Name: Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: Aprenda a técnica de coloração tridimensional de rim inteiro usando CUBIC-L para visualização macroscópica de estruturas renais. Este método melhora a penetração de anticorpos e permite descobertas inovadoras em pesquisa renal.

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Parte deste trabalho foi realizado através da colaboração com o Prof. Hiroki R. Ueda (Universidade de Tóquio), Prof. Etsuo A. Susaki (Universidade de Juntendo), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Universidade de Tohoku), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada e Dr. Hirotaka Komaba (Universidade de Tokai).

Todos os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tóquio. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health. Camundongos machos C57BL/6NJcl, com 8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação animal e fixação renal
<ol><li>Realize a fixação de perfusão seguindo os passos abaixo.<ol><li>Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (3%, 2,0 L/min) e administração intraperitoneal de cloridrato de medetomidina (0,3 mg/kg), tartarato de butorfanol (5 mg/kg) e midazolam (4 mg/kg) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Perfundir o animal com 20 mL de PBS (pH 7,4) e 30 mL de PFA a 4% em tampão fosfato (PB) através do ventrículo esquerdo do coração12.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar a fixação da imersão logo após a fixação da perfusão e amostragem renal9.<ol><li>Imergir o rim em PFA a 4% a 4 °C por mais 16 h e, em seguida, lavá-lo com PBS por 2 h (três vezes)9 (Figura 1). CUIDADO: Formaldeído e paraformaldeído são irritantes tóxicos. Manuseie os reagentes em um exaustor com equipamento de proteção individual apropriado.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Descoloração e deslipidação
<ol><li>Preparar CUBIC-L para descoloração e deslipidação consistindo de 10% em peso de Triton X-100 e 10% em peso de N-butildietanolamina (ver Tabela de Materiais), seguindo relatórios publicados anteriormente 4,8,9.</li>
	<li>Realizar a descoloração e deslipidação por CUBIC-L seguindo os passos abaixo.<ol><li>Imergir o rim fixo em 7 mL de 50% (v/v) CUBIC-L (mistura 1:1 de água e CUBIC-L) em um tubo de fundo redondo de 14 mL (ver Tabela de Materiais) com agitação suave à temperatura ambiente por 6 h (Figura 2A). Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave a 37 °C por 5 dias.</li>
		<li>Atualize o CUBIC-L todos os dias durante este processo. Após o processo de descoloração e deslipidação, lavar o rim com PBS em temperatura ambiente por 2 h (três vezes)9 (Figura 1). Use uma colher dispensadora para o manuseio da amostra (Figura 2B).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Coloração imunofluorescente de montagem completa
<ol><li>Prepare os amortecedores de coloração.<ol><li>Preparar o tampão de coloração para anticorpos primários misturando 0,5% (v/v) de Triton X-100, 0,5% de caseína em PBS e 0,05% de azida de sódio9.</li>
		<li>Prepare o tampão de coloração para anticorpos secundários misturando 0,5% (v/v) de Triton X-100, 0,1% de caseína em PBS e 0,05% de azida de sódio9.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar coloração com anticorpos primários.<ol><li>Imunocorar o rim deslipidado com anticorpos primários (1:100 ou 1:200, ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave durante 7 dias. NOTA: A quantidade do tampão de coloração necessário para um rim é de 500-600 μL (Figura 2C).</li>
		<li>Lavar o rim com Triton X-100 a 0,5% (v/v) em PBS (PBST) à temperatura ambiente por 1 dia9 (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar coloração com anticorpos secundários.<ol><li>Imunocorar o rim com anticorpos secundários (1:100 ou 1:200, ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave durante 7 dias. Lavar o rim com PBST à temperatura ambiente por 1 dia9 (Figura 1).</li>
		<li>Após a fixação9, imergir o rim em formaldeído a 1% em PB (mistura 1:36 de formaldeído a 37% e PB) por 3 h, e lavá-lo com PBS à temperatura ambiente por 6 h (Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Correspondência do índice de refração (IR)
<ol><li>Prepare CUBIC-R+.<ol><li>Preparar CUBIC-R misturando 45 % em peso de 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona/antipirina e 30 % em peso de nicotinamida (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Preparar CUBIC-R+ para correspondência de índice de refração (IR) adicionando 0,5 v% de N-butildietanolamina ao CUBIC-R seguindo os relatórios publicados anteriormente 4,8,9.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute a correspondência do RI.<ol><li>Mergulhe o rim em 7 mL de 50% (v/v) CUBIC-R+ (mistura 1:1 de água e CUBIC-R+) em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave à temperatura ambiente por 1 dia. Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-R+ em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave à temperatura ambiente por 2 dias9 (Figura 1). NOTA: Embora o rim flutue em 50% de CUBIC-R+ no início da correspondência do IR, ele afunda e se torna transparente no CUBIC-R+ no final do processo (Figura 2D).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Aquisição e reconstrução de imagens
<ol><li>Imergir o rim compatível com IR em uma mistura de óleo de silício (IR = 1,555) e óleo mineral (IR = 1,467) (55:45) durante a aquisição da imagem (IR = 1,51)5 (Figura 3).</li>
	<li>Adquira imagens 3D de todo o rim com um microscópio fluorescente de9 folhas de luz personalizado (consulte Tabela de materiais). Colete todos os dados brutos da imagem em um formato TIFF de 16 bits. Visualize e capture as imagens renderizadas em 3D com o software de análise de imagem (Imaris, consulte Tabela de Materiais).</li>
</ol>

