Name: Auto-montagem de Tactóides microtúbulos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprenda a auto-montagem de tactóides de microtúbulos usando MAP65 e PEG para estudar organização celular. Este método reprodutível recria formas semelhantes ao fuso mitótico em sistemas biológicos minimais.

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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do Ross Lab de verão de 2021, especialmente K. Alice Lindsay, por sua ajuda. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção da NSF BIO-2134215 que apoiou S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee e J.L. Ross. Uma bolsa da Fundação KECK (Rae Anderson, USD, chumbo PI) apoiou parcialmente R. Branch e P. Chauhan

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os métodos aqui descritos têm sido utilizados em vários artigos para criar tatoides microtúbulos (Figura 2)22,28. Esses experimentos são biologicamente relevantes para ajudar a descobrir os princípios organizacionais que controlam a forma e estabilidade do fuso mitotístico ou meiotic na maioria dos tipos de células. Além disso, os microtúbulos são mesogens de cristal líquido modelo que podem ajudar a aprender mais sobre como cristais líquidos nucleam e crescem fases nemáticas a partir de fases isotrópicas.
O procedimento aqui descrito tem várias vantagens para explorar a auto-organização do microtúbulo. Primeiro, é altamente reproduzível, tendo sido realizado em laboratório por muitos alunos, incluindo estudantes do ensino médio, com pouco conhecimento ou treinamento antes de começar no laboratório. Os tatoides são birefringentes22, permitindo que sejam vistos em luz transmitida, além da microscopia de fluorescência, tornando este método acessível a muitos laboratórios e a este procedimento experimental adaptável a propósitos educacionais, além de pesquisas de ponta. Finalmente, esse processo abre caminhos para continuar a compreender e sondar sistemas biológicos em uma abordagem despojada e reducionista, permitindo entender como cada condição adicional, proteína ou aditivo pode alterar a auto-organização de tatoides e, talvez, em última instância, o fuso. Os alvos para melhor biomimimicmento incluem atividade, fluidez e classificação de polaridade de filamentos.
Pode haver vários fatores afetando o experimento dando resultados inesperados. Por exemplo, se os tatoides não se formam (Figura 2), mas padrões semelhantes aos ventiladores são observados, o MAP65 provavelmente não está presente ou não se liga aos microtúbulos22,28. Isso deve ser óbvio no canal de fluorescência MAP65 também porque o GFP-MAP65 não estará vinculado aos microtúbulos.
Se os tatoides não se formarem e o fundo aparecer como manchas no vidro, isso pode ser devido ao revestimento superficial. Uma vez realizada, a silanização dura apenas 1 mês em deslizamentos. Quando passar, a tubulina será capaz de se ligar à superfície exposta não especificamente. Esta ligação ocorrerá em padrões estranhos.
Se os tatoides não se formarem e a tubulina for observada em agregados de várias formas e tamanhos, isso pode ser devido à tubulina de má qualidade. A tubulina pode ser centrifugada para remover agregados iniciais que podem impulsionar essa agregação fora da via em vez de polimerização de microtúbulos. Se a superfície estiver ligando a tubulina, também pode esgotar a tubulina na solução. Baixas concentrações de tubulina, abaixo da concentração crítica para microtúbulos polimerizadores, podem resultar em agregados.
Nos experimentos FRAP, se o canal MAP65 não mostrar qualquer recuperação (Figura 5), é possível que o fotobleaching tenha sido fotodambulando os microtúbulos. Fotodamage causa a destruição localizada dos filamentos. Isso pode ser verificado por exame no canal transmitido. Tatoides microtúbulos são visíveis no canal transmitido através de um alto índice de incompatibilidade de refração com a água circundante. A fotodamagem induzida pela luz aparecerá como uma marca de queimadura ou perda de contraste em imagens de luz transmitidas na localização do ROI submetida a fotobleaching. Se isso ocorrer, o laser ou a energia da luz devem ser reduzidos para inibir a fotodamagem das proteínas.
Foram encontrados diversos desafios nesse procedimento e abordagem. Uma questão é que as medidas de comprimento são atualmente executadas manualmente clicando na imagem. Este método, embora simples, pode resultar em alta incerteza. A medição de largura que usa a seção transversal e a montagem de um gaussiano é um método melhor para quantificar o tamanho. Um método semelhante poderia ser empregado para o comprimento. Uma segunda questão é que, às vezes, os tatoides, porque são tão longos e finos, podem dobrar. Isso dificulta a quantificação do comprimento. O comprimento do contorno pode ser quantificado usando uma linha segmentada, mas há mais incerteza cada vez que um segmento é adicionado.
Do ponto de vista científico, essa abordagem tem alguns outros desafios para seu uso como modelo para cristais líquidos ou fusos. O primeiro desafio tem sido a forma longa e fina dos tatoides que os microtúbulos criam (Figura 3 e Figura 4). Como observado em publicações anteriores22, os tatoides microtúbulos são tatoides homogêneos, não bipolares. Isso significa que os microtúbulos que compõem a forma não reorientam para apontar para as pontas da estrutura. Em vez disso, todos os microtúbulos são paralelos ao eixo longo e os "polos" estão localizados no infinito. Isso é muito diferente dos tatoides observados para cristais líquidos moleculares ou mesmo para actina ou DNA que também podem atuar como mesógenos de cristal líquido. Nesses outros sistemas, os tatoides são bipolares e, quando vistos em polarizadores cruzados, mostram os sinais de reorientação das hastes.
Um segundo grande desafio neste sistema é que os microtúbulos estão imóveis dentro do tatoide. Isso é claro a partir de experimentos e análises FRAP, pois a recuperação dos microtúbulos é muito baixa. Sua natureza sólida torna os tatoides microtúbulos menos valiosos como análogos de cristal líquido em larga escala. A fase nemática de um cristal líquido deve ter propriedades líquidas (fluidas) e cristal (organizadas). Embora a forma pareça certa para o fuso, a imobilidade torna o sistema menos excitante como um modelo de fuso mitotístico. Por outro lado, esta questão oferece oportunidades para investigar como se pode modificar os experimentos para criar mais fluidez no sistema.
Esses desafios científicos oferecem oportunidades emocionantes que permitirão novos conhecimentos sobre o sistema. Para tornar os tatoides microtúbulos mais bipolares, pode-se usar microtúbulos mais curtos. Há um desafio adicional, no entanto, uma vez que os microtúbulos não têm muitas proteínas de tampa bem caracterizadas para controlar o comprimento como o actin faz. O uso de nucleação e crescimento requer o uso de concentrações muito altas de tubulina e GMPCPP para fazer microtúbulos curtos. A alta concentração de tubulina resulta em um número maior de filamentos no sistema, o que torna mais difícil separar tatoides uns dos outros. A adição de novos cappers de microtúbulos, como o DARPin33, pode ajudar nessa situação. A segunda questão dos microtúbulos imóveis poderia ser atenuada pela adição de proteínas motoras, como a quinase-534, que são tetramers de motores utilizados na mitose. Alternativamente, dimers artificiais de cinesina dimeric-1 poderiam ser usados15.
Outra forma de adicionar mais fluidez seria permitir que os microtúbulos realizassem sua instabilidade dinâmica, o crescimento e o encolhimento dos microtúbulos. Atualmente, microtúbulos que são semeados com filamentos GMPCPP estáveis e, em seguida, sofrem instabilidade dinâmica são muito mais longos do que o desejado para formar um fuso ou tatoide, o que resultaria em organizações muito longas como ventiladores ou pacotes. Assim, adicionar instabilidade dinâmica de microtúbulo precisaria ser feito cuidadosamente para preservar a forma tatoide. A adição de proteínas e enzimas associadas que possam controlar o comprimento pode mitigar esse problema. Por exemplo, cinesinas despomerizantes, como a cinesina-1335, ou enzimas de corte, como katanin36, provavelmente seriam necessárias. Esses experimentos são complexos e difíceis, embora sejam muito perspicazes, não importa o que os resultados revelem. Seja qual for a direção que os experimentos futuros tomem, a plataforma desenvolvida aqui para a criação de tatoides microtúbulos pode expor novas informações com base física na organização de microtúbulos.

