Desenvolvendo Modelos de Melanogaster Drosophila para Imagem e Controle Optogenético da Função Cardíaca
25 de agosto de 2022
O presente protocolo descreve a geração de Drosophila melanogaster expressando opsinas eNpHR2.0 ou ReaChR no coração para imagem OCT e ritmo cardíaco optogenético. Instruções detalhadas para imagem de Drosophila OCT e modulação de batimentos cardíacos, incluindo a simulação de parada cardíaca restauradora, bradicardia e taquicardia em animais vivos em diferentes estágios de desenvolvimento, são relatadas.
O protocolo apresenta modelos de Drosophila onde a função cardíaca pode ser caracterizada e controlada usando luz. Isso permite que os pesquisadores estudem doenças cardíacas humanas em Drosophila usando animais intactos. Este método pode alcançar de forma confiável imagens oct não invasivas e controle optogenético da função cardíaca Drosophila.
Tem alta eficiência e qualidade. O ritmo optogenético pode potencialmente ser uma alternativa ao ritmo elétrico como terapia para tratar distúrbios arrítmicos. A imagem oct e o ritmo optogenético podem ser estendidos a outros sistemas modelo, como organoides cardíacos, peixes zebra e garganta e coração embrionários.
Para começar, combine cinco mãos GAL4 sobre TM6 fêmea virgem dupla tubby e duas a três moscas machos de UAS Ops e Stocks por frasco. No dia seguinte, prepare alimentos semi-definidos de acordo com as instruções do Bloomington Drosophila Stock Center adicionando 5,14 gramas por 100 mililitros de sacarose em um recipiente em um prato quente. Em seguida, esfrie-o a 60 graus Celsius com agitação constante.
Em seguida, prepare frascos de moscas estreitos adicionando 50 microlitres de 100 milimães solução de etanol de retina totalmente trans a cada frasco. Use uma pipeta sorológica para descartar cinco mililitros de comida de mosca por mosca estreita vil. Depois de vórtice em velocidade máxima por 10 segundos, conecte esses frascos e enrole-os no tecido escuro para protegê-los da luz.
No dia seguinte, transfira as moscas constantemente colocando ovos para os frascos com etanol de retina totalmente trans contendo alimentos. Proteja os racks com frascos de luz. Após 24 a 48 horas, dependendo do número de ovos colocados, descarte os pais para evitar a superpopulação do frasco.
Em seguida, colete progênere não-tubby para imagem cardíaca. Escolha a opção UAS mão larva GAL4 ou pupa do frasco, coloque-a em um tecido e limpe suavemente a mídia da superfície do corpo usando um pincel de pintura. Prepare o slide do microscópio com um pequeno pedaço de fita dupla face no meio.
Em seguida, coloque suavemente a larva ou pupa na superfície da fita com o lado dorsal para cima e perpendicular ao lado longo do slide usando um pincel ou pinça fina. Aplique pressão suave para prender a larva ou pupa à superfície da fita. Agora, configure o slide no estágio de imagem com a larva ou pupa virada para baixo e ligue a tomografia de coerência óptica ou fonte de luz OCT por software de controle a laser.
Abra o software de controle oct de domínio espectral escrito sob medida. Em seguida, clique na janela de visualização. Em seguida, defina os parâmetros de varredura no software OCT de domínio espectral.
Use micro manipuladores para controlar o estágio amostral para colocar o coração voador em foco. Ajuste a posição focal para minimizar o reflexo da luz da superfície da cutícula da mosca. Além disso, considere aplicar óleo mineral na larva ou superfície de pupa para minimizar o reflexo.
Em seguida, defina os parâmetros de varredura para aquisição de imagem oct do modo M e adquira cinco conjuntos de dados de controle sem pulsos de estimulação da luz vermelha para calcular a frequência cardíaca em repouso. Projete o pulso de luz para a estimulação do ritmo no software de controle de OCT personalizado. Para isso, clique nas guias de configurações e adicione as sequências de pulso de luz projetadas para controlar a frequência de pulso, largura do pulso, duração da estimulação e tempo de espera de acordo com diferentes protocolos de estimulação.
Em seguida, abra o software do controlador de luz para gerar pulsos de luz vermelha. Escolha o modo de pulso na seleção do modo. Clique duas vezes na figura para as configurações do perfil de pulso e escolha o modo seguidor.
Mantenha a intensidade de folga em zero e ajuste a porcentagem de intensidade no cálculo da densidade real de energia. Adquira vídeos de modo M do coração Drosophila batendo com estimulação de luz clicando em Acquire no software OCT Control. Grave flashes de luz vermelha no coração de mosca durante a aquisição de imagens.
Observe que diferentes configurações de ritmo são necessárias para controlar a função de coração de mosca com modelos de moscas com mudanças vermelhas e modelos de mosca NPHR. Abra o software de segmentação de coração de mosca desenvolvido sob medida e clique em arquivo seleto. Em seguida, selecione o arquivo a ser analisado na interface gráfica do usuário.
Insira os limites verticais e horizontais da região do coração em pixels nas caixas de texto superiores. Clique em redimensionar. Usando o controle deslizante na parte inferior, certifique-se de que toda a região do coração esteja visível e que ele preencha toda a caixa para toda a coleção.
