Fabricação e Caracterização de Nano-Matriz de Base Janus Camada por Camada para Promover a Regeneração da Cartilagem
6 de julho de 2022
Este protocolo descreve a montagem de um andaime de nanomatriz de base Janus (JBNm) camada por camada, adicionando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e Fator de Crescimento Transformador Beta-1 (TGF-β1) sequencialmente. O JBNm foi fabricado e caracterizado; além disso, apresentou excelente bioatividade, estimulando funções celulares como adesão, proliferação e diferenciação.
Este protocolo mostra como montamos e caracterizamos a camada por camada JBNm em um nível molecular. O JBNm encapsula o TGF-B1 e impede sua liberação no tecido circundante, promovendo assim a condrogênese localizada. A formação do JBNm é padronizada, permitindo que diferentes JBNms sejam formados para futuras aplicações.
A estrutura única camada por camada permite o encapsulamento do fator de crescimento, criando uma liberação localizada constante, o que evita a hipertrofia e sustenta o crescimento. O JBNm fornece um microambiente homeostático para a regeneração do tecido cartilaginoso, dentro de um local confinado, devido à sua injetabilidade, que pode ser usada para diferentes cenários, como fraturas ou cavidades de forma irregular. Para começar, adicione oito microlitros de um miligrama por mililitro de TGF-B1, suspenso em água a 32 microlitros de um miligrama por mililitro de Matrilin-3 suspenso em água.
Pipeta para garantir a mistura adequada dessas proteínas. Adicione 80 microlitros de um miligrama por mililitro. Nanotubos de base de Janus, ou JBNts suspensos em água, para a solução de TGF-B1, Matrilin-3.
Pipeta repetidamente para garantir a mistura adequada. Para o grupo JBNt, adicione cinco microlitros de um miligrama por mililitro, JBNts a 50 microlitros de água para fazer uma solução de 90,9 microgramas por mililitro. Para o grupo Matrilin-3, adicione 40 microlitros de 10 microgramas por mililitro de Matrilin-3 a 15 microlitros de água, para fazer uma solução de 7,3 microgramas por mililitro.
Para o grupo TGF-B1, adicione 10 microlitros de 10 microgramas por mililitro, de TGF-B1 a 45 microlitros de água, para fazer uma solução de 1,8 micrograma por mililitro. Para o grupo Janus Base Nano-Matrix ou JBNm, adicione 40 microlitros de 10 microgramas por mililitro, Matrilin-3 a 10 microlitros de 10 microgramas por mililitro de TGF-B1. Agite para garantir uma mistura adequada.
Em seguida, adicione cinco microlitros de um miligrama por mililitro JBNts à solução, repetidamente pipetando para misturar a amostra. Usando um espectrofotômetro, meça o espectro de absorção de cada grupo. Rotule o TGF-B1 usando um kit de rotulagem de proteínas, seguindo as instruções do fabricante.
Adicione 20 microlitros de 20 microgramas por mililitro, rotulados TGF-B1, a 25 microlitros de água, para fazer uma solução de teste de 8,9 microgramas por mililitro. Rotule o Matrilin-3 usando um kit de rotulagem separado. Adicione 20 microlitros de 80 microgramas por mililitro rotulado Matrilin-3 a 25 microlitros de água, para fazer uma solução de teste de 36 microgramas por mililitro.
Misture 20 microlitros de 80 microgramas por mililitro rotulado Matrilin-3 com 20 microlitros de 20 microgramas por mililitro rotulado TGF-B1 e cinco microlitros de água, resultando em um composto TGF-B1, Matrilin-3 rotulado. Pipetar a mistura várias vezes para misturar. Adicione cinco microlitros de um miligrama por mililitro JBNts a 40 microlitros de água, resultando em uma solução de 111 microgramas por mililitro.
Em seguida, adicione cinco microlitros de um miligrama por mililitro JBNts à solução de TGF-B1, Matrilin-3 rotulada e repetidamente pipeta para misturar o composto. Transfira cada grupo de amostras para o poço de uma placa preta de 384 poços. Carregue a placa em um leitor de microplacas multimodo e faça medições em comprimentos de onda de excitação de 488 e 555 nanômetros seguindo os protocolos do fabricante.