A divisão celular via mitose é um dos processos biológicos mais importantes para sustentar a vida. Os filamentos microtúbulos, compostos por dimers tubulin, são elementos estruturais essenciais desse processo. A maquinaria transitória criada em metafase quando os cromossomos estão se alinhando no centro celular é chamada de fuso mitótico devido à sua forma, que é como um fuso de um tear coberto de fios (Figura 1A). É bem estabelecido em muitos organismos que microtúbulos são usados em metafase para empurrar e puxar cromossomos condensados para o centro da célula, alinhando-os e conectando-os a microtúbulos que os separarão em anaphase (Figura 1B,C). O fuso se forma tanto em meiose (Figura 1B) quanto em mitose (Figura 1C), criado a partir de muitos microtúbulos sobrepostos não envoltos ao redor do eixo central como o fio, mas correndo paralelamente à interface. A criação dessas estruturas baseadas em microtúbulos requer proteínas associadas que cruzam e enzimas associadas que podem atuar como motores para ajudar a empurrar e puxar os cromossomos1.
Estudos de fusos meioticos mostraram que os microtúbulos são curtos, dinâmicos e sobrepostos em matrizes interligadas 2,3,4,5,6 (Figura 1Di). Devido à organização física desses microtúbulos curtos, o fuso meiotic é semelhante a um tatoide de cristal líquido (Figura 1E). De fato, os fusos têm sido mostrados para coalesce e fusão, como seria de esperar dos tatoides de cristal líquido5.
Muitos estudos que datam da década de 1960 usaram fixação, seções seriais e microscopia eletrônica para determinar que existem dois tipos de microtúbulos dentro do fuso mitotístico 7,8,9,10. O primeiro tipo é chamado de microtúbulos kinetochore, que conectam o polo do eixo ao kinetochore. O segundo tipo é chamado de microtúbulos interpolares ou polares, que crescem além dos cromossomos e se sobrepõem à zona média (Figura 1Dii)8,9,10. Um terceiro tipo é chamado de microtúbulos astrais, que estão fora do eixo e conectam os polos à borda celular; essas organizações de microtúbulos estão fora do escopo da discussão atual. Tem havido estudos recentes sobre a interação entre o complexo de anel augmin6 e gama-tubulina influenciando os centros de nucleação para microtúbulos, resultando em um fuso mitotístico com microtúbulos mais curtos como na Figura 1D.
Como os microtúbulos são mais longos do que são largos, com uma alta proporção e alta rigidez, eles são como versões dimensionadas de moléculas de cristal líquido. Na física da matéria macia, átomos e moléculas foram aproximados usando interações mínimas para deduzir os mecanismos físicos das transições de fase, incluindo a nucleação e o derretimento dos cristais11. Da mesma forma, microtúbulos são objetos mesoescalados que são versões dimensionadas de moléculas de cristal líquido, dando insights sobre a física da dinâmica do cristal líquido, incluindo a nucleação e o crescimento das fases nemáticas das isotrópicas. Além disso, como discutido acima, o fuso meiotic exibe propriedades como as de um tatoide de cristal líquido, um estado nemático que nuclea e cresce a partir do estado isotrófico de moléculas de cristal líquido 3,4,5. Para tatoides, nucleação e crescimento são como os de outros cristais (ou seja, exigindo uma concentração relativamente alta de mesógenos [as moléculas que formam cristais líquidos]). A forma única de "fuso" do tatoide vem do alinhamento local dos mesógenos de cristal líquido que se alinham à fase nemática (Figura 1E). Eles não podem formar um cristal arredondado porque as moléculas são altamente assimétricas. Dada a natureza dos microtúbulos, talvez não seja surpreendente que o fuso-máquinas mitóticos feitos a partir de uma alta concentração local de microtúbulos também seja da mesma forma, seja ele chamado de tatoide ou fuso. Os tatoides podem ser bipolares, com polos nas extremidades afiladas (Figura 1Ei), ou homogêneas, com polos efetivamente no infinito (Figura 1Eii).
Dada a importância da formação do fuso, esforços têm sido em andamento para a formação de fusos auto-organizados in vitro, demonstrando condensação de microtúbulos em feixes através de espécies iônicas12,13, agentes de aglomeração que criam interações de esgotamento14,15, e proteínas de microtúbulo específicos 13,16,17,18,19, 21. Surpreendentemente, embora todos esses agentes trabalhem para aumentar a concentração local de microtúbulos, eles muitas vezes resultam em longos feixes de microtúbulos, mas não tatoides. Uma das razões pelas quais esses pacotes são longos pode ser que os microtúbulos que os compõem também são longos. Trabalhos recentes usando microtúbulos mais curtos também relataram feixes mais longos que não são afunilados no finaldos 15 anos; Neste caso, os feixes são mantidos em conjunto com proteínas motoras que causam a extensão dos feixes e, assim, torná-los mais longos. Microtúbulos curtos com crosslinkers não extensíveis são necessários para conjuntos afilados, semelhantes a fusíveis, conforme descrito aqui.
Recentemente, desenvolvemos uma técnica para permitir a criação de tatoides microtúbulos utilizando o crosslinker antiparallel, MAP65, na presença de microtúbulos estáveisnucleantes 22. Os microtúbulos precisavam ser curtos, mas poucos reguladores conhecidos de comprimento de microtúbulos podem limitar microtúbulos contra instabilidade dinâmica ou ressarcer de ponta a ponta. Em vez disso, o GMPCPP foi usado para nuclear e estabilizar os filamentos após o crescimento. Isso permitiu criar uma alta densidade de microtúbulos curtos que poderiam se auto-organizar em tatoides. Estes tatoides eram homogêneos quando vistos sob birefringência. Além de microtúbulos curtos, um crosslinker antiparalha específico, MAP65, foi empregado para formar os tatoides (Figura 2). MAP65 é uma proteína associada a microtúbulos vegetais na família PRC1/Ase1 de cruzlinkers mitotéticos23. MAP65 existe como um dimer, com uma forte afinidade para se ligar a si mesmo, bem como aos microtúbulos24. Ao contrário do fuso meiotico e dos tactóides observados com filamentos de actina 25,26,27, que são bipolares e possuem as propriedades líquidas de cristais líquidos, os tatoides microtúbulos têm sido observados comosólidos 22,28.
Aqui, são apresentados protocolos para a criação dos tactóides microtúbulos e caracterização da forma dos conjuntos e da mobilidade dos constituintes utilizando técnicas baseadas em fluorescência.

