Name: Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a preparar fatias pulmonares de precisão de camundongos para estudar a contratilidade do músculo liso em vias aéreas e vasos pulmonares. Este modelo ex vivo preserva a arquitetura tecidual e permite análises mecanísticas detalhadas da fisiologia pulmonar.

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Este trabalho é apoiado por subvenções do NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts. Foram utilizados camundongos machos do tipo selvagem C57/B6, com 8 semanas de idade, para o presente estudo.
1. Preparação experimental
<ol><li>Prepare a solução de trabalho.<ol>
<li>Prepare a solução de sal balanceado 1x Hank 's Balanced (HBSS, com Ca2+ e Mg2+, e pH balanceado com HEPES de 20 mM, veja Tabela de Materiais). Use a solução HBSS para preparar e processar o PCLS. Mantenha a solução HBSS fria no gelo ao preparar PCLSs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o meio de cultura do PCLS complementando o Medium De Águia Modificada de Dulbecco e o F-12 (DMEM-F12) com um agente antimíctico antibiótico (proporção de volume de 1:100, ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Prepare 1,5% de agarose e 6% de solução de gelatina.<ol>
<li>Misture o baixo ponto de fusão (LMP) em pó de agarose ou gelatina (ver Tabela de Materiais) com a solução HBSS separadamente em tubos de centrífugas estéreis de 15 mL (ou tubos de 50 mL se o volume da solução >10 mL) até as concentrações finais. NOTA: Volume total de solução agarose = 5 mL/mouse x número de ratos; solução de gelatina = 2 mL/mouse x número de ratos.</li>
		<li>Aqueça os tubos da solução em água fervente até que o pó se dissolva completamente. Mantenha as soluções de agarose e gelatina em um banho de água de 42 °C. NOTA: Uma lâmpada de aquecimento na mesa de dissecção pode ser útil para manter o ambiente operacional aquecido e evitar que a solução agarose se solidifique antes de ser injetada no pulmão do camundongo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Submergir todas as ferramentas de dissecção, incluindo um par de tesouras dissecando, dois pares de fórceps micro-dissecção curvados, e um par de fórceps hemostáticos em 70% de solução de etanol por pelo menos 20 minutos para esterilização.</li>
	<li>Mantenha um vibratome pronto (ver Tabela de Materiais) para secionar o tecido pulmonar em fatias finas.</li>
	<li>Mantenha um microscópio de contraste de fase invertido com uma câmera CCD para avaliar as respostas contratuais das vias aéreas ou vasculares e um microscópio confocal de varredura a laser personalizado (ver Tabela de Materiais) para avaliar a sinalização ca2+ em SMCs pulmonares18.</li>
</ol>2. Inflação de pulmões de camundongos com solução de agarose e gelatina
<ol><li>Eutanize o rato.<ol>
<li>Coloque o mouse em uma câmara de plástico (cerca de 750 cm3) com 5% de isoflurane. Mantenha o rato na câmara até que ele pare de respirar por pelo menos 1 min. NOTA: Outros métodos primários de eutanásia, como a injeção intraperitoneal de cetamina (240 mg/Kg) e xilazina (32 mg/Kg)19 ou pentobarbital (0,3 mL)20, podem ser aplicados como alternativas à isoflurano inalada.</li>
		<li>Coloque o corpo do rato em uma placa de dissecção na posição supina. Fixar o corpo em posição fixando a cauda, as patas dianteiras e a cabeça com agulhas de seringa de 25 G, e higienize o corpo com 70% de spray de etanol.</li>
