Uma abordagem fotodinâmica no estudo da função da ruptura de vesículas intracelulares
17 de março de 2023
A inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) mediada por AlPcS2a é uma ferramenta poderosa para estudar danos espaço-temporais de vesículas intracelulares (IVs) em células vivas.
A endocitose da vesícula em citoplasia resulta na formação de vesículas intracelulares. A permeabilização da vesícula ativa várias vias de sinal. A inativação do laser assistida por cromóforos é usada para estudar a consequência da ruptura da vesícula intracelular.
Um controle espacial e temporal do dano subcelular às vesículas intracelulares pode ser obtido ajustando a condição ortostática e a iluminação luminosa. Para começar, mantenha a cultura de células HeLa em DMEM suplementado com 10% FBS. Depois de lavar as células com PBS, Trypsinize as células.
Em seguida, ressuspenda as células em DMEM suplementado com 10% FBS. Diluir 300 nanogramas do plasmídeo Gal3-GFP em 25 microlitros de meio sérico reduzido. Em seguida, adicione 0,6 microlitros de reagente P3000.
E misture delicadamente, seguido de agitar a solução. Diluir 0,45 microlitros do reagente Lipofectamina 3000 em 25 microlitros de soro reduzido e misturar suavemente. Incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, misturar o DNA diluído e a Lipofectamina 3000 diluída e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois de misturar a mistura de DNA lipofectamina, 300.000 células HeLa suspensas e 200 microlitros de DMEM com 10% FBS, semeie as células na região central de vidro de uma placa de botão de vidro de 35 milímetros. Para permitir a fixação celular, incube as células a 37 graus Celsius na incubadora abastecida com 5% de dióxido de carbono por pelo menos quatro horas.
Diluir AlPcS2a em DMEM suplementado com 10% FBS para fazer uma solução de AlPcS2a micromolar. Pré-aqueça o meio contendo AlPcS2a em banho-maria de 37 graus Celsius e substitua o meio de cultura pelo meio contendo AlPcS2a. Incubar as células a 37 graus Celsius na incubadora abastecida com 5% de dióxido de carbono durante a noite.
No dia seguinte, lavar as células duas vezes com PBS para remover AlPcS2a extracelular após substituir o meio por meio fresco. Incubar a 37 graus Celsius durante quatro horas para permitir que o corante residual ao longo da via endocítica se acumule nos lisossomas. Para manipular células isoladas danificando lisossomos, coloque a placa de cultura no palco de um microscópio confocal.
Use os lasers de 488 nanômetros e 561 nanômetros para excitar GFP e AlPcS2a, respectivamente. Circule uma região quadrada de cinco por cinco micrômetros de interesse nas vesículas marcadas com AlPcS2a que são selecionadas para serem danificadas. Em seguida, o pulso ilumine a região de interesse com um laser de 633 nanômetros de 0,21 miliwatt, ou 70 repetições.
Monitorar a formação de pontos de Gal3 como um indicador de permeabilização da membrana lisossomal. A coloração lisossômica com AlPcS2a em células HeLa foi realizada usando marcadores disponíveis comercialmente, e foram coradas positivamente com corante verde fluorescente. Os lisossomos em células HeLa expressas por TagRFP-Galectin3 foram corados com AlPcS2a.
Seguido pela focalização da iluminação com luz infravermelha próxima, os resultados indicam que a inativação do laser assistida por cromóforos baseada em AlPcS2a foi capaz de controlar a ruptura lisossômica local dentro da região de interesse, deixando o restante dos lisossomos intactos. Essa etapa é importante, pois o tempo de incubação determinará os endossomos ou lisossomos em pé. Por exemplo, as pessoas podem determinar o tamanho de pela liberação de corante impermeável à membrana.
Também pode usar corantes sensíveis ao pH como FITC dextran para diferenciar endossomos e lisossomos. Esta técnica é útil a partir dos efeitos a jusante da ruptura da membrana da vesícula intracelular. E há efeitos a jusante em várias situações.