<table><tbody><tr><td>2% Diclorodimetilsilano</td><td>GE Healthcare</td><td>118945</td><td>Um tratamento de superfície hidrofóbico de silano. Isso pode ser reutilizado até três vezes e mantido em temperatura ambiente por um ano.</td></tr><tr><td>Epóxi de 5 minutos</td><td>Bob Smith Industries</td><td></td><td>Para vedação de câmaras experimentais</td></tr><tr><td>Acetona</td><td></td><td>Fisher 32900HPLC</td><td>100%</td></tr><tr><td>BL21 células</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td><td>Células bacterianas competentes usadas para expressar MAP65</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>Parte do sistema de eliminação de oxigênio. Um estoque de 300 mg / ml é feito em ddH2O e armazenado em 10 &mu; l alíquotas em -20&deg; C por até um ano.</td></tr><tr><td>Lamínulas (22 mm x 22 mm ou 22 mm x 30 mm)</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>Para câmaras experimentais</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>Uma pequena molécula que é usada para quebrar ligações dissulfeto e eliminar oxigênio. Uma coronha de 1 M é feita de pó (Sigma) em ddH2O. A solução é aliquotada e armazenada a -20C por até um ano. As alíquotas são usadas 7 a 8 vezes e depois descartadas.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>Ingrediente base de tampão de tubulina</td></tr><tr><td>Eppendorf 0,5 ml tubos</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>Para segurar soluções experimentais</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>111000200</td><td>200 prova</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>Para limpar e puxar soluções através de câmaras experimentais</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência com alta NA objetivas</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 Confocal</td><td>Para experimentos de imagem</td></tr><tr><td>Freezer -20&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>Para armazenar reagentes</td></tr><tr><td>Freezer -80&deg; C</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>Para armazenar proteínas.</td></tr><tr><td>Recipientes de vidro para silanização</td><td>Michaels</td><td></td><td>Para preparar câmaras experimentais - tratamento de lamínulas</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Fisher</td><td>12544-4</td><td>Para câmaras experimentais</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td>Parte do sistema de eliminação de oxigénio. Um estoque de 300 mg / ml é feito em ddH2O e armazenado em 10 &mu; l alíquotas em -20&deg;C.</td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Parte do sistema de eliminação de oxigênio. Isso é armazenado em 4&deg; C por até um ano.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>Análogo lentamente hidrolisável do GTP usado para polimerizar e estabilizar os microtúbulos, reduzindo a instabilidade dinâmica e a concentração crítica espontânea para que a nucleação dos microtúbulos obtenha um comprimento consistente. Compramos um estoque de 10 mM da Jena Biosciences e o armazenamos a -20&deg; C por até um ano.</td></tr><tr><td>Elemento de aquecimento para microscópio</td><td>Okolab stage top incubator</td><td></td><td>Para experiências de imagem</td></tr><tr><td>Imidizole</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>Utilizado para eluir a proteína MAP65 de grânulos de níquel para purificar MAP65</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>Para limpeza e para puxar soluções através de câmaras experimentais.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M em ddH2O, feito fresco para evitar a acidificação ao longo do tempo.</td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>Airgas</td><td>NI 230LT22</td><td>Para soltar alíquotas de congelamento. Isso também pode ser usado para armazenamento (não recomendado)</td></tr><tr><td>Proteína MAP65</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>Uma proteína associada a microtúbulos (MAP) com peso molecular de 65 kD que é um reticulador de microtúbulos antiparalelo. Purificamos uma versão não rotulada e rotulada com GFP do MAP65-1 de Arabidopsis thaliana. Misturamos o GFP-MAP65 com o MAP65 não rotulado, de modo que 10% da proteína seja marcada. O estoque de trabalho é de 10,8 &mu; M. Esta solução de trabalho é armazenada em 4&deg; C e refeito fresco toda semana. O protocolo para purificar o MAP65 e o GFP-MAP65 é fornecido em nosso capítulo de métodos anteriores (26).</td></tr>Grânulos Qiagen 30210 do <tr><td>MgSO4</td><td></td><td>Sigma MKCJ940</td><td>do tampão da tubulina</td></tr><tr><td>Grânulos</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>necessários para refinar 6xHis marcaram as proteínas MAP65</td></tr><tr><td>Sistema</td> do laser <td>de Nikon</td><td></td><td>405 nanômetro que pode focalizar o laser em toda a forma desejada da região de interesse</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>Tampão de base polimerizante de tubulina neutra para solução feita de 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, armazenado a 4&deg; C por até um ano.</td></tr><tr><td>Fita dupla face permanente</td><td>3M - Scotch</td><td>34-8724-5691-7</td><td>Para câmaras experimentais Placa</td></tr> de <tr><td>Petri</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Para câmara úmida</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>Ingrediente base de tampão de tubulina</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Um copolímero em bloco com dois blocos hidrofílicos de óxido de polietileno (PEO) nas extremidades e um bloco central hidrofóbico de revestimento de superfície hidrofóbico de óxido de polifenileno (PPO) que usamos para evitar a ligação de proteínas à superfície. O Pluronic-F127 é adquirido como pó (Sigma) e dissolvido em uma solução a 5% (p / v) em ddH2O durante a noite. Uma vez dissolvida, a solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até um ano.</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>Um agente de aglomeração usado para criar forças de depleção para trazer táttoides à superfície e ajudar a organizar microtúbulos. Criamos uma solução de 5% (p/v) de 100 kDa PEG em PEM80. A solução é armazenada em 4&deg; C por até um ano e colocado no balancim antes do uso. É viscoso, por isso recomendamos o uso de uma pipeta de deslocamento positivo para trabalhar com ele.</td></tr><tr><td>Pipeta de deslocamento positivo</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Para pipetagem de líquidos viscosos</td></tr><tr><td>Racks para lamínulas</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72240</td><td>Para preparar câmaras experimentais - tratar vidros de cobertura</td></tr><tr><td>Geladeira 4&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Para armazenar reagentes</td></tr><tr><td>Citoesqueleto Marcado com Tubulina</td><td></td><td>TL590M</td><td>tubulina marcada com rodamina liofilizada de cérebro de porco é comprada (Citoesqueleto) e armazenada em -80&deg; C até hidratado em PEM80 e usado por até um ano.</td></tr><tr><td>Proteína Tubulina</td><td>Citoesqueleto</td><td>T240</td><td>liofilizado tubulina 99% pura não rotulada do cérebro de porco é comprada (Citoesqueleto) e armazenada em -80&deg; C até hidratado em PEM80 e usado por até um ano.</td></tr><tr><td>UV-Ozônio</td><td></td><td>Jelight Modelo 342</td><td>Para preparar câmaras experimentais - tratamento de óculos de cobertura</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>plugin para registrar dados de séries temporais para remover deriva</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>plugin para registrar dados de séries temporais para remover deriva</td></tr></tbody></table>

