Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

O PCLS apoia a avaliação da atividade celular lisa das vias aéreas e vasculares em um ambiente tecidual quase intacto, fornecendo assim um modelo ex vivo inestimável para pesquisa pulmonar. Em termos de pesquisa muscular suave, as fatias pulmonares cortadas com precisão preservam o fenótipo in vivo de células musculares lisas e sua interação com estruturas circundantes, permitindo o acesso a células musculares lisas, o que é importante para um estudo mecanicista no nível celular. Para começar, coloque o corpo do rato em uma placa de dissecção na posição supina.

Fixar a cauda, as patas dianteiras e a cabeça com agulhas de seringa 25G e higienizar o corpo com 70% de etanol. Abra cuidadosamente a cavidade torácica ao longo do esterno e da caixa torácica inferior bilateral acima do diafragma. Em seguida, aponte a ponta afiada da tesoura para longe do tecido pulmonar e remova parte das caixas torácicas ventrais bilaterais para expor o coração.

Observe que os lobos pulmonares entram em colapso quando a cavidade torácica se abre. Use uma tesoura para remover tecido mole no pescoço do rato para expor a traqueia. Na extremidade superior da traqueia faça um pequeno orifício de diâmetro de 1,2 milímetros que deve permitir a passagem de uma ponta de cateter IV em forma de Y de 20G.

Conecte uma porta adaptadora do cateter em forma de Y com uma seringa de 3 mililitros pré-preenchida com 0,5 mililitros de ar e a outra porta com uma seringa de 3 mililitros pré-preenchida com 2 mililitros de solução de 1,5% agarose aquecida a 42 graus Celsius. Injete a solução agarose para encher o cateter e, em seguida, empurre o cateter através da abertura para a traqueia para 5 a 8 milímetros. Injete lentamente a solução agarose a uma taxa de 1 mililitro por 5 segundos.

Observe que o pulmão se expande ao longo do eixo proximal para distal. Pare a injeção quando a borda de cada lobo pulmonar estiver inflada. Em seguida, injete 0,2 a 0,3 mililitros de ar da outra seringa para empurrar a agarose residual em vias aéreas condutoras para o espaço alveoli distal.

O clipe fechou a traqueia com um par de fórceps hemostáticos curvos. Para enchir a vasculatura pulmonar, encha uma seringa de 1 mililitro com gelatina quente de 6% e conecte-a a um cateter de veia do couro cabeludo. Enchimento do cateter com solução de gelatina e, em seguida, puna o ventrículo direito perto da parede inferior com a agulha.

Empurre a agulha por 2 a 3 milímetros no ventrículo direito e aponte a ponta da agulha para a artéria pulmonar principal. Injete aproximadamente 0,2 mililitros de solução de gelatina lentamente no ventrículo direito e vasos arteriais pulmonares. Mantenha a agulha no lugar por cinco minutos após a injeção e esfrie os lóbulos pulmonares derramando solução hbss gelada no coração e pulmão e coloque o corpo em uma geladeira.

Após esta etapa, remova o pulmão e o coração do camundongo dos tecidos conjuntivos circundantes com uma tesoura. Em seguida, separe cada lobo pulmonar e mantenha-os na solução HBSS no gelo. Apare o lobo pulmonar e oriente-o de modo que a direção de corte seja perpendicular à maioria das vias aéreas da hila até a superfície pulmonar.

Coloque-o em cima da coluna do espécime com super cola. Use um vibratome com uma lâmina de barbear fina fresca para cortar o lobo pulmonar em fatias de 150 micrômetros. Colete as fatias em pratos Petri estéreis pré-preenchidos com solução HBSS fria.

Transfira as fatias para pratos Petri recheados com meio de cultura DMEM/F-12. Coloque os pratos em uma incubadora Celsius de 37 graus durante a noite antes dos experimentos. Coloque uma única fatia pulmonar cortada com precisão em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços cheia de HBSS.