		<li>Corte o abdômen do rato com uma tesoura cirúrgica (incisão, ~2 cm de comprimento x 2 cm de largura). Então, corte a aorta abdominal para esgotar o volume sanguíneo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infle os lóbulos pulmonares seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Abra a cavidade torácica cuidadosamente ao longo do esterno e da caixa torácica inferior bilateral acima do diafragma, e observe o colapso dos lobos pulmonares quando a cavidade torácica se abrir.</li>
		<li>Remova parte das caixas torácicas ventrais bilaterais para expor o coração. Evite danos pulmonares apontando a ponta afiada da tesoura para longe do tecido pulmonar.</li>
		<li>Use fórceps para separar o timo e o tecido mole no pescoço do rato para expor a traqueia.</li>
		<li>Corte um pequeno orifício (1,2 mm de diâmetro) na extremidade superior da traqueia permitindo a passagem da ponta de um cateter IV em forma de Y de 20 G (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Conecte uma porta adaptadora do cateter em forma de Y com uma seringa de 3 mL pré-preenchida com 0,5 mL de ar, e a outra porta com uma seringa de 3 mL pré-preenchida com 2 mL de solução agarose quente de 1,5% (42 °C).</li>
		<li>Injete a solução agarose para encher o cateter e, em seguida, empurre o cateter através da abertura pré-cortada na traqueia por 5-8 mm de comprimento.</li>
		<li>Injete lentamente a solução agarose em torno de 1 mL/5 s. O pulmão se expandirá ao longo do eixo proximal-distal. Pare a injeção quando a borda de cada lobo pulmonar estiver inflada. NOTA: Não insinflar demais o pulmão, pois isso pode rompê-lo. O volume de solução agarose para inflar todo o pulmão de um camundongo adulto jovem é de cerca de 1,3 ± 0,1 mL.</li>
		<li>Injete 0,2-0,3 mL de ar da outra seringa para empurrar a agarose residual no cateter e nas vias aéreas condutoras para o espaço alveoli distal.</li>
		<li>Corte feche a traqueia com um par de fórceps hemostáticos curvos (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enchi a vasculatura pulmonar.<ol>
<li>Encha uma seringa de 1 mL com gelatina quente de 6%. Conecte-se a um cateter de veia do couro cabeludo da agulha, enchi o cateter com solução de gelatina e, em seguida, puna o ventrículo direito perto da parede inferior com a agulha.</li>
		<li>Empurre a agulha para dentro do ventrículo direito por 2-3 mm de comprimento e aponte a ponta da agulha para a artéria pulmonar principal.</li>
		<li>Injete 0,2 mL de solução de gelatina lentamente no ventrículo direito e vasos arteriais pulmonares. NOTA: Os lóbulos pulmonares parecem ligeiramente mais pálidos com a inflação de gelatina apropriada.</li>
		<li>Mantenha a agulha no lugar por 5 minutos após a injeção, esfrie os lóbulos pulmonares derramando solução HBSS gelada no coração e no pulmão, em seguida, coloque o corpo com a placa de dissecção em uma geladeira de 4 °C ou no gelo por um total de 10 minutos.</li>
		<li>Remova o pulmão e o coração do camundongo dos tecidos conjuntivos circundantes com uma tesoura. Em seguida, separe cada lobo pulmonar e mantenha-os na solução HBSS no gelo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Secção de lóbulos pulmonares para fatias finas
<ol><li>Apare e anexe o lobo pulmonar na parte superior da coluna do espécime com supercola, e oriente o lobo (Figura 1A,B) para permitir que a direção de corte seja perpendicular à maioria das vias aéreas da hila até a superfície pulmonar.</li>
	<li>Use um vibratome com uma lâmina de barbear fina fresca para cortar o lobo pulmonar em fatias de 150 μm. Colete as fatias em placas de Petri estéreis de 100 mm pré-preenchidas com solução HBSS fria. NOTA: Defina a velocidade de movimento da lâmina apropriada e a frequência de oscilação antes de iniciar o corte. Uma configuração típica para um Compresstom é o nível de velocidade 4 e o nível de oscilação 4.</li>