auto-montagem de tactóides microtúbulos

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

O citoesqueleto é responsável pela grande organização interna e reorganização dentro da célula, tudo sem um gerente para direcionar as mudanças. Este é especialmente o caso durante a mitose ou meiose, onde os microtúbulos formam o fuso durante a divisão celular. O eixo é o maquinário usado para segregar material genético durante a divisão celular. Para criar fusos auto-organizados in vitro, recentemente desenvolvemos uma técnica para reconstituir microtúbulos em conjuntos semelhantes a fusíveis com um conjunto mínimo de proteínas associadas a microtúbulos e agentes de aglomeração. Especificamente, map65 foi usado, que é um interlinker antiparalha de microtúbulos de plantas, um homólogo de Ase1 de levedura e PRC1 de organismos mamíferos. Este crosslinker auto-organiza microtúbulos em conjuntos auto-organizados de microtúbulos longos, finos e semelhantes a fusíveis. Estes conjuntos também são semelhantes aos tatoides de cristal líquido, e microtúbulos poderiam ser usados como mesogênicos mesoescala. Aqui, são apresentados protocolos para a criação desses tatoides microtúbulos, bem como para caracterizar a forma dos conjuntos utilizando microscopia de fluorescência e a mobilidade dos constituintes utilizando recuperação de fluorescência após fotobleachamento.