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Visão Geral
A inativação a laser assistida por cromóforo (CALI) mediada por AlPcS 2a é utilizada para investigar os danos espaço-temporais em vesículas intracelulares em células vivas. Esta técnica permite um controle preciso sobre danos subcelulares, fornecendo insights sobre as consequências da ruptura de vesículas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Imagem de Células Vivas
Antecedentes
- A endocitose leva à formação de vesículas intracelulares.
- A permeabilização de vesículas ativa diversas vias de sinalização.
- A CALI é um método para estudar os efeitos da ruptura de vesículas.
- O controle espacial e temporal é alcançado por meio da iluminação com luz.
Objetivo do Estudo
- Explorar a dinâmica da lesão de vesículas intracelulares.
- Compreender as vias de sinalização ativadas pela ruptura de vesículas.
- Aprimorar técnicas para estudar interações em células vivas.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células HeLa em DMEM com 10% de FBS.
- Lavagem das células com PBS antes do experimento.
- Tripsinização das células para análise.
- Aplicação de CALI para induzir dano localizado.
Resultados Principais
- Demonstrou controle eficaz sobre danos em vesículas.
- Identificou vias de sinalização-chave ativadas após a ruptura.
- Validou o uso de CALI em estudos em células vivas.
- Forneceram informações sobre os mecanismos de funcionamento das vesículas.
Conclusões
- CALI é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica intracelular.
- Os achados aprimoram a compreensão da sinalização relacionada a vesículas.
- Estudos futuros podem se basear nestes métodos para obter insights mais profundos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A inativação assistida por cromóforo com laser (CALI) permite a indução precisa e espaciotemporal da ruptura de vesículas intracelulares, fornecendo um sistema controlado para investigar eventos de permeabilização da membrana. Essa abordagem favorece a desmistificação mecanicista e a validação de alvos, permitindo a manipulação e o monitoramento seletivos da integridade endossomal e lisossomal em células vivas. O método aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, associando a ruptura de vesículas a sinalização downstream e recrutamento molecular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da integridade da membrana de vesículas e seu papel em vias de sinalização.
- Apoia a validação funcional do recrutamento de proteínas ligadoras de glicanos, como a galectina-3, após a ruptura da vesícula.
- Facilita a eliminação de riscos mecanicistas ao isolar os efeitos da permeabilização direcionada de organelas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece uma plataforma para o desenvolvimento de ensaios quantitativos baseados em imagem para monitorar a ruptura de vesículas e o recrutamento molecular.
- Permite a padronização de ensaios por meio da indução controlada e localizada de permeabilização da membrana.
- Permite a avaliação reprodutível dos efeitos de compostos sobre a estabilidade endossomal e lisossomal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças em que a integridade das vesículas afeta a sinalização celular e a patologia.
- Apóia a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, permitindo estudos dos efeitos decorrentes da ruptura de vesículas.
- Facilita decisões de avanço com ajuste de risco, fornecendo informações mecanicistas sobre as respostas celulares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa abordagem fotodinâmica integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a manipulação orientada por hipóteses e a detecção de eventos de ruptura de vesículas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o papel da permeabilização de vesículas na sinalização e no recrutamento de proteínas.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece pontos finais mensuráveis, como a formação de pontos de galectina-3 e liberação de corante, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas a modelos celulares relevantes para doenças nas quais o rompimento de vesículas está implicado.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular e reutilizável para o estudo da dinâmica de membranas em diversos tipos celulares e condições.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos sobre sinalização relacionada a vesículas.
- Valor Operacional: Padroniza a indução e a medição da ruptura de vesículas para obter resultados reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao esclarecer as consequências funcionais da permeabilização da membrana.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e vias influenciados pela integridade da vesícula.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em imagem de células vivas e manipulação fotodinâmica.
- Requer acesso à infraestrutura de microscopia confocal e iluminação a laser.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de aquisição de imagens e análise.
- Adaptável a diversas linhagens celulares e marcadores de organelas com controles apropriados.
- Depende da calibração precisa dos parâmetros do laser e das concentrações do corante para reprodutibilidade.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