Em condições fisiológicas, o espectro potencial zeta da Matrilina-3 foi carregado negativamente devido ao seu ponto isoelétrico. Após a adição do TGF-B1 ao Matrilin-3, o potencial zeta do composto TGF-B1 Matrilin-3 aumentou para um valor quase neutro. O potencial zeta do JBNm foi o maior entre os três grupos.
Os espectros de absorção visível UV confirmaram a formação da estrutura interior camada por camada do JBNm, os anéis aromáticos das cadeias laterais de lisina e os JBNts contribuíram para os picos de absorção, a 220 e 280 nanômetros, respectivamente. O ETM foi utilizado para caracterizar a morfologia dos JBNts e JBNm. Após a combinação com proteínas, feixes espessos de JBNm foram observados formando uma estrutura de andaime.
A microscopia de fluorescência confirmou a presença da estrutura camada por camada e demonstrou a seção transversal do JBNm. Após a marcação, a fluorescente vermelha Matrilin-3 envolveu os feixes JBNt e formou a camada externa do JBNm, enquanto a fluorescente verde TGF-B1 formou uma camada interna. A transferência de energia de ressonância de fluorescência apresentou picos de emissão de 520 nanômetros para os grupos TGF-B1 marcados e 570 nanômetros para os grupos Matrilin-3.
O efeito do JBNm na adesão e proliferação celular do HMSC foi explorado. O JBNm mostrou HMSCs agrupados junto com ele mesmo, enquanto menos células aderiram ao JBNts. O alinhamento das células e o tamanho das células no JBNm demonstraram que o JBNts desempenhou um papel na adesão celular, enquanto as proteínas aumentaram a afinidade da adesão celular.
Após o primeiro dia de cultura celular, os grupos JBNm e TGF-B1 apresentaram proliferação celular significativa em comparação com os demais grupos. Quando a duração da estrutura celular foi aumentada para três e cinco dias, os grupos JBNm e TGF-B1 demonstraram ainda mais aumento da proliferação celular. Ao marcar fluorescentemente o JBNm, é importante que o TGF-B1 e o Matrilin-3 sejam rotulados individualmente e misturados antes de adicionar os JBNts, para permitir a formação adequada da estrutura camada por camada.
Uma avaliação mais aprofundada do andaime pode fornecer uma compreensão de como eles são eficazes em tratamentos terapêuticos. Mais especificamente, um ensaio de proliferação de alto rendimento pode determinar a dosagem ideal in vitro e, mais tarde, in vivo. Esta nova criação do NanoMatriX permite que os pesquisadores utilizem um andaime injetável à base de nanomateriais para regenerar a cartilagem.
Esta abordagem de polimimetização permite uma androgênese aprimorada e a proliferação do contra-local.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra a montagem e caracterização de um arcabouço nano-matricial de base Janus camada por camada (JBNm). O JBNm encapsula TGF-β1, promovendo condrogênese localizada e fornecendo um microambiente homeostático para a regeneração do tecido cartilaginoso.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biomateriais
- Engenharia de Tecidos
- Medicina Regenerativa
Antecedentes
- Nanotubos de base Janus (JBNts) são utilizados na montagem de scaffolds.
- O TGF-β1 é crucial para promover funções celulares.
- A estrutura de JBNm permite a liberação controlada de fatores de crescimento.
- A injetabilidade de JBNm permite a aplicação em defeitos de formato irregular.
Objetivo do Estudo
- Criar um andamio que suporte a regeneração do tecido cartilaginoso.
- Padronizar a formação de JBNm para diversas aplicações.
- Encapsular fatores de crescimento para liberação sustentada e evitar a hipertrofia.
Métodos Utilizados
- Adição sequencial de TGF-β1 e Matrilin-3 para formar JBNm.
- Caracterização do andamio em nível molecular.