Com apenas um pequeno número de componentes, escurecedores de tubulina e interlinkers de microtúbulos, tatoides de microtúbulos podem se formar (Figura 2A). Embora este protocolo descreva a incubação de microtúbulos nucleados e de cultivo em uma incubadora, a nucleação e o crescimento podem ser observados diretamente sob o microscópio (que estão completos dentro de 30 minutos) (Figura 2B). A concentração de tubulina é mantida constante em 13,6 μm e a ligação MAP65-MT em 10%.
A Figura 4 representa dados bem sucedidos. Os tatoides devem ser visíveis com um laser de 561 nm no canal tubulina e 488 nm no canal MAP65, que se sobrepõem perfeitamente entre si (Figura 4A). Um mistério do sistema é que a largura dos tatoides não parece variar sob uma variedade de alterações experimentais, incluindo a alteração dos comprimentos do microtúbulo, a concentração MAP65 e os agentes de aglomeração (Figura 4B)22,28. O comprimento é muito mais variável e depende tanto dos comprimentos do microtúbulo quanto da concentração MAP65 (Figura 4B)22,28.
Ao realizar o FRAP, observou-se que o sinal MAP65 se recupera, mas o sinal de microtúbulo não se recupera (Figura 5). A recuperação no FRAP deve-se à mobilidade e movimentação dos objetos rotulados e fotobleachados. No caso do MAP65, as moléculas escurecidas se dissociam e se afastam do microtúbulo e novas se movem para a região (Figura 5). A ligação MAP65 está em equilíbrio, de modo que a taxa de ligação e desvinculação é igual (medida em moléculas por segundo). Para os microtúbulos, não foi observada recuperação implicando que os microtúbulos não são capazes de sair do tatoide (Figura 5A, Bi, C). Além disso, não foi observada propagação da região escura, sugerindo que os microtúbulos são localmente imóveis e não um fluido dentro da forma tatoide.
<img alt="Alinhamento cromossômico metafásico; estrutura do fuso e organização dos microtúbulos; diagrama de microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Diferentes modelos de formação de fuso. Um fuso mitotístico é uma máquina feita de microtúbulos e suas proteínas e enzimas associadas que alinha e separa os cromossomos nas duas novas células filhas durante a divisão celular. (A) Imagem de uma réplica de fuso de queda da Idade Média com fios finos da Holanda. Esta figura foi modificada a partir de uma imagem wikimedia por Peter van der Sluijs30. (B) Reconstrução tridimensional de microtúbulos em diferentes estágios da meiose selvagem II. Microtúbulos são mostrados em verde, e cromossomos são mostrados em cinza. Barra de escala = 1 μm. Este número foi modificado de Lantzsch et al.31. (C) Imagem de microscopia dos microtúbulos em um fuso mitotístico de uma célula Sf9 divisória. Os polos de fuso e os microtúbulos do fuso são rotulados com uma proteína fluorescente verde. Barra de escala = 5 μm. Este número foi modificado a partir de Advani et al.32. (D) Modelos diferentes de como microtúbulos de fuso místico e meiotic são organizados. (i) Previamente observados para fusos meioticos criados a partir de extratos de ovos xenopus, os microtúbulos (verde) foram deduzidos como curtos e dinâmicos em todo o eixo. Isto é semelhante a uma organização bipolar de tatoide dentro de um cristal líquido. (ii) O modelo canônico para organização de microtúbulos dentro de um fuso mitótico tem dois tipos de microtúbulos: microtúbulos interpolares ou polares (verde escuro) que se cruzam na zona média ao redor dos cromossomos e microtúbulos kinetochore (verde claro) que são agrupados e esticados do polo até a kinetochore para empurrar e puxar os cromossomos. Em todas as imagens, os cromossomos são mostrados em azul transparente, e os polos de fuso são representados em verde escuro. (E) Esquemas de mesógenos (linhas verdes) em um tatoide de cristal líquido para (i) tatoides bipolares e (ii) homogêneos. Tatoides bipolares têm dois polos no final do tatoide, e os mesógenos re-orientam para apontar para esses polos. Tatoides homogêneos têm polos no infinito, e os mesógenos não mudam a orientação ao longo do comprimento do tatoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Método de formação táctil, esquemático e séries temporais; microtúbulos, reticulação