	<li>Transfira fatias para pratos de Petri recheadas com meio de cultura DMEM/F-12 (20 fatias/15 mL médio/prato) e mantenha-as em uma incubadora de 37 °C durante a noite antes dos experimentos. NOTA: Os PCLSs do mouse podem ser mantidos na cultura por cerca de 7 dias sem perder as respostas contraídas das vias aéreas17. A longevidade das artérias pulmonares não foi minuciosamente avaliada. Em nossa observação, eles mantêm estrutura intacta e vasoreação por pelo menos 3 dias no meio DMEM/F12. Para armazenamento a longo prazo, os PCLSs do mouse podem ser colocados em criovias preenchidas com meio DMEM/F12 contendo 10% de DMSO (5 fatias em 1 mL médio por frasco), congelados em um recipiente recheado de álcool isopropílico a -80 °C durante a noite e criopreservado em nitrogênio líquido por semanas a21 meses.</li>
</ol>4. Análise das respostas contratuais das vias aéreas e artérias intrapulmonares
<ol><li>Coloque PCLSs em uma placa de cultura de 24 poços preenchida pelo HBSS, uma em cada poço. Localize o PCLS no meio do poço e remova a solução HBSS com uma pipeta.</li>
	<li>Encontre as vias aéreas e o vaso alvo na fatia sob o microscópio, em seguida, cubra a fatia usando uma malha de nylon com um orifício central pré-cortado (2-3 mm de diâmetro) para expor a área alvo.</li>
	<li>Coloque uma lavadora de metal oca em cima da malha para segurar as fatias no lugar (Figura 2A).</li>
	<li>Adicione 600 μL de solução HBSS para submergir o PCLS. Descanse a fatia por 10 minutos, depois grave as imagens da linha de base das vias aéreas ou embarcações.</li>
	<li>Induzir as vias aéreas ou contração vascular, sucundo cautelosamente a solução HBSS em branco com uma pipeta e adicionando 600 μL de HBSS com um agonista, como 1 μM de metanfetamina (MCh) ou 10 nM de endotelina (ver Tabela de Materiais). NOTA: A estimulação de KCl como padrão de configuração de ferramenta não é necessária antes da exposição à methacholina ou à endotelina. 100 mM de estimulação de KCl nas vias aéreas de camundongos apenas induz uma contração de vias aéreas pequenas e irregulares (10%-15%)20. Da mesma forma, uma estimulação de methacholina priming não é obrigatória, pois confirmamos que o mesmo agonista, por exemplo, methacholina ou serotonina, desencadeia contração semelhante das vias aéreas nas primeiras e repetitivas exposições20,22.</li>
	<li>Observe a reação sob o microscópio até que a mudança da área luminal atinja um estado de equilíbrio e, em seguida, regisine as vias aéreas ou imagens vasculares para análise.</li>
	<li>Remova a solução MCh ou endothelin com uma pipeta e adicione uma nova solução HBSS de 600 μL com a mesma concentração agonista e relaxante; observar e registrar as vias aéreas ou relaxamento vascular.</li>
	<li>Quantifique as vias aéreas ou a reação vascular seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Carregue as imagens para o software livre patrocinado pelo NIH FIJI.</li>
		<li>Selecione a Seleção polígona na barra de ferramentas para delinear as vias aéreas ou lúmen vascular em cada quadro.</li>
		<li>Escolha Analisar > definir medidas > área.</li>
		<li>Escolha Analisar > Medida para quantificar a área de interesse. Os resultados são mostrados em uma janela separada para análise estatística.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analisando a sinalização ca2+ das vias aéreas ou SMCs vasculares
<ol><li>Prepare o tampão de carregamento de tingimento Ca2 +.<ol>
<li>Dissolver ca2+ corante, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (ver Tabela de Materiais), 50 μg (um frasco) com 10 μL de DMSO.</li>