<ol><li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+three-dimensional+analysis+%28CUBIC-kidney%29+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O presente protocolo permitiu a imagem 3D de todo o rim de várias estruturas, como nervos simpáticos, ductos coletores, artérias, túbulos proximais e glomérulos 9,10,11. Esse método de coloração ofereceu observação macroscópica e levou a novas descobertas biológicas, visualizando a alteração dos nervos simpáticos renais após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicia...

O rim é composto por várias populações celulares. Embora a patologia convencional nos dê muita informação sobre o microambiente renal, a imagem tridimensional (3D) é necessária para entender com precisão o crosstalk intercelular durante a progressão da doença renal. No passado, um grande número de cortes seriados e reconstrução de imagens precisava ser realizado para a imagem 3D de todo o órgão1. No entanto, este método exigiu muito esforço e teve problemas em termos de reprodutibilidade.
A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse obstáculo 2,3. A opacidade tecidual é principalmente devido à dispersão e absorção de luz, porque cada órgão consiste em várias substâncias, incluindo água, proteínas e lipídios. Assim, a estratégia básica de clareamento tecidual é a substituição de água e lipídios nos tecidos por reagentes correspondentes ao índice de refração (IR) que possuem as mesmas propriedades ópticas que as proteínas4. Para observar um espécime transparente, uma microscopia fluorescente de folha de luz é útil5. As folhas de luz iluminam a amostra transparente de lado, e os sinais de excitação são adquiridos através da lente objetiva localizada em uma posição vertical6. Esta microscopia obtém informações de seção transversal em uma única varredura, que é diferente da microscopia fluorescente confocal ou multifóton. Assim, ele pode adquirir rapidamente imagens z-stack com um baixo nível de fotobranqueamento.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) é um dos métodos de clareamento tecidual que permite a imagem de órgãos inteiros por microscopia fluorescente de folha de luz 2,7,8. A coloração CUBIC e imunofluorescente de montagem completa são otimizadas no presente estudo para visualizar estruturas 3D renais de camundongos 9,10,11. Utilizando esse método de coloração de montagem completa, a alteração nos nervos simpáticos renais é visualizada após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética 11, bem como vasos sanguíneos, túbulos proximais e ductos coletores em um rim inteiro9.

<table><tbody><tr><td>14 mL Tubo de ensaio PP de alta clareza</td> de fundo redondo <td>Falcon</td><td>352059</td><td>Limpeza de tecidos, coloração, lavagem</td></tr><tr><td>2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona / antipirina</td> Tokyo <td>Chemical Industry</td><td>D1876</td><td>CUBIC-R +</td></tr> <tr><td>37%-Formaldeído Solução</td><td>Nacalai Tesque</td><td>16223-55</td><td>Pós-fixação</td></tr><tr><td>4%-Paraformaldeído Solução Tampão de Fosfato</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09154-85</td><td>Fixação renal</td></tr><tr><td>Alexa Flour 555 anticorpo IgG anti-ovelha conjugado para burro</td><td>Invitrogen</td><td>A-21436</td><td>Anticorpo secundário (1:100)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 647 anticorpo IgG anti-coelho conjugado para burro</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>Anticorpo secundário (1:200)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-aquaporina 2 (AQP2)</td><td>Abcam</td><td>ab199975</td><td>Anticorpo primário (1:100)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-podocina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372</td><td>Anticorpo primário (1:100)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-cotransportador de glicose sódica 2 (SGLT2)</td><td>Abcam</td><td>ab85626</td><td>Anticorpo primário (1:100)</td></tr><tr><td>Anticorpo antitirosina hidroxilase (TH)</td><td>Abcam</td><td>ab113</td><td>Anticorpo primário (1:100)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-&alfa;-actina de músculo liso (&alpha;-SMA)</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>Anticorpo primário (1:200)</td></tr><tr><td>Bloqueador de caseína em PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37528</td><td>Tampão de coloração</td></tr><tr><td>Butorfanol Tartarato</td><td>Meiji</td><td>005526</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>C57BL/6NJcl</td><td>Nippon Bio-Supp.Center</td><td>N/A</td><td>Cepa de camundongo</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Software de análise de imagem</td></tr><tr><td>Microscópio de macro-zoom</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td>A unidade de observação do microscópio feito sob medida</td></tr><tr><td>Cloridrato de medetomidina</td><td>Kyoritsu-Seiyaku</td><td>008656</td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>SANDOZ</td><td>27803229</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Óleo de imersão</td></tr><tr><td>N-butiledietanolamina</td><td>Tokyo Indústria Química</td><td>B0725</td><td>CUBIC-L, CUBIC-R +</td></tr> <tr><td>Nicotinamida</td><td>Tokyo Indústria química</td><td>N0078</td><td>CUBIC-R +</td></tr> <tr><td>Polietilenoglicol mono-p-isooctilfenil éter / Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-45</td><td>CUBIC-L, PBST</td></tr><tr><td>Óleo de silício HIVAC-F4</td><td>Shin-Etsu Óleo químico</td><td>50449832</td><td>imersão</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Wako</td><td>195-11092</td><td>Tampão de coloração</td></tr></tbody></table>

