Name: Facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a cultivar organoides cerebrais usando iluminação lateral suave para melhorar a visibilidade e facilitar as operações de troca de meio e transferência. Este protocolo simplifica a cultura de organoides para pesquisa em neurociência.

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Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong (Grant No. 2020A0505100062), o Projeto de Temas-Chave de Ciência e Tecnologia da Cidade de Guangzhou (Grant No. 201904020025), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 31872800, 32070582, 82101937) e o projeto Guangzhou City Postdoctor Research Grant (para Bangzhu Chen).

O protocolo foi conduzido após a Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou (Revisão Médica e Ética [2021] Nº 022). Antes do experimento, cada meio foi preparado de acordo com a fórmula12 de Juergen A. Knoblich (Tabelas Suplementares 1-4), ou um Kit Organoide Cerebral comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Os iPSCs utilizados neste estudo foram previamente estabelecidos pelo nosso laboratório e obtiveram isenção informada. Os SCA3-iPSCs foram gerados a partir de uma ataxia spinocerebellar fêmea de 31 anos de idade genótipo 3 (SCA3) genótipado como abrigando 26/78 CAG repetições no gene ATXN313 (Figura Suplementar 1A). Os iPSCs humanos normais mencionados em artigo anterior foram selecionados como NC-iPSCs14, e o gene ATXN3 foi identificado como tendo repetições de CAG 14/14 (Figura Suplementar 1B).
1. Preparação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)
<ol><li>Coletar 3 mL de sangue periférico por venipuntura com o consentimento informado de voluntários e pacientes.</li>
	<li>Isole as células mononucleares periféricas de acordo com o método Ficoll-Paque15.</li>
	<li>Estabelecer iPSCs de acordo com o protocolo do Kit de Reprogramação Sendai (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>Cultura os iPSCs com mTeSR1 médio em placas de Petri de 35 mm cobertas com Matrigel (uma matriz de membrana de porão, ver Tabela de Materiais). Mude o meio todos os dias. A densidade de crescimento do IPSC não deve exceder 75%.</li>
		<li>Digerir as células com solução de dissociação de PSC (ver Tabela de Materiais) e subcultura-las a uma razão de 1:5 a cada 3-5 dias. ATENÇÃO: O vírus Sendai é usado aqui. Deve ser operado no gabinete de biossegurança, e medidas de autoproteção devem ser tomadas. Deve ficar claro se pode ser usado legalmente no país local. As leis e regulamentos locais de biossegurança devem ser rigorosamente seguidos quando utilizados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação do EB (dias 0-1)
<ol><li>Retire o meio mTeSR1 dos iPSCs com uma pipeta e lave-o 2x com 1 mL de 1x PBS.</li>
	<li>Remova o PBS com uma pipeta e adicione 300 μL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) para digerir os iPSCs em células únicas por 3-4 min a 37 °C.</li>
	<li>Resuspenda as células em 2 mL de meio de formação de EB (Tabela Suplementar 1) e, em seguida, centrifugar a amostra por 5 min a 300 x g (temperatura ambiente).</li>
	<li>Pré-tre a placa especializada de 24 poços com solução anti-adesão enxaguante (500 μL/well) por 5 min (ver Tabela de Materiais). NOTA: A solução de lavagem anti-adesão é essencial para a formação ideal de EB e esferoide.</li>
	<li>Resuspentive as células em meio de formação de EB contendo Y-27632 (concentração final, 10 μM, ver Tabela de Materiais), com densidade celular de 1,5 x 106 células/mL.</li>
	<li>Remova a solução anti-adesão e enxágue cada poço com 2 mL de meio de formação de EB.</li>