		<li>Dissolva 0,2 g de pó Plurônico F-12 (ver Tabela de Materiais) em 1 mL de DMSO para gerar uma solução plurônica de 20%.</li>
		<li>Misture 10 μL de solução plurônica de 20% com 10 μL de solução ca2+ corante-DMSO.</li>
		<li>Faça o tampão de carregamento de corante Ca2+ adicionando 20 μL da mistura a 2 mL de solução HBSS com 200 μM de sulfobromophthalein (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque 15 PCLSs de mouse em 2 mL de tampão de carregamento Ca2+ e incubar a 30 °C por 1h. Em seguida, mova as fatias para 2 mL de solução HBSS com 100 μM de sulfobromophthalein por um adicional de 30 min para desestrificação de corante fluorescente à temperatura ambiente.</li>
	<li>Detecte a sinalização ca2+ de SMCs.<ol>
<li>Coloque fatias carregadas de tinta Ca2+ em um copo de tampa grande.</li>
		<li>Encha uma seringa de 3 mL com graxa de silicone de alto vácuo. Esprema a graxa através de uma agulha de 18 G sem cortes para desenhar duas linhas paralelas através do vidro de cobertura acima e abaixo da fatia.</li>
		<li>Cubra a fatia usando uma malha de nylon entre duas linhas de graxa. Coloque o segundo vidro de cobertura em cima da malha para gerar uma câmara selada por graxa nas laterais (Figura 3A). NOTA: A malha de nylon é essencial para manter a fatia presa ao deslizamento de cobertura inferior e, assim, ficar dentro da distância de trabalho de um objetivo invertido de alta magnitude, como óleo de 40x.</li>
		<li>Adicione HBSS ou solução agonista na câmara de uma extremidade, pipetando manualmente ou através de um sistema de perfusão. Remova o fluido da câmara sucumbindo da outra extremidade com papel de tecido ou vácuo no caso de perfusão contínua de fluido.</li>
		<li>Coloque a câmara PCLS no estágio do microscópio. Detecte a sinalização Ca2+ do SMC23 com um microscópio confocal de varredura ressonante personalizado com uma taxa de varredura a laser de 15 ou 30 imagens/s. NOTA: Alternativamente, um microscópio confocal de varredura a laser comercial de alta velocidade, amplamente disponível no momento, pode ser aplicado no ensaio de sinalização Ca2+ de SMCs pulmonares em PCLS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifique a fluorescência Ca2+ em SMCs.<ol>
<li>Carregue a sequência de imagem gravada para FIJI e escolha a escala de cinza Tipo > de imagem > 8 bits.</li>
		<li>Selecione a Seleção Retângulo na barra de ferramentas e defina uma região de interesse de 5 pixels x 5 pixels (ROI) em uma célula muscular lisa.</li>
		<li>Escolha Analisar > definir medidas > Valor cinza médio , representando a intensidade de fluorescência ca2 +.</li>
		<li>Se a posição de um ROI mudar com contração de SMC, escolha Analisar > Medir o quadro de intensidade fluorescente Ca2+ .</li>
		<li>Se o ROI do SMC permanecer em uma posição semelhante em uma pilha de imagens, escolha Image > Stacks > Measure stack of the Ca2+ fluorescente intensity. NOTA: Uma macro escrita sob medida pode ser conectada para rastrear o ROI dentro do SMC quando ele se move com contração em uma pilha de imagens e mede automaticamente a intensidade ca2+ (valor cinza) do ROI quadro a quadro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A preparação do PCLS envolve várias etapas críticas. Em primeiro lugar, é essencial inflar o lobo pulmonar de forma homogênea para evitar a variação da rigidez tecidual da distribuição desigual da ágarose. Como o líquido agarose rapidamente géis em cateteres finos ou vias aéreas a uma temperatura abaixo de 37 °C, o defeito de enchimento resultante no campo pulmonar distal poderia aumentar a disparidade de rigidez do tecido pulmonar e causar ruptura de tecido durante a seção vibratome. Portanto, manter a solução de agaros...