coloração tridimensional de rim inteiro com cubic

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Embora a patologia convencional fornecesse inúmeras informações sobre a microestrutura renal, era difícil saber a estrutura precisa dos vasos sanguíneos, túbulos proximais, ductos coletores, glomérulos e nervos simpáticos no rim devido à falta de informações tridimensionais (3D). A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse grande obstáculo. Múltiplas células em um órgão inteiro podem ser analisadas em resolução de célula única, combinando limpeza de tecido e técnica de imagem 3D. No entanto, os métodos de marcação celular para imagens de órgãos inteiros permanecem subdesenvolvidos. Em particular, a coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. O presente protocolo desenvolveu uma coloração renal de camundongo de montagem completa para imagens 3D com o método de clareamento tecidual CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). O protocolo possibilitou visualizar a denervação simpática renal após lesão de isquemia-reperfusão e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética de um ponto de vista abrangente. Assim, esta técnica pode levar a novas descobertas na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica.

Utilizando esse método de coloração, foram visualizados nervos simpáticos [anticorpo antitirosina hidroxilase (TH)] e artérias [anticorpo anti-actina do músculo liso (αSMA) anti-α] em um rim inteiro (Figura 4A,B e Vídeo 1)9. Nervos simpáticos renais anormais também foram visualizados após lesão de isquemia/reperfusão (IRA)9,10 (Figura 4C). Além di...

O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.

Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

Este protocolo permite uma visualização de estruturas tridimensionais em rim completo, o que pode levar a descobertas inovadoras na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica. A coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. Este protocolo demonstrou a coloração de alta qualidade e montagem completa dos rins pelos anticorpos.Para começar, realizar a fixação da imersão imediatamente após a fixação da perfusão e amostragem renal, imergindo o rim em paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius por 16 horas. Dê três lavagens usando PBS por duas horas cada. Realizar o processo de descoloração e deslipidação imergindo o rim fixo em sete milímetros de 50%CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros, com agitação suave à temperatura ambiente.Após seis horas, mergulhe o rim em sete mililitros de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 milímetros, com agitação suave a 37 graus Celsius por cinco dias. Atualize CUBIC-L todos os dias. Uma vez que a descoloração e a deslipidação estejam completas, use uma colher de dosagem para o manuseio da amostra e lave o rim três vezes com PBS à temperatura ambiente por duas horas.Imunocorante do rim deslipidado em anticorpos primários diluídos em solução tampão de coloração, com agitação suave em um agitador de incubadora a 37 graus Celsius por sete dias. Em seguida, lave o rim com 0,5%Triton X-100 em PBS, também conhecido como PBST, à temperatura ambiente por um dia. Para a coloração de anticorpos secundários, trate o rim com anticorpos secundários no tampão de coloração, no escuro, com agitação suave a 37 graus Celsius por sete dias.Fixe a coloração com uma lavagem PBST à temperatura ambiente durante um dia. Após a fixação, mergulhe o rim em formaldeído a 1% em PB por três horas e lave-o com PBS à temperatura ambiente por seis horas. Realizar a correspondência do índice de refração imergindo o rim em sete mililitros de 50%CUBIC-R+em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros com agitação por um dia, seguido de tratamento com sete mililitros de CUBIC-R+com agitação à temperatura ambiente por dois dias.Com a ajuda do método de coloração imunológica, nervos e artérias simpáticas em um rim inteiro foram visualizados em imagens renais 3D. Além disso, nervos simpáticos renais anormais foram visualizados após lesão de isquemia-reperfusão. Este protocolo também facilitou a visualização dos nervos simpáticos em todo o baço.O processo de quantificação dos dados para a coloração imunofluorescente tridimensional é apresentado aqui. Além disso, os ductos coletores, o segmento S1 dos túbulos proximais e os glomérulos foram visualizados com sucesso em todo um rim. A glomerulomegalia suprimida, resultante da administração de medicamentos nos estágios iniciais da doença renal diabética, também foi visualizada em imagens 3D.Este protocolo pode rotular a molécula específica dentro de um rim inteiro. Assim, os pesquisadores podem analisar a alteração da estrutura na vasculatura ou encontrar eventos raros nos tecidos renais.