	<li>Adicione as células às placas especializadas de 24 poços a uma densidade de 3 x 106 células/bem (Figura 1A, à esquerda). NOTA: Normalmente, 300 EBs podem ser preparados em cada poço. Este método pode preparar grandes quantidades de EBs do mesmo tamanho.</li>
	<li>Centrifugar a placa a 100 x g por 2 min a temperatura ambiente. Distribua uniformemente as células em cada câmara na parte inferior da placa (Figura 1A, à direita). NOTA: Se não houver centrífuga adequada, a placa também pode ser diretamente colocada na incubadora para cultura estática, mas o tempo de formação da bola EB será várias horas mais tarde do que o sob centrifugação normal.</li>
	<li>Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h. Se a centrifugação não foi utilizada na etapa anterior, incubar por 36 h. Mantenha a amostra estável e não a tire da incubadora durante esse período.</li>
</ol>3. Preparação da lâmpada de luz macia (dia 1)
<ol><li>Use uma placa de acrílico transparente com uma espessura de 0,3-0,5 cm no tamanho do papel A5. Cole almofadas brancas na frente e atrás da placa acrílica.<ol>
<li>Instale uma fileira de luzes brancas led na borda da placa para que as luzes possam entrar pelo lado da placa acrílica e, em seguida, disparar em paralelo (Figura Suplementar 2A-F, Figura 1B). NOTA: Como os diâmetros dos EBs no estágio inicial são de aproximadamente 200 μm a 300 μm, é difícil observá-los claramente a olho nu sob a lâmpada fluorescente de bancos limpos. Em contraste, devido ao aprimoramento da reflexão difusa, podemos detectar claramente os EBs usando luz suave iluminada lateralmente (Figura 1B, C). Uma placa de 6 poços é recomendada para culturas EB em experimentos subsequentes. No entanto, para mostrar melhor o efeito visual da luz suave, os pratos às vezes são usados para tirar fotos e vídeos neste estudo em vez de pratos, por isso, por favor, não entenda mal. A lâmpada de luz macia iluminada lateralmente também pode ser usada para a placa de 6 poços.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Transferência de EB e substituição média (dias 2-5)
<ol><li>Prepare uma nova placa de adesão de 6 poços e adicione 2 mL de meio de formação EB a cada poço.</li>
	<li>Remova os EBs junto com o meio com uma ponta de pipeta de 1000 μL (ver Tabela de Materiais) e transfira-os para a placa de adesão de 6 poços (~100 EBs/well). NOTA: O processo de operação adota uma lâmpada de luz macia (mencionada na etapa 3.) para tornar os EBs mais fáceis de observar. Desligue outras fontes de luz interior para obter melhor o efeito visual da luz suave.</li>
	<li>Substitua pelo mesmo volume de meio de formação de EB fresco todos os dias. Use o fluxo secundário para reunir os EBs para o centro e alterar o meio.<ol>
<li>Aspire o velho meio por pipetar até a borda do poço lentamente. Não chupe muito forte; caso contrário, os EBs serão removidos juntos. Em seguida, adicione meio fresco para resuspensar os EBs. NOTA: O fluxo secundário de princípio (Figura 1D). Induzir um fluxo de redemoinho girando o prato ao longo de uma órbita circular. Devido ao fluxo de redemoinho, um fluxo secundário é induzido direcionado para o centro. Os EBs ou organoides convergem para o centro do poço devido ao fluxo secundário gerado através da rotação, após o qual a mudança média ou a transferência embrionária podem ser executadas prontamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Verificar a pluripotência rotulando com marcador de pluripotência OCT4 (dia 4)
NOTA: Quando o diâmetro dos EBs for superior a 300 μm, leve vários EBs para coloração de imunofluorescência marcador OCT4 para detectar sua pluripotência.