A célula muscular lisa (SMC) é um tipo de célula estrutural importante no pulmão, residindo principalmente na parede de mídia das vias aéreas e vasos pulmonares. As SMCs contraem para alterar o calibre luminal, regulando assim o fluxo de ar e sangue 1,2. Portanto, a regulação conjuntura de SMCs é essencial para manter a homeostase da ventilação de ar e circulação pulmonar. Em contraste, a contratilidade aberrante do SMC provoca vias aéreas obstrutivas ou doenças vasculares pulmonares como asma e hipertensão arterial pulmonar. No entanto, a avaliação funcional das SMCs pulmonares tem sido desafiada pelo acesso limitado ao tecido pulmonar, especialmente aquelas pequenas vias aéreas e microvexes na parte distal do pulmão 2,3. As soluções atuais recorrem a ensaios indiretos, como medir a resistência ao fluxo de ar pela Flexivent para refletir a constrição das vias aéreas e verificar a pressão arterial pulmonar pelo cateterismo cardíaco direito para avaliar a vasocontração pulmonar 4,5. No entanto, esses ensaios indiretos têm múltiplas desvantagens, como ser confundido por fatores estruturais, não captar a diversidade espacial das vias aéreas ou respostas vasculares em toda a escala pulmonar 6,7, e a inaptidão para o estudo mecanicista da regulação contratil no nível celular. Portanto, abordagens alternativas utilizando células primárias isoladas, tiras musculares de traqueia/brônquico 8,9, ou grandes segmentos vasculares10 foram aplicadas para o estudo SMC in vitro. No entanto, esses métodos também têm limitações. Por exemplo, uma rápida adaptação fenotípica dos SMCs primários na condiçãode cultura 11,12 torna problemático extrapolar achados da cultura celular para configurações in vivo. Além disso, o fenótipo contracttil de SMCs nas vias aéreas proximais isoladas ou segmentos vasculares pode não representar as SMCs no pulmão distal 6,7. Além disso, a medição da força muscular no nível do tecido permanece dissociada de eventos moleculares e celulares que são essenciais para uma visão mecanicista sobre a regulação contratil.
A fatia pulmonar cortada com precisão (PCLS), uma seção de tecido pulmonar vivo, fornece uma ferramenta ex vivo ideal para caracterizar SMCs pulmonares em um microambiente quase in vivo (ou seja, arquitetura multicelular preservada e interação)13. Desde que os Drs. Placke e Fisher introduziram pela primeira vez a preparação de fatias pulmonares de pulmões de ratos e hamsters inflados pela agarose nosanos 14,15, essa técnica tem avançado continuamente para fornecer aos PCLSs maior qualidade e maior versatilidade para pesquisas biomédicas. Uma melhora significativa é o aprimoramento da preservação arterial pulmonar por infusão de gelatina, além da inflação pulmonar com agarose através da traqueia. Como resultado, tanto as vias aéreas quanto as artérias pulmonares são mantidas intactas no PCLS para avaliação ex vivo 16. Além disso, o PCLS é viável por um tempo prolongado na cultura. Por exemplo, os PCLSs do mouse não tiveram nenhuma mudança significativa na viabilidade celular e metabolismo por um mínimo de 12 dias na cultura, bem como, eles mantiveram a contração das vias aéreas por até 7 dias17. Além disso, o PCLS mantém vias aéreas ou embarcações de tamanho diferente para ensaios de contração e relaxamento. Além disso, a sinalização intracelular Ca2+ de SMCs, fator determinante da contratilação celular, pode ser avaliada com corantes de repórter Ca2+ retratados por um microscópio confocal ou de 2 fótons13.
