Preparação do tecido miocárdio humano para cultivo a longo prazo

Usando este protocolo, fatias de tecido ventricular esquerdo humano podem ser cultivadas ex vivo em uma câmara biomimética. A aplicação de pré e pós-carga melhora a semelhança do ambiente fisiológico. Esta técnica permite o registro contínuo de contração tecidual.

Os protocolos de estimulação definidos pelo usuário permitem a avaliação de parâmetros vitais de contração, como potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário. O cultivo a longo prazo de fatias de miocárdio, utilizando essa configuração, abrirá caminho para futuras pesquisas ex vivo, facilitando essa triagem para efeitos terapêuticos e cardiotóxicos na medicina cardiovascular. Para começar, submergir as câmaras de cultivo e os eletrodos de grafite em um litro de uma solução isopropanol de 10% e agitar durante a noite.

No dia seguinte, transfira as câmaras para uma solução de isopropanol 100% por 3 minutos e, em seguida, permita que as câmaras e eletrodos de grafite sequem sob um capô de fluxo laminar. Conecte uma placa de circuito a cada câmara de acordo com as posições disponíveis no roqueiro. Coloque dois eletrodos de grafite na placa do circuito de acordo com as instruções do fabricante e coloque uma tampa de placa de Petri de 35 milímetros na câmara para evitar infecções.

Em seguida, encha a bandeja de corte de até 90 a 95% com tampão de corte. Transfira a amostra de tecido para uma placa de Petri de 100 milímetros cheia de tampão de corte frio, e coloque a placa em uma placa de resfriamento a 4 graus Celsius. Remova a trabecula do endocárdio segurando o endoárdio com pinças e use uma tesoura para cortar aproximadamente 3 milímetros de tecido endocárdio.

Fixar a amostra de tecido cortado, lado endocárdio até um patch de borracha de 2 por 2 centímetros usando quatro agulhas de calibre 0,9 por 70 milímetros de calibre 20 que são fixadas em uma posição quadrada. Certifique-se de que a borda diagonal de cada ponta da agulha está apontando para dentro, melhorando a fixação e evitando danos ao miocárdio. Usando um bisturi, corte todo o excesso de tecido fora dos quatro quadrados de agulha.

Usando pinças, coloque a amostra aparada em um pedaço de tecido estéril por 10 segundos para remover o excesso de tampão de corte. Em seguida, remova a seringa agarose do banho de água e submerse a amostra em agarose. Deixe a agarose solidificar por cinco minutos em uma placa de resfriamento.

O lado endocárdio da amostra deve ser visível na agarose. Usando pinças, coloque o lado epicárido da amostra contida em agarose em cima da área colada e pressione suavemente a amostra contendo agarose do topo com uma ferramenta sem cortar ou danificar a agarose. Deixe a cola se solidificar por 1 minuto.

Defina a amplitude de vibração para 1 milímetro, velocidade inicial de corte para 0,07 milímetros por segundo, e espessura da fatia para 300 mícrons. Depois de conectar o sistema de cultivo a um computador, inicie o programa de software correspondente. Defina a velocidade do roqueiro para 60 rpm e predefina os parâmetros de estimulação.

Para fatias cardíacas humanas, defina a estimulação padrão para impulsos bifásicos com 50 miliamperes ou corrente composta por 3 milissegundos de corrente positiva, 1 milissegundo pausa, e um pulso de 3 milissegundos de corrente invertida a uma taxa de ritmo de 30 batidas por minuto ou bpm, em seguida, verifique os indicadores de eletrodos do software e verifique se os eletrodos das câmaras de cultivo estão funcionando corretamente. Usando pinças, separe a ágarose do tecido. Evite tocar o tecido e manuseá-lo cuidadosamente, pois qualquer dano ao tecido reduzirá a taxa de sucesso do cultivo.

Para anexar dois triângulos plásticos a uma amostra, coloque 1 microliter de cola em uma tampa estéril da placa de Petri. Use uma pinça ligada para pegar um triângulo plástico autoclaved. Mergulhe rapidamente a borda frontal do triângulo na cola e cole o triângulo na amostra perpendicular ao alinhamento cardiomioceste.

Repita para o outro triângulo. Usando um bisturi, corte o tecido que exceda a largura do triângulo e coloque a fatia com os dois triângulos montados de volta na bandeja de corte contendo tampão de corte. Remova a câmara de cultivo de preenchimento médio da incubadora.

Selecione uma fatia preparada e insira-a na câmara conectando um triângulo a cada pino. Ajuste a distância entre os pinos de montagem até o tamanho da amostra. Certifique-se de que a amostra está submersa no meio.

Depois de colocar o prato no roqueiro, diminua a pré-carga girando o parafuso de ajuste no sentido anti-horário até que a linha de base do gráfico correspondente na tela do computador não mude mais, em seguida, aumente cuidadosamente a pré-carga ou tensão girando o parafuso de ajuste no sentido horário. Para câmaras com alta rigidez, continue até que a linha de base correspondente no gráfico tenha aumentado em 1.000 para 1.200 unidades correspondentes a uma pré-carga milinovto. Depois de preparar o meio de cultivo fresco, pré-aqueça o meio em um banho de água ou incubadora de ar quente a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos.

Retire o meio da câmara, deixando aproximadamente 0,8 mililitros na câmara, em seguida, adicione 1,6 mililitros de médio fresco para a mesma câmara, fazendo um volume total de médio a 2,4 mililitros por câmara. Por fim, coloque a tampa da câmara de volta e coloque a câmara de cultivo em sua respectiva posição. A leitura da contração de cinco fatias de miocárdio durante uma estimulação típica consistiu em quatro seções distintas de potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário.

Em comparação com o controle, a força de contração das fatias tratadas com antagonistas de cálcio, nifedipina e calciseptina, foi diminuída em 10 minutos. Em contraste, o agonista do canal de cálcio fechado de voltagem, Bay-K8644, aumentou a força de contração. A potencialização pós-pausa do controle e das fatias tratadas foi avaliada para a liberação intracelular de cálcio do ânticulo sarcoplasmático.

A fatia de controle não mostrou nenhuma mudança. Na presença de calciseptina e nifedipina, a inibição dos canais de cálcio do tipo L levou à potencialização da primeira contração após uma pausa de 50 segundos, refletindo uma maior contribuição relativa da liberação intracelular de cálcio à contratilidade total. O efeito oposto foi observado com Bay-K8644, que estimula a entrada de cálcio extracelular através dos canais de cálcio do tipo L.

Na análise da relação de frequência de força, não foi observada alteração na fatia de controle. O tratamento da calciseptina não alterou a capacidade da fatia de seguir os estímulos após o aumento da frequência de estimulação ao comparar os dados pré e pós-tratamento. Em comparação com a calciseptina, a nifeipina impediu um aumento da contração a taxas de ritmo mais altas e reduziu a taxa máxima de captura em 80 bpm.

Com Bay-K8644, observou-se aumento da força de contração em frequências de estimulação muito baixas. No entanto, em frequências superiores a 50 bpm, a força de contração foi menor do que durante a condição pré-tratamento. O tecido excisado deve ser rapidamente transferido para 4 graus de cardioplegia.

Após o corte, triângulos plásticos devem ser anexados perpendicularmente à direção da fibra. A pré-carga não deve exceder 1500 mililitros. A cultura de fatias biomiméticas pode ajudar os pesquisadores a utilizar manipulações genéticas, bem como terapias baseadas em células para estudar a regeneração e a reparação no miocárdio humano adulto.