whole-kidney-three-dimensional-staining-with-cubic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra um ensaio para a coloração de toda a montagem de rins murinos usando um método de limpeza de tecido chamado CUBIC (coquetéis de imagem cérebro/corpo claros e desobstruídos e análise computacional) e coloração imunofluorescente. O rim é submetido à limpeza do tecido, em que o rim é deslipidado, descolorido e tratado com uma solução correspondente ao índice de refração para tornar o tecido transparente para uma imagem tridimensional ideal. O tecido é corado com anticorpos...

Uma técnica de coloração de órgãos de montagem total para imagens tridimensionais do rim

Engenharia de tecido renais construções oferecem uma solução para a escassez de órgãos e os efeitos deletérios da diálise. Aqui, descrevemos um protocolo para micro dissecar murino rins para isolamento dos segmentos córtico-medular. Esses segmentos são implantados livre de andaime celular construções, formando organoids renal.

Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Um protocolo para visualização 3D de estruturas microscópicas do tecido usando um método específico da coloração do raio X projetado para a tomografia computada do raio X é apresentado.

Imagem 3D de amostras de tecido sofx usando um método de coloração específica de raios-X e tomografia computadorizada nanoscópica

Este trabalho descreve dois métodos para estudar o desenvolvimento de órgãos, uma melhor configuração de xenotransplante na membrana corioallantoica (CAM) a partir de embriões aviários que permite a vascularização de órgãos e organóides embrionários cultivados e uma nova direção fixa z método de cultura de órgãos com condições experimentais modificadas que permite imagens confocais de lapso de tempo de alta resolução.

Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada

Aqui, fornecemos protocolos detalhados, robustos e complementares para realizar imagens de coloração e resolução subcelular de modelos de cultura celular tridimensional fixa que variam de 100 μm a vários milímetros, permitindo assim a visualização de sua morfologia, composição do tipo celular e interações.

Coloração e Imagem de Alta Resolução de Modelos Organoides e Esferoides Tridimensionais

Este método demonstra um fluxo de trabalho de impressão 3D baseado em voxel, que imprime diretamente de imagens médicas com fidelidade espacial exata e resolução espacial/contraste. Isso permite o controle preciso e graduado das distribuições de materiais através de materiais morfologicamente complexos e graduados correlacionados à radiodensidade sem perda ou alteração de dados.

Anatomia de Impressão Voxel: Design e Fabricação de Modelos realistas de planejamento pré-cirúrgico através da impressão bitmap

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando microscopia de 2 fótons em ratos Wistar Fromter de Munique com glomérulos superficiais para quantificar os efeitos da obstrução ureteral prolongada na dinâmica e função glomerular.

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.

Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos

Aqui, apresentamos protocolos que detalham instruções para a implementação de culturas de células 3D usando matrizes de colágeno e colágeno-agarose em um sistema microfisiológico. Esses protocolos suportam a co-cultura de esferoides de túbulo proximal renal e carcinoma de células renais, simulando condições in vivo e permitindo a investigação avançada das interações das células cancerígenas renais.

Co-cultura microfluídica de epitélio renal saudável e tumoral para modelar a progressão do câncer renal

Este artigo descreve um protocolo de imunofluorescência multiplex otimizado para caracterizar a arquitetura tridimensional de metástases peritoneais.

Imagens tridimensionais de tecido portador de tumor usando o clareamento iterativo estende a abordagem de multiplexidade

Aprenda a técnica de coloração tridimensional de rim inteiro usando CUBIC-L para visualização macroscópica de estruturas renais. Este método melhora a penetração de anticorpos e permite descobertas inovadoras em pesquisa renal.

Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC

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