Considerando a ampla aplicação do modelo de camundongos em pesquisa pulmonar, um protocolo detalhado é descrito aqui para a preparação do PCLS do rato com vias aéreas intactas e artérias intrapulmonares para pesquisa pulmonar ex vivo . Utilizando os PCLSs preparados, demonstramos posteriormente como avaliar as vias aéreas e as respostas arteriais pulmonares a estímulos constritivos ou relaxantes. Além disso, também são descritos o método de carregamento do PCLS com corante de repórter Ca2+ e, em seguida, a sinalização ca2+ de SMCs associadas a respostas contratuais ou relaxantes.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéreis de 15 mL</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>BD</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéreis de 50 mL</td><td>Celltreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>Acetil-beta-metacolina</td><td>Millipore Sigma</td><td>62-51-1</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-anitmicótico</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Nikon</td><td>Nikon Ds-Ri2 camera</td><td></td></tr><tr><td>Cover glassess</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td> confocal de varredura a laser personalizado <td>Detalhes em Referência 18</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-092-CM</td><td></td></tr><tr><td>Endotelina 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação fina</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9702861</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>14025092</tr><tr><td>Pinça hemostática</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-117</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de silicone de alto vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>146355d</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Arruelas de metal</td><td>Home Depot Product Authority</td><td>800442</td><td>Everbilt Arruelas planas #10</td></tr><tr><td>Pinça de micro-dissecação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de veias do couro cabeludo com agulha (25 G)</td><td>EXELINT</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>NOC-5</td><td>Cayman Chemical</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Fornecimento de componentes</td><td>de malha de nylon</td><td>U-CMN-300</td><td></td></tr><tr><td>Oregon verde 488 BAPTA-1 AM</td><td>Life Technologies</td><td>o-6807</td><td></td></tr><tr><td>Contraste de fase microscópio</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Thermo Fisher</td><td>P-6867</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Personna</td><td></td><td>Personna Double Edge Razor Blades em embalagem branca 100 contagens</td></tr><tr><td>Sulfobromophthalein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0252</td><td></td></tr><tr><td>Supercola</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td>Cola Krazy, Multiuso</td></tr><tr><td>Ultrapure low ponto de fusão agarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Precisionary</td><td>VF 310-0Z</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de resfriamento Vibratome</td><td>Precisionary</td><td>SKU-VM-CB12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de amostra de vibratome</td><td>Precisionary</td><td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Cateter IV em forma de Y</td><td>BD</td><td>383336</td><td>BD Cateter IV fechado Saf-T-Intima</td></tr></tbody></table>

utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

As células musculares lisas (SMC) mediam a contração das vias aéreas e da artéria intrapulmonar para modificar a resistência ao fluxo de ar e a circulação pulmonar, respectivamente, desempenhando um papel crítico na homeostase do sistema pulmonar. A desregulamentação da contralução da SMC contribui para várias doenças pulmonares, incluindo asma e hipertensão pulmonar. No entanto, devido ao acesso limitado aos tecidos e à falta de sistemas culturais para manter os fenótipos in vivo SMC, os mecanismos moleculares subjacentes à contratlidade SMC desregulamentada nessas doenças permanecem totalmente identificados. A fatia pulmonar de corte de precisão (PCLS) oferece um modelo ex vivo que contorna essas dificuldades técnicas. Como uma seção de tecido pulmonar vivo e fino, o PCLS retém O SMC em ambientes naturais e permite o rastreamento in situ da contração do SMC e sinalização intracelular ca2+ que regula a contração do SMC. Aqui, é fornecido um protocolo de preparação pcls detalhado do mouse, que preserva vias aéreas intactas e artérias intrapulmonares. Este protocolo envolve dois passos essenciais antes de submeter o lobo pulmonar ao corte: inflar as vias aéreas com ponto de fusão baixo agarose através da traqueia e enchimento de vasos pulmonares com gelatina através do ventrículo direito. O PCLS preparado usando este protocolo pode ser usado para bioensaio para avaliar a regulação contraítária de CA2+mediada da SMC tanto nas vias aéreas quanto nos compartimentos arteriais intrapulmonares. Quando aplicado a modelos de camundongos de doenças respiratórias, este protocolo permite a investigação funcional do SMC, fornecendo assim uma visão do mecanismo subjacente da desregulamentação da contração da SMC em doenças.

Preparação do MOUSE PCLS preservando vias aéreas e artérias intrapulmonares intactas Um PCLS de 150 μm de espessura foi observado sob o microscópio de contraste de fase invertido. Nos pulmões do rato, as vias aéreas condutoras são acompanhadas por artérias intrapulmonares, indo do hilus ao pulmão periférico. Um pacote representativo de artérias aéreas pulmonares em um PCLS de rato é mostrado na Figura 2B. As vias aéreas podem ser facilmente identificadas por células epite...

