Determinando afinidade de ligação (K_D) de anticorpos radiolabelados para antígenos imobilizados

Este método pode determinar a afinidade vinculante de um anticorpo radiolabelado para seu antígeno. Também medirá a especificidade da vinculação. A principal vantagem deste método simples é a caracterização específica da afinidade vinculante apenas do anticorpo radiolabeled sem interferência do anticorpo parental não julgado.

Esta técnica valida quantitativamente a capacidade de um anticorpo radiolabeled se ligar ao seu alvo. Isso é importante para aplicações em imagens nucleares e em terapia nuclear em uma variedade de doenças. Demonstrando o procedimento estará Erika Belitzky, uma associada de pós-graduação do meu laboratório.

Para começar, prepare um tampão de imobilização adicionando 191 miligramas de bicarbonato de sódio e 23,9 miligramas de carbonato de sódio a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 40 mililitros de 18 megaohm de água e dissolva por vórtice. Agora, ajuste o pH para 9.0 antes de levar o volume total para 50 mililitros.

Em seguida, prepare 200 mililitros de tampão de lavagem adicionando 200 mililitros de PBS e 100 microliters de Tween 20 a uma garrafa de 250 mililitros. Também prepare 50 mililitros de tampão de ligação adicionando 50 miligramas de BSA e 25 microliters de Tween 20 a 50 mililitros de PBS e misture por vórtice. Adicione 1,5 gramas de BSA a 50 mililitros de PBS para preparar o tampão de bloqueio e o vórtice suavemente para misturar.

Diluir o antígeno no tampão de imobilização. Em seguida, pegue uma placa de fundo plano, de 96 poços e adicione 100 microliters de antígeno na parte inferior de cada poço de 24 poços em uma matriz de oito por três. Cubra a placa com fita de vedação e incubar a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, lave a placa três vezes com tampão de lavagem. Inverta a placa rapidamente na pia para descartar o líquido e bata a placa em uma pilha de toalhas de papel para remover o excesso de líquido. Em seguida, aos poços que contêm o antígeno, adicione 300 microliters de tampão de lavagem por poço usando uma pipeta multicanal.

Adicione 300 microliters de tampão de bloqueio por poço tanto para poços revestidos de antígeno quanto 24 poços vazios da placa de 96 poços. Em seguida, incubar a placa por uma hora à temperatura ambiente e lavar cada poço da placa três vezes com 300 microliters de tampão de lavagem. Faça diluições seriais três vezes do anticorpo radiolabeled no buffer de ligação para oito linhas designadas como A a H na placa.

Primeiro, calcule o volume de anticorpo radiolabeled necessário para fazer uma solução de 1,2 mililitro da primeira concentração. Em seguida, adicione 800 microliters de tampão de ligação aos tubos de microcentrifuuge rotulados B a H e adicione o volume necessário de buffer de ligação a um tubo de microcentrifuuge rotulado A.Adicione o volume calculado de anticorpo radiolabeled de estoque ao tubo A e vórtice suavemente. Em seguida, gire para baixo usando um mini-microcentrifuuge para coletar todo o líquido na parte inferior do tubo.

Em seguida, adicione 400 microliters de líquido de dois A ao tubo B.Após o vórtice, gire-o para baixo usando um mini-microcentrifuge. Da mesma forma, adicione a solução do tubo B ao tubo C, C a D, até o tubo H.Adicione 100 microliters de cada diluição por poço a três poços imobilizados com antígeno e três poços bloqueados apenas com BSA. Agora, adicione 100 microliters de cada diluição aos tubos de microcentrífugo rotulados como padrão H e salve esses tubos como padrões de anticorpos radiolabeled a serem testados no contador gama.

Incubar a placa por uma hora a 37 graus Celsius com balanço suave. Rotular tubos de microcentrifuus para cada um bem como descrito no manuscrito. Aspire o anticorpo radiolabeled dos poços da placa de 96 poços usando um aspirador de vácuo.

Agora, usando uma pipeta multicanal, adicione 300 microliters de tampão de lavagem a cada poço. Aspire o tampão de lavagem e repita a lavagem mais quatro vezes. Desmonte os poços nos tubos de microcentrifuuagem apropriados.

Conte a radioatividade nos tubos com o antígeno marcado como H1, H2, H3, H3 a A1, A2, A3, e depois com BSA marcado apenas como H4, H5, H6, para A4, A5, A6 usando um contador gama. Amivantamab radiolabeled mostrou vinculação específica para proteínas EGFR e cMET. Afinidades de ligação semelhante também foram retidas por fabs de rádio de braço único ligados às proteínas EGFR e cMET.

As parcelas de ligação de saturação mostraram que quando as concentrações de anticorpos radiolabeled eram muito baixas, a saturação não era alcançada, como indicado pela curva linear. Concentrações de anticorpos radiolabeled que eram muito altos levaram à saturação sem crescimento logarítmico distinto, como mostrado pelo planalto horizontal. Além disso, a alta ligação não específica foi vista devido às altas concentrações de anticorpos radiolabeled.

Este procedimento pode levar várias tentativas para otimizar o intervalo de concentração para cada anticorpo radiolabeled específico. Use dados de resultados negativos para ajudar a projetar experimentos futuros. Uma vez que a afinidade vinculante é conhecida, pode ser usada como referência para outros ensaios in vitro como parte da caracterização de um anticorpo radiolabeled.