MAP65, microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Condensação de microtubulos. (A) Microtubulos podem ser agrupados e interligados por uma variedade de métodos, incluindo espécies iônicas, forças de esgotamento causadas por agentes de aglomeração e interlinkers de microtúbulos específicos, como MAP65. i Os dimers tubulin e as proteínas MAP65 são misturados a nucleados e microtúbulos de cultivo. (ii) Os microtúbulos nucleam e crescem a partir da tubulina, e o MAP65 se liga imediatamente a microtúbulos, outro monômero MAP65, ou ambos e causa agrupamento. (iii) Microtúbulos nos feixes transligados nucleares e crescer. (iv) A configuração final é um tactóide de microtúbulo semelhante a um fuso. (B) Série temporal de tatoides microtúbulos nucleando e crescendo mais de 105 min. Barra de escala = 5 μm. Figura adaptada de Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama da câmara de fluxo com lamínula silanizada, para análise da direção do fluxo da amostra em microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Montagem da câmara de fluxo. A câmara de fluxo é feita usando um escorregador de vidro, vidro de cobertura silanizado e fita permanente de dupla face. A região destacada amarela é o caminho de fluxo onde a amostra é escoada e observada. O volume da câmara de fluxo é ~20 μL. Epoxy foi usado para selar as extremidades da câmara para evitar que a amostra evaporasse durante a imagem de longo prazo ao longo de várias horas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise tátóide: canais de microtúbulos e MAP65, imagens mescladas, quantificação de comprimento-largura, gráfico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Imagens tactóides e análise de comprimento e largura. (A) Exemplos de dados de tatoides formados como descritos e imagens usando o disco giratório confocal mostrando (i) tubulina de canal microtúbulo com imagem de rodízio rotulado por rhodamina usando um laser de 561 nm, (ii) GFP-MAP65 canal de imagem do GFP usando um laser de 488 nm, e (iii) imagem de sobreposição mesclada do canal microtúbulo (magenta) e GFP-MAP65 (cyan). As regiões de sobreposição são exibidas como brancas e demonstram que os microtúbulos e MAP65 se colocam exatamente. Barra de escala = 10 μm para todas as imagens em (A). (B) Quantificação do comprimento e largura do tactóide. i Imagem de um tatoide a ser analisado sem rótulos. Barra de escala = 5 μm. (ii) Mesma imagem que em (i), onde as medidas de comprimento (linha sólida com tampas de linha) e largura (linha tracejada) são denotadas. Barra de escala = 5 μm. (iii) A largura foi medida tomando o perfil de intensidade através do tatoide no bisetor perpendicular (linha tracejada) denotado (ii). O perfil de intensidade foi adequado a uma função gaussiana para revelar a amplitude e largura do tatoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise FRAP: microtúbulos, séries temporais MAP65, gráficos de intensidade. Dinâmica de recuperação de fluorescência." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Dados e análises representativas frap. (A) Dados da série de tempo de microscopia de (i) tactóide de microtúbulo e (ii) GFP-MAP65, e (iii) imagem sobreposição de ambos os canais com microtúbulos em magenta e GFP-MAP65 em ciano que foram fotobleachados no momento 63 s e observados por uma intensidade quantificada adicional de 5 minutos (B) da intensidade quantificada (i i ) canal de microtúbulo na região branqueada (círculos magenta) e fundo (círculos cinza escuro) e (ii) canal GFP-MAP65 na região branqueada (quadrados de ciano) e no fundo (quadrados cinza escuro). (C) Os dados foram corrigidos para o ruído de fundo e redimensionados para o canal microtúbulo (círculos magenta) e o canal GFP-MAP65 (quadrados de ciano). Os microtúbulos não se recuperam, mas o GFP-MAP65 faz e pode caber (linha cinza escura) a uma crescente decadência exponencial para encontrar a amplitude e a escala de tempo de recuperação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo apresenta um protocolo para a formação de conjuntos de microtúbulos na forma de tatoides usando MAP65, um interlinker de microtúbulos à base de plantas, e PEG como um agente de aglomeração.

