Demonstração do alinhamento da sequência para prever a ferramenta de suscetibilidade entre espécies para avaliação rápida da conservação de proteínas

No contexto da segurança química, o protocolo SeqAPASS fornece um processo rápido e simplificado para avaliar a conservação de proteínas em toda a diversidade de espécies, para extrapolação da toxicidade e do conhecimento da via biológica. O SeqAPASS foi desenvolvido como uma interface baseada na Web simplificada, transparente e fácil de usar para rápida extrapolação entre espécies, destinada ao uso tanto por pesquisadores quanto por tomadores de decisão. A ferramenta aborda o desafio de extrapolar o conhecimento de toxicidade química usando informações disponíveis sobre a sensibilidade das espécies, para prever consistentemente a suscetibilidade química para centenas a milhares de espécies que nunca poderiam ser testadas em um ambiente de laboratório.

Para começar a trabalhar com a ferramenta SeqAPASS, primeiro, navegue até seqapass.epa.gov. Os usuários existentes podem selecionar o botão de login para sua conta. Novos usuários podem criar uma conta selecionando o link na página inicial.

Depois de efetuar login na ferramenta SeqAPASS, navegue até a guia Solicitar Execução do SeqAPASS. O SeqAPASS inclui vários recursos úteis para ajudar os usuários a identificar um alvo de proteína de consulta. Eles podem ser acessados clicando nos botões suspensos em Identificar um alvo de proteína.

Uma vez que um alvo de proteína é identificado, clique em Por Espécie ou Por Adesão em Comparar Sequências de Aminoácidos Primários. Por exemplo, para analisar a conservação do receptor opioide mu, clique em Por Adesão e insira o número de adesão na caixa de adesão à proteína. A menos que uma adesão de proteína já tenha sido identificada pelo usuário, recomenda-se a opção de pesquisa de espécies.

Selecione Executar solicitação para iniciar a consulta. Depois que sua consulta for enviada, selecione a guia Status da Execução do SeqAPASS na parte superior da página para exibir o status da execução enviada. O tempo até a conclusão dependerá do uso atual da ferramenta.

Na guia Exibir Relatórios do SeqAPASS, todas as execuções realizadas em uma determinada conta são listadas. Selecione Exibir Relatório para exibir dados no navegador da Web e clique em Solicitar Relatório Selecionado para abrir a página Informações de Proteína de Consulta de nível um e exibir os resultados e as opções de personalização de dados. Para desenvolver e executar uma análise SeqAPASS de nível dois, avaliando a conservação de domínios de proteína específicos, clique no sinal de adição ao lado do cabeçalho Nível Dois na página Informações de Proteína de Consulta de Nível Um para preencher o menu de consulta de Nível Dois.

Clique na caixa Selecionar Domínio para preencher uma lista de domínios funcionais para a proteína de consulta. Depois que um domínio for identificado a partir do Banco de Dados de Domínio Conservado NCBI e selecionado na lista suspensa SeqAPASS, inicie a consulta de nível dois. Isso é feito clicando no botão Solicitar Execução de Domínio.

Clique em Atualizar Execuções de Nível Dois e Três para preencher os dados de nível dois. Em Exibir Dados de Nível Dois, clique na caixa Selecionar Domínio Concluído para selecionar a adesão concluída ao domínio. Em seguida, você pode clicar no botão Exibir dados de nível dois para abrir os resultados.

Os dados são exibidos na guia Exibir SeqAPASS para o nível selecionado, primeiro, vamos examinar os dados de nível um. Na página Consultar Informações sobre Proteínas, selecione o botão de opção ao lado do relatório principal ou completo para exibir os dados em um formato condensado ou expandido. As espécies terão uma previsão de suscetibilidade de sim ou não, indicando se a proteína está conservada em relação à sequência de consulta.

No relatório, clique na adesão de proteína apropriada ou ID da espécie para vincular aos bancos de dados do NCBI e acessar mais informações. Para explorar os dados de toxicidade correspondentes para as espécies com previsões de susceptibilidade, role até o lado direito da tabela Resultados para visualizar a coluna ECOTOX. Clique em links para abrir as espécies em questão dentro da base de conhecimento ECOTOXicology, onde você pode encontrar dados de toxicidade Além de relatórios completos e primários, um relatório resumido dos dados pode ser visualizado selecionando Exibir Relatório de Resumo de Nível Um.

O relatório de resumo exibe métricas de resumo e previsões de suscetibilidade em grupos taxonômicos. Os dados em qualquer formato de relatório podem ser facilmente baixados. Com o tipo de relatório desejado selecionado, clique em Baixar Tabela para salvá-la como um arquivo de planilha.