<ol><li>Fixar os EBs em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 30 min, seguido de lavagem em 1x PBS 3x por 10 min cada vez.</li>
	<li>Transfira os EBs para PBS de temperatura ambiente contendo 0,3% Triton X-100 e 3% BSA por 2 h, seguido de lavagem em PBS 3x por 10 min cada vez. NOTA: Após serem tratados com o TR X-100, os EBs flutuam na superfície líquida e podem ser facilmente sugados com o líquido durante a limpeza. Recomenda-se a operação sob um estereótipo.</li>
	<li>Diluir o anticorpo primário OCT4 (ver Tabela de Materiais) com 1 mL de 1x PBS contendo 1% de BSA a uma proporção de 1:200 e adicionar aos EBs para incubação a 4 °C durante a noite, em seguida, lavar em PBS 3x por 10 minutos cada vez.</li>
	<li>Diluir o respectivo anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais) com 1x PBS às 1:500 e adicionar 1 mL aos EBs.</li>
	<li>Depois de incubar à temperatura ambiente por 2h, lave as células em 1x PBS 3x por 10 minutos cada vez.</li>
	<li>Retire o PBS, adicione 2 mL de solução PBS 1x contendo 1 μg/mL DAPI, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos e depois lavar em PBS 3x por 10 minutos cada vez.</li>
	<li>Mova o EB contendo uma pequena quantidade de líquido no slide, sele o slide com um vidro de cobertura revestido com geleia de petróleo comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) na borda e, em seguida, observe e colete a imagem sob o microscópio confocal de fluorescência. NOTA: A expressão OCT4 representa a pluripotência EB12. Quando a expressão de OCT4 for inferior a 90%, os EBs devem ser descartados, e os EBs devem ser preparados novamente.</li>
</ol>6. Indução neural (dias 5-7)
<ol><li>Prepare uma nova placa de 6 poços com baixa adesão e adicione 3 mL de meio de indução neural (Tabela Suplementar 2) a cada poço.</li>
	<li>Ligue a luz suave lateral (mencionada na etapa 3.) e desligue outras fontes de luz interior.</li>
	<li>Transfira os EBs para a placa de 6 poços com meio de indução neural adicionado (~100 EBs/bem). Adicione o mínimo possível do meio original ao novo poço. NOTA: Introduza habilidades simples de transferência oforganoid. Naturalmente, sob gravidade e com uma densidade relativamente maior do que o médio, os EBs resuspended afundarão gradualmente aplicando a operação mostrada na Figura 1E. Assim, os EBs podem ser convenientemente transferidos. Uma vez que, em comparação com os EBs, células livres e fragmentos de células mortas afundam mais lentamente, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem, assim, ser removidos através deste método de sedimentação (Figura 1F).</li>
	<li>Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h. NOTA: Sob o microscópio, o diâmetro dos EBs era de aproximadamente 500 μm, e a borda era translúcida, indicando que uma camada neuroepitelial se formou.</li>
	<li>Prossiga para o próximo passo.</li>
</ol>7. Incorporação na matriz de membrana do porão (dias 7-10)
<ol><li>Coloque a matriz de membrana em uma geladeira de 4 °C com 60 minutos de antecedência para dissolver. Calcule a quantidade da matriz necessária com antecedência. Aproximadamente 100 EBs foram incorporados em 1,5 mL da matriz de membrana.</li>
	<li>Ligue a luz lateral e desligue a fonte de luz na parte superior do console.</li>
	<li>Mantenha a matriz de membrana no gelo para evitar a solidificação.</li>
	<li>Transfira uma pequena quantidade de EBs para um prato de 60 mm contendo meio de expansão fresco (Tabela Suplementar 3) cada vez. Reduza o número de EBs para facilitar a remoção de um único EB.</li>
	<li>Em seguida, use uma nova placa de adesão de 6 poços baixos. Chupe um único EB (contendo aproximadamente 10 μL médio) com uma ponta de pipeta de 200 μL (ver Tabela de Materiais) cada vez, e depois adicione-o ao fundo da placa de 6 poços para fazer gotículas. Use cinco gotículas por poço. NOTA: A chave é ajustar o alcance da arma pipeta para 50 μL e chupar um EB e, em seguida, referir-se ao funcionamento da Figura 1E. Quando o EB se acomoda ao furo da ponta da pipeta, a ponta toca rapidamente o fundo da placa e empurra aproximadamente 10 μL de líquido para formar uma gota.</li>
	<li>Adicione 15 μL da matriz de membrana a cada gota contendo EB e misture-a rapidamente. Incorpore a bola EB no centro da gota. NOTA: Os EBs não devem ser aspirados com uma ponta de pipeta padrão, que danifica o EB. A ponta de pipeta de 200 μL precisa ser usada em seu lugar.</li>
