamente. Tal abordagem exige acesso a uma condição semifisiológica que imitaria o ambiente in vivo em um ambiente ex vivo. A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume forneceu um ambiente ideal para avaliar o impacto de pistas ambientais, variáveis experimentais ou agonistas farmacológicos e antagonistas nas propriedades vasculares. Por muitos anos, os cientistas usaram a técnica do miógrafo tensométrico para medir a função endotelial e a contratilidade do músculo liso em resposta a diferentes agentes. Neste relato, um sistema de miógrafo tensométrico de câmara de pequeno volume é usado para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos. Este relatório se concentra em como a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume pode ser usada para avaliar a integridade funcional do endotélio em pequenos segmentos de uma grande artéria, como a aorta torácica.

O protocolo tensométrico de miografia de câmara pequena explicado aqui é o método padrão para medir a reatividade vascular em artérias pequenas e grandes e permite medições simultâneas da reatividade vascular em até quatro segmentos de vasos sanguíneos do mesmo pequeno animal de laboratório experimental. Neste relato, utilizamos especificamente o sistema para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos (Figura 1). Neste protocolo, segmentos aórticos isolados são montados em uma...

O presente protocolo descreve os conceitos e a aplicação técnica da técnica do miógrafo tensométrico utilizando um sistema de miógrafo multicâmara na avaliação experimental ex vivo da função endotelial da aorta em camundongos.

Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in ...

