Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC
18 de julho de 2022
O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.
Este protocolo permite uma visualização de estruturas tridimensionais em rim completo, o que pode levar a descobertas inovadoras na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica. A coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. Este protocolo demonstrou a coloração de alta qualidade e montagem completa dos rins pelos anticorpos.
Para começar, realizar a fixação da imersão imediatamente após a fixação da perfusão e amostragem renal, imergindo o rim em paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius por 16 horas. Dê três lavagens usando PBS por duas horas cada. Realizar o processo de descoloração e deslipidação imergindo o rim fixo em sete milímetros de 50%CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros, com agitação suave à temperatura ambiente.
Após seis horas, mergulhe o rim em sete mililitros de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 milímetros, com agitação suave a 37 graus Celsius por cinco dias. Atualize CUBIC-L todos os dias. Uma vez que a descoloração e a deslipidação estejam completas, use uma colher de dosagem para o manuseio da amostra e lave o rim três vezes com PBS à temperatura ambiente por duas horas.
Imunocorante do rim deslipidado em anticorpos primários diluídos em solução tampão de coloração, com agitação suave em um agitador de incubadora a 37 graus Celsius por sete dias. Em seguida, lave o rim com 0,5%Triton X-100 em PBS, também conhecido como PBST, à temperatura ambiente por um dia. Para a coloração de anticorpos secundários, trate o rim com anticorpos secundários no tampão de coloração, no escuro, com agitação suave a 37 graus Celsius por sete dias.
Fixe a coloração com uma lavagem PBST à temperatura ambiente durante um dia. Após a fixação, mergulhe o rim em formaldeído a 1% em PB por três horas e lave-o com PBS à temperatura ambiente por seis horas. Realizar a correspondência do índice de refração imergindo o rim em sete mililitros de 50%CUBIC-R+em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros com agitação por um dia, seguido de tratamento com sete mililitros de CUBIC-R+com agitação à temperatura ambiente por dois dias.
Com a ajuda do método de coloração imunológica, nervos e artérias simpáticas em um rim inteiro foram visualizados em imagens renais 3D. Além disso, nervos simpáticos renais anormais foram visualizados após lesão de isquemia-reperfusão. Este protocolo também facilitou a visualização dos nervos simpáticos em todo o baço.
O processo de quantificação dos dados para a coloração imunofluorescente tridimensional é apresentado aqui. Além disso, os ductos coletores, o segmento S1 dos túbulos proximais e os glomérulos foram visualizados com sucesso em todo um rim. A glomerulomegalia suprimida, resultante da administração de medicamentos nos estágios iniciais da doença renal diabética, também foi visualizada em imagens 3D.
Este protocolo pode rotular a molécula específica dentro de um rim inteiro. Assim, os pesquisadores podem analisar a alteração da estrutura na vasculatura ou encontrar eventos raros nos tecidos renais.
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Visão Geral
Este protocolo permite a visualização de estruturas tridimensionais em rim completo, fornecendo uma perspectiva macroscópica que pode levar a descobertas inovadoras na pesquisa renal. O método inclui clareamento de tecidos e coloração imunofluorescente em montagem inteira para melhorar a qualidade da imagem.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Patologia
Contexto
- A coloração de órgãos em montagem inteira é desafiadora devido às dificuldades de penetração do anticorpo.
- A coloração de alta qualidade é crucial para uma imagem tridimensional precisa.
- Este protocolo aborda problemas comuns na imagem renal.
- Perspectivas macroscópicas podem levar a novos entendimentos biológicos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a imagem tridimensional do rim.
- Aprimorar a visualização das estruturas renais.
- Facilitar descobertas inovadoras na patologia renal.
Métodos Utilizados
- Fixação por imersão em paraformaldeído 4% a 4 °C por 16 horas.
- Lavagem com PBS por duas horas cada, três vezes.
- Descoloração e deslipidação utilizando CUBIC-L 50%.
- Agitação suave à temperatura ambiente durante o processo de deslipidação.
Resultados Principais
- Realizou coloração de alta qualidade de rins em montagem inteira.
- Penetração aprimorada de anticorpos foi alcançada.
- Forneceu visualização clara em 3D das estruturas renais.
- Permitiu perspectivas macroscópicas para melhor compreensão da patologia renal.
Conclusões
- O protocolo aprimora com sucesso as técnicas de imagem renal.
- Ele abre caminhos para novas descobertas na pesquisa renal.
- Estudos futuros podem se basear neste método para obter mais insights.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coloração tridimensional de rins inteiros com CUBIC permite a visualização abrangente de microestruturas renais, superando as limitações da patologia convencional. Essa capacidade possibilita o mapeamento de alta resolução de vasos sanguíneos, túbulos, glomérulos e nervos simpáticos, fornecendo insights essenciais para a descoberta precoce e a redução de riscos mecanicistas na pesquisa de doenças renais. O método aumenta a confiança preditiva em pontos críticos de inflexão no avanço de portfólios pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação da arquitetura renal e das redes celulares com resolução em nível de única célula.
- Auxilia na desmistificação biológica ao visualizar alterações estruturais após lesão ou intervenção.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio do mapeamento abrangente dos nervos simpáticos e glomérulos.
- Aprimora a confiança preditiva para a priorização de alvos em doenças renais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas biológicos tridimensionais validados para fluxos de trabalho de imagem e quantificação posteriores.
- Padroniza a coloração de órgãos inteiros para obter resultados reprodutíveis e quantitativos entre estudos.
- Permite a ampliação da imagem de eventos raros e alterações estruturais no tecido renal.
- Apoia a avaliação confiável dos efeitos de compostos na microanatomia renal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados de imagens 3D com biomarcadores relevantes para doenças, como glomerulomegalia.
- Oferece continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, ao visualizar os efeitos de intervenções.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em análise abrangente de tecidos.
- Fornece desvio preditivo de riscos para programas de pesquisa renal translacional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de coloração 3D de rim inteiro integra-se ao continuum de descoberta até a fase pré-clínica, apoiando testes de hipóteses, validação de alvos e alinhamento de biomarcadores translacionais na pesquisa renal.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a elucidação de vias ao mapear estruturas renais e respostas a lesões.
- Triagem: Fornece saídas de imagem tridimensionais prontas para ensaios e reprodutíveis para comparação quantitativa de condições experimentais.
- Análises: Permite a medição e quantificação de alterações estruturais, apoiando análises estatísticas robustas.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados de imagem a modelos de doenças e à identificação precoce de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para imagem de órgãos inteiros em estudos renais e de tecidos relacionados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos renais.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho padronizados, escalonáveis e reprodutíveis de imagem 3D.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir análises teciduais abrangentes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas para doenças renais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em clareamento de tecidos, imunomarcação e análise de imagem 3D.
- Necessita de acesso a instrumentação avançada de imagem e ferramentas computacionais de análise.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode exigir adaptação para diferentes sistemas orgânicos ou painéis de anticorpos.
- A penetração de anticorpos e a duração da marcação são limitações práticas para a imagem de órgãos inteiros.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