Localize a fatia no meio do poço e, em seguida, remova a solução HBSS com uma pipeta. Sob um microscópio, encontre as vias aéreas e o vaso alvo na fatia e cubra-a usando uma malha de nylon com um buraco central pré-cortado para expor a área do vaso das vias aéreas alvo. Coloque uma arruela de metal oca em cima da malha para segurar as fatias no lugar.

Em seguida, adicione 600 microliters de solução HBSS para submergir as fatias. Após 10 minutos, grave as imagens da linha de base. Para induzir as vias aéreas ou contração vascular, remova cautelosamente a solução HBSS com uma pipeta e adicione 600 microliters de HBSS com um agonista.

Para preparar o tampão de carregamento de corante de cálcio, primeiro dissolva 50 microgramas de corante com 10 microliters de DMSO e 0,2 gramas de pó Plurônico F-12 em 1 mililitro de DMSO. Misture 10 microlitadores da solução Plurônica com 10 microliters de solução de corante de cálcio. Adicione esta mistura a 2 mililitros de solução HBSS contendo 200 micromolar de sulfobromophthalein.

Em seguida, coloque 15 fatias pulmonares cortadas com precisão em 2 mililitros de tampão de carregamento de cálcio e incubar a 30 graus Celsius por uma hora, seguido de incubação em HBSS contendo 100 micromolar sulfobromophthalein por 30 minutos. Em seguida, coloque fatias carregadas de corante de cálcio em um copo de tampa grande. Encha a graxa de silicone de alto vácuo em uma seringa de 3 mililitros presa à agulha cega 18G ou uma ponta de pipeta de 200 microliter e desenhe duas linhas paralelas através do vidro de cobertura, acima e abaixo da fatia.

Cubra a fatia usando uma malha de nylon entre duas linhas de graxa. Coloque o segundo vidro de cobertura em cima da malha para gerar uma câmara. Adicione HBSS ou uma solução agonista na câmara de uma extremidade com uma pipeta.

Remova o fluido da câmara aspirando da outra extremidade com papel de tecido. A câmara da fatia está pronta para a imagem de cálcio com um microscópio confocal de varredura a laser de alta velocidade. Os feixes de artérias das vias aéreas pulmonares foram observados em fatias pulmonares cortadas com precisão de espessura de 150 micrômetros sob um microscópio de contraste de fase.

Em estado de repouso, uma via aérea foi identificada por células epiteliais cuboidal com artéria pulmonar próxima. Após a exposição à methacholina, a área luminal foi reduzida, enquanto a artéria pulmonar não apresentou resposta aos estímulos. As respostas contraídas das vias aéreas foram quantificadas pelo percentual de redução da área luminal e apresentaram respostas dependentes de dose semelhante em culturas de um dia e cinco dias.

Ao atingir o campo pulmonar periférico, as vias aéreas condutoras se ramificam em dutos respiratórios e sacos ao redor das pequenas artérias intra-acinar. Quando expostos a endothelii, tanto as vias aéreas quanto artérias pulmonares constrito, que é seguido pelo relaxamento induzido pelo NOC-5. No estado de repouso, as fatias carregadas de corante de cálcio apresentaram baixa fluorescência nas células musculares lisas das vias aéreas e do sistema vascular sob um microscópio fluorescente confocal.

Após a exposição aos agonistas, a intensidade da fluorescência de cálcio elevou-se nas células e se propagou para toda a célula, que se correlacionava com os sinais oscilatórios. Técnica sábia, é essencial inflar o pulmão com agarose de forma homogênea e evitar injeção rápida ou excessiva de agarose. Empurre sempre o ar no final para lavar a agarose das vias aéreas condutoras para o espaço alveoli distal.

Em resumo, usando a cultura de fatias pulmonares cortadas com precisão, pode-se fornecer uma variedade especial de funções musculares lisas pulmonares e modelar a desregulamentação muscular lisa in vitro. Também fornece uma plataforma ideal para triagem de novos medicamentos vasodilatários ou broncodilatadores.