Preparação amostral para análise rápida lipídica no cérebro de Drosophila usando desorção a laser assistida por matriz/imagem de espectrometria de massa

A imagem da espectrometria de Maldi MS é uma ferramenta estabelecida e útil para identificar e visualizar a abundância e distribuição lipídica, sem modificação excessiva da amostra. A principal vantagem da imagem de Maldi é sua capacidade de detectar os lipídios in situ sem rotulagem, e analisar grande população de amostras simultaneamente. A prática leva à perfeição.

Certifique-se de praticar bem antes de processar as amostras experimentais reais. Minimize o tempo de preparação da amostra e evite contaminação durante todo o procedimento. Para começar, adicione a temperatura de corte ideal, ou OCT em um criomold plástico a metade da profundidade do molde criogeno, evitando a formação de bolhas.

Deixe o molde em uma superfície plana por vários minutos e depois transfira-o para o gelo seco. Mantenha o criomold plano no gelo seco e permita que o OCT forme uma superfície plana e uniforme. Espere até que o OCT esteja totalmente solidificado no molde.

Use imediatamente as etapas de OCT congelados ou armazene-as a menos 80 graus Celsius. Depois de anestesiar as moscas adultas Usando dióxido de carbono, prepare uma placa de Petri contendo um pedaço de limpeza de laboratório. Use água para umedecer parte da limpeza para reduzir a eletricidade estática.

Mantenha o lenço meio molhado e meio seco. Depois de cortar a cabeça de mosca sob um escopo dissecando um, colecione quatro a cinco cabeças e coloque-as na área seca do lenço de laboratório. Pegue o estágio oct do gelo seco para o microscópio dois.

Transfira imediatamente as cabeças para o estágio DE OUTUBRO e organize-as rapidamente, o que leva em torno de 30 a 60 segundos para evitar o derretimento do OCT. Deixe cerca de um milímetro de espaço em branco em torno de cada cérebro de mosca para garantir suporte adequado a partir do OCT e quatro a cinco milímetros de espaço em branco a partir da borda do bloco para fornecer espaço adequado para lidar com a seção. Coloque o palco OCT de volta no gelo seco e deixe-o ficar por cerca de três minutos para garantir que o estágio OCT permaneça congelado e sólido.

Depois de todas as cabeças de moscas estarem alinhadas, deixe o palco OCT sentar-se em gelo seco por mais cinco a 10 minutos. Transfira o estágio OCT do gelo seco para uma superfície plana e, em seguida, adicione rapidamente uma grande quantidade de composto OCT para cobrir todas as amostras e encher todo o criomold, que leva cerca de três segundos. Transfira imediatamente o criomold de volta para gelo seco e congele todo o bloco OCT contendo os tecidos incorporados.

Deixe o palco oct sentar no gelo seco por mais cinco a 10 minutos. Rotule as amostras na margem do criomold e armazene as amostras congeladas a menos 80 graus Celsius até estar pronta para a secção. Confirme o lado codificado da ITO testando a condutividade dos slides ITO usando um conjunto de medidor de volts à resistência.

Marque o lado com uma medida de resistência como o lado para aderir o tecido. Rotule-o e coloque sempre uma limpeza de laboratório na parte inferior do slide para evitar contaminação por lâminas. Em seguida, deixe os tecidos se equilibrarem na câmara criostat por 30 a 45 minutos.

Limpe o criostat, de preferência com 70% de etanol. Limpe a placa de rolo no estágio e remova as lâminas usadas. Use lenços limpos adicionais para garantir que o etanol tenha evaporado e que todas as superfícies estejam secas antes do início da secção.

Em seguida, ajuste a temperatura da cabeça da câmara de criostat de acordo com o tipo de tecido. Monte o tecido no suporte da amostra usando OCT. Tenha cuidado para usar OCT suficiente para cobrir a base do bloco DE OUTUBRO e montar o bloco o mais plano possível.

Coloque uma lâmina limpa no palco e bloqueie-a. Posicione a cabeça do espécime em direção ao estágio conforme necessário para alcançar o ângulo de corte desejado. Em seguida, comece o corte em seções grossas até que a região de interesse seja encontrada.