O presente protocolo descreve a preparação e utilização de fatias pulmonares cortadas com precisão do rato para avaliar as vias aéreas e a contratilidade muscular liso arterial intrapulmonar em um ambiente quase in vivo .

Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

O PCLS apoia a avaliação da atividade celular lisa das vias aéreas e vasculares em um ambiente tecidual quase intacto, fornecendo assim um modelo ex vivo inestimável para pesquisa pulmonar. Em termos de pesquisa muscular suave, as fatias pulmonares cortadas com precisão preservam o fenótipo in vivo de células musculares lisas e sua interação com estruturas circundantes, permitindo o acesso a células musculares lisas, o que é importante para um estudo mecanicista no nível celular. Para começar, coloque o corpo do rato em uma placa de dissecção na posição supina.Fixar a cauda, as patas dianteiras e a cabeça com agulhas de seringa 25G e higienizar o corpo com 70% de etanol. Abra cuidadosamente a cavidade torácica ao longo do esterno e da caixa torácica inferior bilateral acima do diafragma. Em seguida, aponte a ponta afiada da tesoura para longe do tecido pulmonar e remova parte das caixas torácicas ventrais bilaterais para expor o coração.Observe que os lobos pulmonares entram em colapso quando a cavidade torácica se abre. Use uma tesoura para remover tecido mole no pescoço do rato para expor a traqueia. Na extremidade superior da traqueia faça um pequeno orifício de diâmetro de 1,2 milímetros que deve permitir a passagem de uma ponta de cateter IV em forma de Y de 20G.Conecte uma porta adaptadora do cateter em forma de Y com uma seringa de 3 mililitros pré-preenchida com 0,5 mililitros de ar e a outra porta com uma seringa de 3 mililitros pré-preenchida com 2 mililitros de solução de 1,5% agarose aquecida a 42 graus Celsius. Injete a solução agarose para encher o cateter e, em seguida, empurre o cateter através da abertura para a traqueia para 5 a 8 milímetros. Injete lentamente a solução agarose a uma taxa de 1 mililitro por 5 segundos.Observe que o pulmão se expande ao longo do eixo proximal para distal. Pare a injeção quando a borda de cada lobo pulmonar estiver inflada. Em seguida, injete 0,2 a 0,3 mililitros de ar da outra seringa para empurrar a agarose residual em vias aéreas condutoras para o espaço alveoli distal.O clipe fechou a traqueia com um par de fórceps hemostáticos curvos. Para enchir a vasculatura pulmonar, encha uma seringa de 1 mililitro com gelatina quente de 6% e conecte-a a um cateter de veia do couro cabeludo. Enchimento do cateter com solução de gelatina e, em seguida, puna o ventrículo direito perto da parede inferior com a agulha.Empurre a agulha por 2 a 3 milímetros no ventrículo direito e aponte a ponta da agulha para a artéria pulmonar principal. Injete aproximadamente 0,2 mililitros de solução de gelatina lentamente no ventrículo direito e vasos arteriais pulmonares. Mantenha a agulha no lugar por cinco minutos após a injeção e esfrie os lóbulos pulmonares derramando solução hbss gelada no coração e pulmão e coloque o corpo em uma geladeira.Após esta etapa, remova o pulmão e o coração do camundongo dos tecidos conjuntivos circundantes com uma tesoura. Em seguida, separe cada lobo pulmonar e mantenha-os na solução HBSS no gelo. Apare o lobo pulmonar e oriente-o de modo que a direção de corte seja perpendicular à maioria das vias aéreas da hila até a superfície pulmonar.Coloque-o em cima da coluna do espécime com super cola. Use um vibratome com uma lâmina de barbear fina fresca para cortar o lobo pulmonar em fatias de 150 micrômetros. Colete as fatias em pratos Petri estéreis pré-preenchidos com solução HBSS fria.Transfira as fatias para pratos Petri recheados com meio de cultura DMEM/F-12. Coloque os pratos em uma incubadora Celsius de 37 graus durante a noite antes dos experimentos. Coloque uma única fatia pulmonar cortada com precisão em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços cheia de HBSS.Localize a fatia no meio do poço e, em seguida, remova a solução HBSS com uma pipeta. Sob um microscópio, encontre as vias aéreas e o vaso alvo na fatia e cubra-a usando uma malha de nylon com um buraco central pré-cortado para expor a área do vaso das vias aéreas alvo. Coloque uma arruela de metal oca em cima da malha para segurar as fatias no lugar.Em seguida, adicione 600 microliters de solução HBSS para submergir as fatias. Após 10 minutos, grave as imagens da linha de base. Para induzir as vias aéreas ou contração vascular, remova cautelosamente a solução HBSS com uma pipeta e adicione 600 microliters de HBSS com um agonista.Para preparar o tampão de carregamento de corante de cálcio, primeiro dissolva 50 microgramas de corante com 10 microliters de DMSO e 0,2 gramas de pó Plurônico F-12 em 1 mililitro de DMSO. Misture 10 microlitadores da solução Plurônica com 10 microliters de solução de corante de cálcio. Adicione esta mistura a 2 mililitros de solução HBSS contendo 200 micromolar de sulfobromophthalein.Em seguida, coloque 15 fatias pulmonares cortadas com precisão em 2 mililitros de tampão de carregamento de cálcio e incubar a 30 graus Celsius por uma hora, seguido de incubação em HBSS contendo 100 micromolar sulfobromophthalein por 30 minutos. Em seguida, coloque fatias carregadas de corante de cálcio em um copo de tampa grande. Encha a graxa de silicone de alto vácuo em uma seringa de 3 mililitros presa à agulha cega 18G ou uma ponta de pipeta de 200 microliter e desenhe duas linhas paralelas através do vidro de cobertura, acima e abaixo da fatia.Cubra a fatia usando uma malha de nylon entre duas linhas de graxa. Coloque o segundo vidro de cobertura em cima da malha para gerar uma câmara. Adicione HBSS ou uma solução agonista na câmara de uma extremidade com uma pipeta.Remova o fluido da câmara aspirando da outra extremidade com papel de tecido. A câmara da fatia está pronta para a imagem de cálcio com um microscópio confocal de varredura a laser de alta velocidade. Os feixes de artérias das vias aéreas pulmonares foram observados em fatias pulmonares cortadas com precisão de espessura de 150 micrômetros sob um microscópio de contraste de fase.Em estado de repouso, uma via aérea foi identificada por células epiteliais cuboidal com artéria pulmonar próxima. Após a exposição à methacholina, a área luminal foi reduzida, enquanto a artéria pulmonar não apresentou resposta aos estímulos. As respostas contraídas das vias aéreas foram quantificadas pelo percentual de redução da área luminal e apresentaram respostas dependentes de dose semelhante em culturas de um dia e cinco dias.Ao atingir o campo pulmonar periférico, as vias aéreas condutoras se ramificam em dutos respiratórios e sacos ao redor das pequenas artérias intra-acinar. Quando expostos a endothelii, tanto as vias aéreas quanto artérias pulmonares constrito, que é seguido pelo relaxamento induzido pelo NOC-5. No estado de repouso, as fatias carregadas de corante de cálcio apresentaram baixa fluorescência nas células musculares lisas das vias aéreas e do sistema vascular sob um microscópio fluorescente confocal.Após a exposição aos agonistas, a intensidade da fluorescência de cálcio elevou-se nas células e se propagou para toda a célula, que se correlacionava com os sinais oscilatórios. Técnica sábia, é essencial inflar o pulmão com agarose de forma homogênea e evitar injeção rápida ou excessiva de agarose. Empurre sempre o ar no final para lavar a agarose das vias aéreas condutoras para o espaço alveoli distal.Em resumo, usando a cultura de fatias pulmonares cortadas com precisão, pode-se fornecer uma variedade especial de funções musculares lisas pulmonares e modelar a desregulamentação muscular lisa in vitro. Também fornece uma plataforma ideal para triagem de novos medicamentos vasodilatários ou broncodilatadores.

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