Auto-montagem de Tactóides microtúbulos

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Este protocolo permite a auto-organização espontânea de tatoides microtúbulos usando um anti-paralelo cross-linker, MAP65. Este sistema pode nos ajudar a entender a organização de microtúbulos e sistemas biológicos como fusos mitotísticos. A principal vantagem dessa técnica é que é um sistema minimalista que pode recriar formas semelhantes a fusíveis para microtúbulos altamente reprodutíveis e acessíveis a muitos laboratórios.Este método não é apenas aplicável aos sistemas celulares, mas também pode servir como modelo para estudos de cristal líquido em escala de meso. Para preparar a tubulina, primeiro retire uma alíquota de tubulina sem rótulo contendo um miligrama de tubulina liofilizada do congelador de menos 80 graus Celsius e mantenha-a no gelo. Em seguida, adicione 200 microliters de PEM-80 frios.Para dissolver todo o liofilato, mantenha o tubo no gelo por 10 minutos. Em seguida, retire um tubo de tubulina com rótulo de rhodamina contendo 20 microgramas de pó de tubulina liofilizada do congelador de menos 80 graus Celsius e mantenha-o no gelo. Em seguida, adicione quatro microliters de PEM-80 frios e mantenha o tubo no gelo por 10 minutos para dissolver todo o lyophilato.Uma vez que as tubulinas liofilizadas tenham dissolvido, adicione 100 microliters da solução de tubulina sem rótulo resuspended à solução de tubulina de quatro microlitrados com rótulo de rhodamina. Em seguida, misture as soluções por tubulação seis a sete vezes muito lentamente. Para armazenar os 100 microliters restantes da solução de tubulina sem rótulo, primeiro, insira o tubo em nitrogênio líquido para congelar a solução, em seguida, mantenha o tubo a menos 80 graus Celsius para uso futuro.Em seguida, distribua a mistura de tubulina em sete novos tubos adicionando 15 microliters em cada. Congele os tubos em nitrogênio líquido como demonstrado anteriormente e armazene-os a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Para montar câmaras de fluxo para a realização de experimentos, primeiro, limpe um escorregador de vidro com água duplamente destilada e seque-a com um lenço de laboratório sem fiapos.Em seguida, limpe o escorregador primeiro com etanol seguido de água duplamente destilada. Para criar um caminho de fluxo, corte um pedaço de fita dupla face de 40 a 50 milímetros. Em seguida, divida-o no meio para criar duas tiras mais finas de fita e coloque as duas tiras no slide de cinco a oito milímetros de distância.Em seguida, coloque deslizamentos de cobertura silanizados em cima do caminho de fluxo. Em seguida, sele o slide e a tampa escorregou as tiras de fita de dois lados pressionando suavemente a região da fita com a parte de trás de uma caneta. Se o selo for bem feito, a fita deve passar de translúcida para clara.Para remover a fita extra nas bordas, corte a fita com uma lâmina de barbear, deixando apenas um milímetro da entrada da câmara de fluxo. Em seguida, rotule a câmara com parâmetros experimentais apropriados Para realizar os experimentos de tatoide, primeiro, descongele todos os reagentes necessários no gelo e armazene-os no gelo durante o trabalho. Em seguida, cubra a câmara de fluxo com 20 microlitradores de 5% de bloco não iônico copolímero surfactante dissolvido em PEM-80 com pequenas gotas nas duas extremidades da câmara para evitar a formação de bolhas de ar no interior.Em seguida, mantenha a câmara de fluxo em uma câmara úmida feita de placa de Petri com um lenço de laboratório molhado e sem fiapos por pelo menos cinco a sete minutos. Em seguida, misture PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, dithiothreitol, glicose, polietileno glicol, a mistura de tubulina feita anteriormente, e MAP65 com GFP MAP65 para visualização em um tubo estéril por tubos de cinco a seis vezes, mantendo o tubo no gelo. Em seguida, adicione um microliter de uma solução pré-misturada de glicose oxidase e catalase no tubo da mistura tubulina-MAP e misture novamente por tubulação sete a oito vezes.Divida o volume total da solução em duas porções a serem usadas em câmaras separadas. Enquanto isso, o líquido adicionado mais cedo à câmara de fluxo deve ser removido por ação capilar usando um lenço de laboratório sem fiapos na outra extremidade da câmara, juntamente com a adição da mistura tubulina-MAP à câmara de fluxo. Uma vez que a amostra esteja totalmente dentro da câmara, sele as duas extremidades da câmara usando epóxi de cinco minutos e mantenha-a a 37 graus Celsius por cerca de 30 minutos para nuclear e cultivar tatoides microtúbulos.Para a imagem dos tactóides por microscopia de fluorescência, utilize objetivos com uma abertura numérica de 1,2 ou mais em 60X ou ampliação superior para coletar luz suficiente em fluorescência. Grave as imagens