Revise constantemente as peças extras com um pincel de artista pré-resfriado para manter o palco limpo. Ajuste ligeiramente a temperatura da câmara conforme necessário e altere a espessura das seções para 10 a 12 micrômetros uma vez que a região desejada seja atingida. Colecione cuidadosamente a seção desejada.

Pegue um slide de ITO de temperatura ambiente e posicione-o sobre a seção. Aproxime-se da seção suavemente e adere ao slide sem deixar rastros no estágio criostat. Coloque o slide de lado em um rack ou limpe o laboratório fora do criostat entre as coleções de várias seções.

Se a comparação entre diferentes amostras da mesma coorte for desejada, coloque as seções de várias amostras em um único slide para que possam ser analisadas simultaneamente para minimizar a variação. Se necessário, separe a dois slides, pois o suporte de destino Maldi pode acomodar dois slides em uma única corrida. Transporte os slides em uma caixa de vácuo para um desiccate com descara como a camada inferior.

Dirija os slides sob um vácuo por 30 a 60 minutos e, em seguida, prossiga para o depoimento da matriz. Use dois cinco ácidos benzoicos dihidroxi, ou DHB, na água do metanol como matriz. Coloque os slides em um transporte deslizante e sele firmemente a abertura com o filme de cera.

Feche com o saco zip. Coloque-o em outro saco zip contendo dessecante. Rotule o exterior e envie a amostra para instalações do núcleo maldi com olhos secos adequados.

Para a deposição matricial, use 40 miligramas por mililitro de DHB e água de metanol como matriz e pulverize-o usando um pulverizador automático de matriz HTX M5. Use pressão de gás nitrogênio de 10 PSI. Use um tempo de voo Maldi, instrumento MS e modo íon positivo para adquirir um espectro de massa.

Calibrar o instrumento detectando 0,5 microliters de emulsão de fósforo vermelho em aceto Nitro nos slides ITO. Use-o para calibrar o instrumento na faixa de massa 100 a 1000 MZ, aplicando uma curva de calibração quadrática. Defina os diâmetros do ponto laser para médio, pois é o perfil de feixe modulado para largura de raster de 40 micrômetros, e reúna dados de imagem somando 500 tiros em uma taxa de repetição de laser de 1000 hertz por posição de matriz.

Em seguida, registos os dados espectrais. Realize a análise de dados de imagem usando a normalização quadrada média da raiz para gerar imagens de íons em uma largura de banda de mais menos 0,10 Dalton. Alinhe os espectros tanto do OCT quanto do tecido cerebral do mesmo experimento usando o software para avaliar os picos sobrepostos na interferência de supressão de íons do OCT.

Por fim, processe as lâminas MALDI contendo as amostras de tecido por hematoxilina e eosina, ou mancha de H e E. Imagens da análise de Maldi MS revelaram uma diminuição geral do conteúdo lipídedo no cérebro mutante nocaute LPR1. As seções cerebrais adultas manchadas por H e E são mostradas aqui.

As espécies lipídicas, seus respectivos valores MZ e as escamas do mapa de calor também são indicadas nesta imagem. A dobra média de redução no mutante de nocaute LPR1 em comparação com os controles de pelo menos quatro réplicas biológicas, são mostrados como números próximos às setas. O espectro de massa da região de OCT em branco selecionada na região do tecido cerebral tanto do controle quanto das moscas mutantes são mostrados na faixa de MZ1 a 1000 e MZ520 a 900.

A interferência de OCT está associada tanto aos fenômenos de supressão de íons quanto a problemas de sinal sobrepostos. Para manter a fidelidade dos dados lipidómicos, a preparação adequada da amostra, a dissecção e a secção criogeno são cruciais. Após a realização do experimento Maldi, as identidades dos lipídios podem ser verificadas através do LCMS, também conhecido como cromatografia líquida, lipodomia baseada em espectrometria de massa.

Esta técnica ganha insights moleculares sobre a homeostase dos lipídios cerebrais usando o poderoso sistema de modelo macio que abre caminho para entender as mudanças metabólicas relacionadas à doença humana no cérebro.