Demonstramos a miografia isométrica ou tensométrica como o protocolo padrão-ouro para medir a reatividade de pequenos vasos sanguíneos de resistência ou grandes condutos em uma condição fisiológica bem controlada. As medições são altamente reprodutíveis e confiáveis. A técnica é muito valiosa para permitir que os pesquisadores estudem diferentes camadas de vasos sanguíneos separadamente ou investiguem a interação entre diferentes camadas da parede dos vasos sanguíneos simultaneamente.Demonstrando o procedimento estará Robert Folk, o especialista em laboratório de pesquisa do meu laboratório. Comece ligando o banho-maria e ajustando-o a 37 graus Celsius. Coloque dois copos rotulados adequadamente no banho-maria, um com 600 mililitros de solução HEPES-PSS e outro com 150 mililitros de solução rica em potássio.Arejar um copo contendo 300 mililitros de solução de HEPES-PSS com gás carbógeno por pelo menos 10 minutos. Adicione 30 mililitros da solução HEPES-PSS aerada a um tubo de centrífuga de 50 mililitros, rotule adequadamente e coloque-o no gelo. Manter a solução de HEPES-PSS aerada restante no gelo para ser utilizada durante o processo de dissecção da aorta.Ligue a unidade miográfica de quatro câmaras a 5 mililitros de solução HEPES-PSS para cada câmara miográfica e ajuste o calor para 37 graus Celsius. Deixe a solução em cada câmara ser arejada por 30 minutos e verifique se as câmaras atingiram os 37 graus Celsius desejados. Ligue o hardware e o computador de aquisição de dados do miógrafo.Transfira a gaiola torácica excisada dos camundongos eutanasiados para uma placa de Petri revestida de elastômero de silicone transparente cheia de tampão HEPES-PSS aerado a frio e fixe-a em ambos os lados. Sob o microscópio, corte e remova suavemente o coração e a aorta anexada da caixa torácica e transfira para um prato limpo revestido de elastômero de silicone, em seguida, remova suavemente o tecido conjuntivo de gordura e o sangue coagulado da aorta. Usando uma pequena tesoura afiada, disseque e isole toda a aorta a partir da área do arco até o fundo da aorta descendente.Corte a aorta dissecada em quatro segmentos de 2 milímetros cada. Use a mini-régua dentro do prato como referência. Em câmaras que já contenham 5 mililitros de tampão HEPES-PSS aquecido e aerado, deslize cuidadosamente cada um dos segmentos aórticos de 2 milímetros sobre os dois pinos de montagem usando pinças.Ao colocar a câmara de volta na unidade do miógrafo, mova lentamente os pinos para longe, girando o micrômetro no sentido anti-horário para que o segmento aórtico não deslize para fora dos pinos. Devolva cada câmara miográfica à unidade e comece a arejar as câmaras a 37 graus Celsius durante 20 minutos. Escorra as câmaras e adicione 5 mililitros de solução HEPES-PSS fresca, quente e aerada a cada câmara.Se necessário, reajuste as medições de força para ler a tensão ideal de 6 milinewtons. Descanse o tecido por mais 15 a 20 minutos. Abra o software de aquisição de dados.Altere os números de rastreamento de 50 para 1 para 500 para 1 e pressione Iniciar. Antes de iniciar um novo experimento, certifique-se de adicionar o rótulo apropriado no software de aquisição de dados. Escorra as câmaras mais uma vez antes de adicionar 5 mililitros de solução rica em potássio a cada câmara.Drene as câmaras novamente assim que a resposta contrátil à solução com alto teor de potássio atingir um platô para a geração de força. Lave o tecido com a solução de HEPES-PSS três vezes. Adicione 5 mililitros de solução rica em potássio a cada câmara.Escorra as câmaras assim que a resposta contrátil à solução rica em potássio atingir um platô para geração de força e lave o tecido três vezes com HEPES-PSS, depois descanse o tecido por 15 a 20 minutos. Pré-contraia os segmentos aórticos com o agente vasoconstritor PE em uma dose submáxima. Permita que a curva de contração induzida por PE atinja um platô para o desenvolvimento da tensão.Adicionar um platô de desenvolvimento de tensão ao PE em 5 microlitros de doses crescentes de soluções de estoque de trabalho de acetilcolina em intervalos de 3 minutos para estabelecer concentrações finais de acetilcolina de 50 picomolares a 10 micromolares na câmara do miógrafo, conforme descrito no manuscrito do texto. Após completar o experimento de resposta à dose, drenar as câmaras, lavar os segmentos aórticos com solução quente e aerada de HEPES-PSS três vezes e descansar os tecidos por 30 minutos. Depois de descansar os segmentos aórticos por 30 minutos, drene as câmaras e adicione solução fresca e quente de alto teor de potássio a cada câmara, depois drene as câmaras e lave o tecido com solução HEPES-PSS quando a resposta de contração à solução rica em potássio atingir um platô F, como demonstrado anteriormente.Pré-incubar os segmentos aórticos com L-NAME adicionando 10 microlitros da solução de trabalho preparada de 100 milimolares para avaliar a contribuição da produção de óxido nítrico para o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina observado. Sem remover o nome L, adicione a dose submáxima de EP à câmara para induzir a contração aórtica. Espere até que a curva de contração induzida por PE atinja um platô para o desenvolvimento de tensão e, em seguida, adicione acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nanomolares.Aguarde alguns minutos para registrar possíveis alterações no desenvolvimento da força até que o platô formado esteja estável. Escorra as câmaras e lave o tecido com a solução de HEPES-PSS aerada a quente três vezes. Posicione a câmara do miógrafo sob o microscópio e passe suavemente um pequeno fio através do lúmen da aorta.Mova suavemente o fio através do lúmen por um curto período. Corte a aorta em anéis aórticos de 2 milímetros e monte esses anéis na câmara do miógrafo. Defina a tensão ideal em 6 milinewtons e deixe o tecido descansar por 30 minutos em tampão HEPES-PSS quente aerado, depois drene as câmaras e adicione 5 mililitros de solução HEPES-PSS aerada quente e fresca a cada câmara.Zerar a força para todas as câmaras do miógrafo e girar lentamente o micrômetro no sentido anti-horário para aumentar a distância entre os pinos até que a força registrada atinja a tensão ideal desejada para a aorta do rato. Pressione o tecido por mais 15 a 20 minutos na tensão ideal, em seguida, drene as câmaras mais uma vez antes de adicionar 5 mililitros de solução rica em potássio a cada câmara. Escorra as câmaras novamente e lave o tecido com a solução de HEPES-PSS três vezes uma vez que a resposta de contração à solução de íons com alto teor de potássio atinja um platô.Descanse o tecido por 15 a 20 minutos e, em seguida, contraia previamente os segmentos aórticos com EP, o agente vasoconstritor. Quando a força induzida por EP atingir um platô, adicione a concentração submáxima de acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nanomolares. Aguarde 3 minutos para garantir que o platô registrado para o desenvolvimento da força induzida por EP não esteja mudando antes de terminar o experimento.A integridade e a viabilidade de cada vaso isolado foram avaliadas por meio do registro da geração de força contrátil. O pico da força registrada foi posteriormente utilizado para normalizar a geração de força para o mesmo segmento em resposta aos agonistas. As medidas de vasorelaxamento mediadas pelo endotélio mostraram contração mediada pelo músculo liso e geração de força.Quando a contração induzida por EP atingiu um platô, doses crescentes de acetilcolina atingiram o vasorelaxamento máximo no segmento isolado. O inibidor do óxido nítrico L-NAME bloqueou completamente o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina na aorta pré-contraída, indicando que a acetilcolina induz vasorelaxamento aórtico através do aumento da produção de óxido nítrico. Além disso, a remoção da camada endotelial dos segmentos aórticos também bloqueou o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina, ressaltando o papel do endotélio no relaxamento dos vasos sanguíneos.Certifique-se de ser gentil ao manusear, limpar e dissecar o vaso sanguíneo. É fundamental adicionar os agonistas farmacológicos e inibidores com cuidado para não perturbar os anéis dos vasos sanguíneos montados nas câmaras do miógrafo. As informações podem ajudar a projetar experimentos para explorar possíveis abordagens terapêuticas para abordar a disfunção das camadas de um vaso sanguíneo específico.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método automatizado para medições Miografia vigor em artérias mesentéricas isoladas é descrito. Ele emprega um Mulvany-Halpern Auto Myograph fio duplo 510A para determinar as respostas à fenilefrina e cálcio extracelular. O método permite a determinação consistente de respostas isométrica aos agonistas em pequenos vasos de diâmetros de 60 - 300 mm, de forma independente.