Para exibir os dados de nível dois, role até a parte superior da guia Exibir SeqAPASS e selecione Nível Dois. Os dados do SeqAPASS de nível dois são exibidos em relatórios como o do nível um e também estão disponíveis na parte inferior da página Informações sobre a Proteína de Consulta. Selecione o botão de opção ao lado do tipo de relatório desejado para exibir os dados.

Os relatórios de nível dois exibem informações semelhantes às do nível um, com informações adicionais sobre o domínio da proteína. Os dados do SeqAPASS podem ser facilmente visualizados para facilitar a interpretação. Clique no sinal de adição ao lado de Visualização, seguido pelo botão Visualizar Dados, para abrir um BoxPlot interativo em uma nova guia.

Na nova guia, selecione o botão BoxPlot. Na parte superior da página BoxPlot, as opções de controle podem ajudar o usuário a personalizar o gráfico. Os usuários podem adicionar ou remover grupos taxonômicos do gráfico, eles podem selecionar espécies a serem exibidas em uma legenda, escolher como os nomes das espécies são exibidos e destacar subconjuntos de espécies específicas, como espécies ameaçadas ou ameaçadas de extinção.

As visualizações podem ser facilmente exportadas e salvas. Clique em Download BoxPlot para selecionar um tipo de arquivo e baixar a figura. Antes do download, os usuários podem personalizar a resolução do tipo de arquivo da imagem.

Embora as configurações de relatório padrão sejam suficientes para a maioria das análises, os parâmetros podem ser alterados usando os submenus na parte superior do menu Informações de Proteína de Consulta. Para registrar as configurações de relatório atuais, clique no botão Baixar Configurações Atuais do Relatório para baixar um arquivo que capture as configurações atuais aplicadas. Isso pode ser feito para o nível um e nível dois.

Aqui o exemplo é para o nível um. Para iniciar uma análise SeqAPASS de nível três, navegue até a página Informações de proteína de consulta de nível um e clique no sinal de mais ao lado do cabeçalho de nível três para preencher o menu de consulta de nível três que permite comparações individuais de resíduos de aminoácidos. Antes que uma análise de nível três possa ser realizada, resíduos específicos de aminoácidos devem ser identificados por meio de uma revisão da literatura existente.

Clique no sinal de adição ao lado do Gerenciador de Referências para abrir a Ferramenta Gerenciador de Referências. Isso pode ajudá-lo a gerar uma cadeia de caracteres booleana predefinida para consultar a literatura disponível. Clique no link Gerar Google Acadêmico para gerar uma cadeia de caracteres de pesquisa bibliográfica.

Isso pode ser copiado e usado para pesquisar bancos de dados de literatura desejados. Ou, selecionar Pesquisar no Google Acadêmico pesquisará automaticamente a literatura do Google Acadêmico usando a cadeia de caracteres de pesquisa predefinida. Uma vez que os resíduos de aminoácidos tenham sido selecionados, os usuários podem configurar uma análise de nível três.

Selecione a sequência de modelos com a qual as espécies selecionadas pelo usuário serão alinhadas e comparadas. Opcionalmente, sequências de modelos adicionais podem ser inseridas na caixa Comparações Adicionais. Antes de alinhar sequências específicas, os usuários devem inserir um nome de execução definido pelo usuário.

Isso será usado para identificar a execução. Selecione o grupo taxonômico na caixa Escolher Grupo Taxonômico. Deve-se notar que este processo será repetido para todos os grupos taxonômicos para os quais o usuário gostaria de avaliar para conservação.

Depois que todas as espécies desejadas forem selecionadas para alinhamento à sequência do modelo, selecione Solicitar Execução de Resíduos. Depois que todas as espécies estiverem alinhadas, clique em Atualizar Execuções de Nível Dois e Três para preencher o menu Selecionar Nome de Execução de Nível Três com os trabalhos de nível três concluídos. Os dados de nível três podem ser visualizados por grupo taxonômico individual ou em vários grupos taxonômicos.

Clique em Combinar Dados de Nível Três para abrir a caixa de diálogo combinada de nível três e analisar vários grupos taxonômicos juntos ao mesmo tempo. Usando a caixa de diálogo Combinar Relatórios de Nível Três, selecione o modelo de nível três a ser usado como base para comparação. Em seguida, escolha quais trabalhos concluídos serão comparados.

Ordene trabalhos de nível três conforme desejado e clique em Exibir Dados de Nível Três para produzir uma página de relatório de nível três. Na página Informações de Proteína de Modelo de Nível Três, as posições de aminoácidos previamente identificadas na sequência do modelo são exibidas e podem ser selecionadas para alinhamento. Insira posições na caixa de texto separadas por vírgulas ou, alternativamente, selecione na lista de resíduos.