com um semicondutor de óxido de metal gratuito ou uma câmera de dispositivo acoplado por carga. Para manter a amostra, mantenha-a em uma câmara ambiental fixada a 37 graus Celsius.Alternativamente, outros aquecedores de palco, incluindo aquecedores de palco de ar quente e coleiras objetivas controladas pela temperatura com água quente circulante, podem ser empregados para este fim. Como fontes de excitação apropriadas são essenciais para a fluorescência correta para tubulina de rhodamina, use um laser de 561 nanômetros com pelo menos um milímetro de potência na amostra para imagens de boa qualidade. No entanto, para o GFP MAP65, mude a fonte de excitação para um laser de 488 nanômetros.Se usar microscopia de epifluorescência de campo largo, use um cubo de filtro de rhodamina com uma excitação de 540 12,5 nanômetros,dicroico de 545 nanômetros 12,5 nanômetros de corte e emissão de 575 nanômetros de passagem longa. Para o MAPA GFP, use um cubo de filtro GFP com excitação de 480 15 nanômetros,dicâmico de 505 nanômetros 15 nanômetros cortados e emissão de 515 nanômetros de passagem longa. Depois de garantir que o poder de iluminação e os tempos de exposição sejam tais que a escala de intensidade para a câmera não esteja saturada, leve pelo menos 10 imagens de diferentes áreas para visualizar mais de 100 tatoides nos canais vermelho e verde, e guarde-os como imagens TIFF de 16 bits para análise.Usando este protocolo, tatoides microtúbulos cuja formação é concluída dentro de 30 minutos podem ser diretamente visualizados sob o microscópio. Os tatoides são visíveis com um laser de 561 nanômetros no canal da tubulina e um laser de 488 nanômetros no canal MAP65. As imagens também se sobrepõem perfeitamente umas com as outras.Neste método, o comprimento e largura dos tatoides também poderia ser medido. O perfil de intensidade de um tatoide foi encontrado variando com sua largura. Além disso, a natureza imóvel dos táctóides microtubulos foi demonstrada pela recuperação da fluorescência após experimentos foto-branqueamento ou FRAP, que não mostraram qualquer recuperação da fluorescência após o branqueamento fotográfico.Por outro lado, experimentos FRAP revelaram uma natureza móvel do MAP65, para a qual uma recuperação gradual e fluorescência poderiam ser observadas após o branqueamento fotográfico. Esta recuperação de fluorescência pelo MAP65 pode ser adequada a uma crescente decadência exponencial para encontrar a amplitude e a escala de tempo de recuperação. A parte do experimento tatoide deve ser concluída dentro de 10 a 12 minutos, pois a tubulina pode ir mal no gelo rapidamente, o que pode ser prejudicial à nucleação de tatoides.O futuro trabalho com diferentes proteínas transversais de microtúbulos e proteínas motoras transversais, enzimas que podem mover microtúbulos, continuarão a expor novas informações sobre a auto-organização do fuso mitotístico.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve o TIRF, uma técnica baseada em microscopia de reflexão interna total para visualizar a dinâmica de polimerização de actina e microtúbulos. O método permite a imagem de alta resolução da dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos em tempo real, o que é essencial para a compreensão das diafonias celulares.

Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Os microtúbulos são inerentemente instáveis ​​polímeros, e sua alternância entre crescimento e redução é estocástico e difícil de controlar. Aqui nós descrevemos protocolos utilizando microtúbulos segmentados com tampas de estabilização photoablatable. Despolimerização dos microtúbulos segmentados pode ser acionado com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim a análise de movimentos com a desmontagem extremidades dos microtúbulos.

Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Apresentamos aqui métodos para a preparação de nemática ativa a partir de microtúbulos e motores de cinesina, incluindo a preparação e construção de proteínas e o uso de poços para confinamento nemático ativo.

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Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal

Neste trabalho, é descrito um método para medir o consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução em permeabilized avermelhado da drosófila. Esta técnica requer uma quantidade mínima de tecido, em comparação com a técnica de isolamento mitocondrial clássico e os resultados obtidos são fisiologicamente mais relevantes.

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Aqui nós apresentamos um protocolo para murino na vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular com biotina. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar endógena imunoprecipitação da proteína de interesse.

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