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Em Miografia pressão, um pequeno segmento de um vaso intacto é montado sobre duas pequenas cânulas e pressurizado a uma pressão adequada luminal. Aqui, descrevemos o método para medir a resposta vasorelaxation do mouse...

Avaliando Murino Resistência Função Usando Miografia Pressão Arterial

Miografia pressão é utilizado para avaliar a vasoactividade das pequenas artérias que se desenvolvem constrição prolongada quando pressurizado. Este manuscrito proporciona um protocolo detalhado para avaliar em segmentos isolados de pequenas artérias mesentéricas de ratos, vasoactividade e o efeito da pressão intraluminal no diâmetro vascular.

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A disfunção endotelial está associada a diversas doenças e é preditivo de eventos cardiovasculares adversos em seres humanos. Vasodilatação mediada pelo fluxo (FMD) é um método de ultra-som não invasivo de avaliação da função endotelial. As escolhas metodológicas e experiência do operador podem afetar os resultados. Uma abordagem sistemática à febre aftosa em estudos humanos é discutido aqui.

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Descrevemos uma técnica para medir a rigidez aórtica a partir de sua relação pressão-diâmetro in vivo em camundongos. O diâmetro da aorta é registrado por ultrassom e a pressão aórtica é medida de forma invasiva com um cateter de pressão de estado sólido. A pressão arterial é alterada de forma incremental e o diâmetro resultante é medido.

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Sistemas de tele-microscopia são usados para examinar as propriedades funcionais das arteríolas isoladas de tecido adiposo em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos. Esta técnica pode ser usada para examinar fenótipos microvasculares em domínios diferentes de tecido adiposo em seres humanos obesos.

Avaliação da função Microvascular de tecido adiposo humano usando tele-microscopia

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

A técnica de myograph do fio é usada para investigar as funções do músculo liso vascular e tela novas drogas. Nós relatamos um protocolo detalhado para medir a contratilidade isométrica da artéria mesentérica de rato e para a seleção de novos relaxantes do músculo liso vascular.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

Treinamento de alta intensidade em hipóxia é um protocolo que tem sido comprovado para induzir as adaptações vasculares potencialmente benéficas em alguns pacientes e melhorar dos atletas repetiram a capacidade de sprint. Aqui, nós testamos a viabilidade de ratos de formação usando protocolo e identificar essas adaptações vasculares usando ex vivo avaliação de função vascular.

Supramaximal intensidade exercício hipóxica e avaliação da função Vascular em ratos

O protocolo descreve o uso de miografia de arame para avaliar a tensão isométrica transmural de artérias mesentéricas isoladas de camundongos, com especial consideração da modulação por fatores liberados das células endoteliais e dos tecidos adiposos perivasculares.

Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

Aprenda a medir o vasorelaxamento endotélio-dependente em aorta de camundongos utilizando miografia tensométrica de pequeno volume. Esta técnica permite avaliar a função vascular com alta reprodutibilidade.

Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume (Vídeo) | JoVE Journal

Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume

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