- Avaliação da bioatividade relacionada à adesão e proliferação celular.
- Avaliação da injetabilidade do andamio para aplicações práticas.
Resultados Principais
- O JBNm exibiu excelente bioatividade, promovendo funções celulares.
- Foi obtida a liberação localizada de TGF-β1, potencializando a condrogênese.
- O andame manteve um ambiente homeostático para a regeneração tecidual.
- A formação padronizada permite aplicações versáteis na engenharia de tecidos.
Conclusões
- O suporte JBNm camada por camada é eficaz para a regeneração da cartilagem.
- A encapsulação de fatores de crescimento é benéfica para a reparação localizada do tecido.
- Este método pode ser adaptado para diversos cenários clínicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A nano-matriz de base Janus camada-a-camada (JBNm) permite a localização precisa de fatores de crescimento e o controle sustentado do microambiente, abordando um desafio fundamental na medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Esta plataforma oferece confiança preditiva na triagem de biomateriais em estágios iniciais e reduz os riscos no avanço translacional, minimizando efeitos fora do alvo e hipertrofia. Sua montagem padronizada e injetabilidade a posicionam como uma capacidade reutilizável para diversos modelos pré-clínicos de reparo da cartilagem.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da condrogênese mediada por fatores de crescimento em microambientes controlados.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao isolar os efeitos do TGF-β1 em scaffolds confinadas.
- Facilita a validação funcional das interações biomaterial-proteína para regeneração tecidual.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece um suporte padronizado e reproduzível para ensaios quantitativos de adesão e proliferação celulares.
- Permite a avaliação de alto rendimento da composição do suporte e encapsulamento de fatores de crescimento.
- Oferece resultados consistentes e quantificáveis para avaliação comparativa de candidatos a biomateriais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos relevantes para doenças ao apoiar a regeneração localizada da cartilagem in vitro e in vivo.
- Mantém a continuidade translacional por meio de formatos de andaimes injetáveis e adaptáveis para defeitos irregulares.
- Reduz o risco de hipertrofia e efeitos fora do alvo, apoiando decisões de avanço ajustadas ao risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A plataforma JBNm integra desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica, permitindo testes de hipóteses, desenvolvimento de ensaios e pesquisas translacionais em fluxos de trabalho de reparo da cartilagem.
- Biologia da Descoberta: Apoia a avaliação baseada em hipóteses dos efeitos de fatores de crescimento em microambientes projetados.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis para adesão e proliferação celular.
- Análises: Permite medições de UV-Vis, fluorescência e potencial zeta para caracterização de scaffolds.
- Pesquisa Translacional: Facilita a continuidade do rastreamento in vitro até modelos de regeneração de cartilagem in vivo.
- Reutilização Empresarial: A montagem padronizada permite adaptação em diversos programas de biomateriais e engenharia de tecidos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na regeneração tecidual mediada por estruturas e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece protocolos padronizados e escaláveis para fabricação e análise reprodutíveis de estruturas.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/interromper o desenvolvimento, minimizando efeitos off-target de fatores de crescimento.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos a biomateriais para pipelines de medicina regenerativa.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em montagem de biomateriais, marcação de proteínas e técnicas de caracterização de scaffolds.
- Necessita acesso à infraestrutura de espectrofotometria, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
- Exige padronização entre equipes para preparação e análise reprodutíveis de scaffolds.
- Adaptável a diversos sistemas modelo, mas pode exigir otimização para alvos teciduais específicos.
- As limitações práticas incluem o controle preciso das proporções dos componentes e a eficiência da marcação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Fabrication of the Janus Base Nano-Matrix (JBNm), Composed of Janus Base Nanotube (JBNt)/Matn1/Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1)
1:41
Observation of Specimens with Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy
3:12
Absorption Spectra Measurement of Fluorescent-Labeled Proteins
5:08
Results: Layer-By-Layer Assembly of Janus Base Nano-Matrix Structure Scaffold for a Cartilage Tissue Construct
8:01
Conclusion