Depois de clicar na guia de previsão, o programa passará por cada fatia da coleção e selecionará a região do coração em aproximadamente três minutos. Uma vez concluída a previsão, clique no gráfico de RH para exibir um enredo da área do coração ao longo do tempo em uma nova janela. Selecione as áreas de pico ou vale corretas, escolha o pulso e, em seguida, as guias de RH para gerar uma figura final.
Os parâmetros funcionais serão salvos simultaneamente nos arquivos CSV. A especificidade tecidual do condutor gal4 da mão foi verificada por meio da expressão de proteína fluorescente verde. As imagens típicas de OCT de larval e seção transversal do corpo pupal são mostradas aqui.
Para imitar diferentes condições cardíacas, quatro tipos de pulsos de luz foram projetados. Um único pulso que durou 10 segundos após cinco segundos de espera, gerou prisão cardíaca restauradora. Para o ritmo cardíaco em frequências inferiores à frequência cardíaca em repouso, foram utilizadas duas sequências de pulso leve com frequências de ritmo equivalentes a metade da frequência cardíaca em repouso, e um quarto da frequência cardíaca em repouso que dura oito segundos com um tempo de espera de seis segundos no meio.
O padrão de estimulação para aumentar a frequência cardíaca devido à ativação da canalrhodopsina deslocada avermelhada consistia em três sequências de pulsos de luz. A frequência de contração cardíaca reduzida após os sinais de luz resultou em uma frequência cardíaca mais lenta que imita em larva e pupa. Uma série de três trens de pulso leve em diferentes frequências de estimulação foi aplicada em larvas e corações de pupae mostraram claramente aumento da frequência cardíaca após os pulsos de luz.
A seleção de preparação da prole correta, a montagem da amostra e o procedimento de imagem são essenciais. Esperamos transferir a tecnologia de ritmo optogenético para modelos animais maiores, estudar doenças cardíacas de mamíferos e explorar novas abordagens terapêuticas para tratar a arritmia.
Visão Geral
Este protocolo descreve a geração de Drosophila melanogaster expressando opsinas para imagem por tomografia de coerência óptica (OCT) e estimulação cardíaca optogenética. Ele fornece métodos detalhados para modular a função cardíaca em animais vivos, incluindo a simulação de várias condições cardíacas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Optogenética
- Pesquisa cardiovascular
Fundamentos
- Modelos de Drosophila permitem o estudo da função cardíaca e da doença.
- Técnicas optogenéticas permitem o controle preciso da atividade cardíaca.
- A imagem OCT fornece visualização não invasiva da dinâmica cardíaca.
- Esta abordagem pode ser estendida a outros sistemas modelo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para imagem e controle não invasivos da função cardíaca em Drosophila.
- Simular condições cardíacas como bradicardia e taquicardia.
- Explorar a estimulação optogenética como uma potencial terapia para arritmias.
Métodos Utilizados
- Geração de Drosophila expressando opsinas.
- Preparação de alimento contendo retinal all-trans para larvas.
- Tomografia de coerência óptica (OCT) para imagem da função cardíaca.
- Projeção de sequências de pulsos de luz para estimulação optogenética.
Principais Resultados
- Imagem bem-sucedida da função cardíaca de Drosophila usando OCT.
- Demonstração do controle optogenético sobre a frequência cardíaca.
- Capacidade de simular diferentes condições cardíacas através da estimulação com luz.
- Potencial para aplicação em modelos animais maiores.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem confiável para estudar a função cardíaca em Drosophila.
- A estimulação optogenética pode servir como uma alternativa aos métodos de estimulação tradicionais.
- Estudos futuros podem expandir esta tecnologia para modelos mamíferos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Non-invasive optogenetic control and imaging of cardiac function in Drosophila melanogaster enables high-throughput, genetically tractable modeling of cardiac phenotypes relevant to human disease. This platform supports early-stage mechanistic de-risking and target validation for cardiac drug discovery by providing quantitative, reproducible readouts in a whole-organism context. Integration of OCT imaging with optogenetic pacing advances predictive confidence and translational continuity from discovery biology to preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cardiac function and arrhythmia mechanisms in a genetically defined, in vivo system.
- Supports functional target validation by linking genetic perturbations to quantitative cardiac phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through precise, reversible modulation of heart activity.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, scalable platform for quantitative assessment of cardiac responses to genetic or pharmacological interventions.
- Delivers reproducible, high-content imaging and optogenetic stimulation outputs for assay standardization.
- Enables screening readiness for compounds affecting cardiac rhythm or contractility in a whole-organism context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease-relevant cardiac phenotypes in Drosophila with translational biomarker strategies.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by modeling arrhythmia and bradycardia in vivo.
- Provides predictive de-risking for cardiac safety and efficacy prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven cardiac studies, quantitative phenotyping, and assay development in a genetically tractable model. It is positioned for integration from target validation through lead identification and preclinical risk assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for cardiac targets using optogenetic and imaging readouts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screening in a whole-organism system.
- Analytics: Provides high-resolution, time-resolved measurements of heart function for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of Drosophila cardiac phenotypes with preclinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for cardiac research across multiple genetic backgrounds and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Standardizes non-invasive, high-throughput cardiac phenotyping and optogenetic control workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early risk assessment of cardiac liabilities.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs with quantitative, translational data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, optogenetics, and OCT imaging.
- Needs access to custom imaging and light stimulation instrumentation with integrated analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptation to other model systems (e.g., organoids, zebrafish) may require protocol optimization.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise genetic control.