Depois que todas as posições forem inseridas, selecione Copiar para a lista de resíduos para transportar os resíduos para a caixa de seleção. Depois que todas as posições de aminoácidos tiverem sido selecionadas e verificadas quanto à precisão, clique em Atualizar relatório para atualizar as sequências alinhadas com as posições especificadas. Role até a parte inferior da página para exibir um relatório dos resultados.

Como os níveis anteriores, selecione o botão de opção ao lado do relatório principal ou completo para selecionar o tipo de relatório. Os relatórios de nível três exibem espécies e proteínas semelhantes e incluem informações de alinhamento e conservação para cada resíduo de aminoácido avaliado. Para salvar o relatório, clique em Baixar Tabela na parte inferior do relatório e salve-o como um arquivo de planilha.

Os usuários também podem selecionar Exibir Relatório de Resumo de Nível Três para exibir e baixar uma tabela de relatório de resumo. Para exibir uma visualização de dados de nível três, clique no sinal de adição ao lado do cabeçalho da visualização e selecione Visualizar dados para abrir uma nova página. Clique em Mapa de calor na página de informações de visualização para abrir o gráfico interativo e os controles.

Na página de visualização em Controles, selecione os grupos taxonômicos a serem exibidos no mapa de calor, transporte-os usando o botão de seta e reordene, se desejado. Por padrão, a visualização do mapa de calor exibe o nome comum da espécie, as previsões gerais de suscetibilidade e o status de correspondência de cada resíduo de aminoácido. As opções para manipular as configurações do mapa de calor estão nos menus expansíveis sob o título Controle.

Em Opções de Relatório, um relatório simples ou completo pode ser selecionado e as espécies exibidas podem ser alternadas entre nomes comuns ou científicos. Em Seleções Opcionais, subconjuntos de espécies, como candidatos a ortolog, espécies ameaçadas, espécies ameaçadas e organismos modelo comuns, podem ser selecionados e destacados no mapa de calor. Em Configurações do Mapa de Calor, as informações exibidas no mapa de calor podem ser personalizadas, desmarcando e marcando as caixas.

As previsões de suscetibilidade e o texto de suscetibilidade podem ser removidos, e os alinhamentos de aminoácidos e informações de aminoácidos podem ser removidos. Para salvar a visualização do mapa de calor, clique em Baixar Mapa de Calor e escolha o tipo de arquivo desejado. O SeqAPASS apresenta um relatório de resumo de decisão, que permite aos usuários avaliar rapidamente as previsões de suscetibilidade entre níveis e espécies simultaneamente.

Clicar em Enviar Nível para o Relatório DS nas Páginas de Resultados ou Visualização de Dados transferirá os dados para a guia Relatório DS, onde todos os níveis de análises podem ser combinados e exibidos. Os resultados da análise de nível um para o receptor opioide mu mostram um ponto de corte de suscetibilidade de 55%, com semelhanças percentuais para mamíferos, aves, répteis, anfíbios e a maioria das espécies de peixes que estão acima desse ponto de corte e recebem uma previsão de suscetibilidade de Sim. Essas caixas completamente abaixo do ponto de corte recebem uma previsão de suscetibilidade de um não.

A análise de nível dois para o domínio funcional do opioide mu identificou um ponto de corte de suscetibilidade mais alto de 88% de similaridade com mamíferos, aves, répteis, anfíbios e a maioria das espécies de peixes acima desse ponto de corte, fornecendo outra linha de evidência para a conservação, ou o receptor opioide mu entre os vertebrados. Dentro da análise de nível três, todas as espécies avaliadas resultaram em uma predição de suscetibilidade de sim. Como esses aminoácidos são importantes na ligação de agonistas fortes do receptor opioide mu e antagonistas fortes, esses dados sugerem que os compostos opioides direcionados aos receptores humanos podem interagir de forma semelhante com os receptores entre as espécies de vertebrados.

O nível três do SeqAPASS é útil para a geração de hipóteses. Mesmo que os resíduos críticos de aminoácidos não sejam conhecidos pela proteína de interesse, a ferramenta pode ser usada para olhar através das espécies e identificar onde a conservação existe ou é menos conservada. Essas hipóteses podem então ser testadas com técnicas de biologia molecular, como estudos de mutagênese direcionada ao local.

O foco inicial do SeqAPASS foi em alvos químicos. No entanto, nossa pesquisa está se expandindo para explorar enzimas metabolizadoras primárias, proteínas de transporte, bem como proteínas envolvidas na bioacumulação.