	<li>Coloque a placa de 6 poços em uma incubadora de 37 °C por 30 minutos e solidifique as gotículas da matriz de membrana que contêm EBs.</li>
	<li>Adicione 3 mL do meio de expansão a cada poço e exploda suavemente os EBs incorporados pela matriz para suspendê-los.</li>
	<li>Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias. NOTA: Se a brotação na superfície da EB for observada, significa que um neuroepithelium expandido foi formado16.</li>
</ol>8. Maturação organoide (dias 10-40)
<ol><li>Retire suavemente o meio original e adicione 3 mL de meio de maturação (Tabela Suplementar 4) a cada poço.</li>
	<li>Coloque a placa organoide em um agitador horizontal em uma incubadora de 37 °C.</li>
	<li>Continue a girar a cultura horizontalmente. Coloque o agitador na velocidade apropriada. NOTA: Ao esculpir organoides cerebrais em uma placa de 6 poços, uma força centrífuga relativa (RCF) de 0,11808 x g é mais apropriada, de acordo com o fabricante do agitador horizontal (ver Tabela de Materiais). De acordo com a conversão entre a força centrífuga relativa e a velocidade rotativa17,18, RCF = 1,118 x 10-5 × R × rpm2, onde RCF = força centrífuga relativa (g), rpm = revoluções por minuto (r/min) e R = raio de rotação (cm), também conhecido como arremesso de tremor. Os parâmetros de arremesso de diferentes shakers podem ser diferentes. Portanto, pode-se estimar que a velocidade rotativa seja rpm = 299 x (RCF/R)1/2.</li>
	<li>Mude o meio de maturação fresco a cada 2-3 dias.</li>
	<li>Após 20-30 dias, gradualmente cultura os organoides cerebrais até a maturidade. NOTA: Durante esse período, os organoides podem ser usados para experimentos e detecção, como detecção de marcadores neurais e sequenciamento de transcriptome 19,20,21.</li>
</ol>9. Seções congeladas e imunofluorescência de organoides cerebrais
<ol><li>Fixar os organoides em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 16 h e depois lavá-los 3x com 1x PBS por 10 min cada vez.</li>
	<li>Remova o PBS e mergulhe os organoides em 30% de sacarose a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Incorpore os organoides em 10%/7,5% de gelatina/sacarose a 37 °C por 1h e, em seguida, transfira rapidamente para o molde de incorporação.</li>
	<li>Adicione gelo seco a 100% etanol para preparar um chorume seco de gelo/etanol, e coloque as amostras organoides nele para congelamento rápido.</li>
	<li>Armazene as amostras congeladas em um congelador de −80 °C. Quando necessário, faça seções congeladas com uma espessura de 20 μm.</li>
	<li>Consulte as etapas 5.3.-5.5. para imunofluorescência. Use o anticorpo PAX6 para rotular células progenitoras apical, o anticorpo TUJ1 (ver Tabela de Materiais) para rotular células neuronais 22,23,24 e DAPI para coloração de DNA nuclear.</li>
</ol>

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<li>Yoon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+human+cortical+organoid+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reliability of human cortical organoid generation.</a> Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).</li>
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<li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Organoides cerebrais abrem novos caminhos para a pesquisa médica. Muitas aplicações úteis desta tecnologia estão apenas começando a ser exploradas28. Esta pesquisa constatou que os resultados de sequenciamento de transcritos de organoides cerebrais geneticamente doentes e organoides cerebrais normais podem refletir as diferenças entre doença e saúde. Por exemplo, os resultados da análise de dados do RNA-seq (Figura 3B) são consistentes com muitos estudos relatados sob...

Em comparação com sistemas de cultura bidimensionais (2D), sistemas de cultura tridimensionais (3D) têm várias vantagens, incluindo replicação genuína e reprodução eficiente de estruturas complexas de determinados órgãos1. Portanto, organoides cerebrais são um dos importantes métodos auxiliares para os campos de pesquisa do desenvolvimento cerebral humano e da doença2, rastreamento de drogas e terapia celular.
A colheita de organoides cerebrais pelo método de suspensão rotativa é propícia ao seu desenvolvimento e maturação3. Embora os sistemas de cultura organoide cerebral tenham alcançado grande sucesso, eles ainda enfrentam desafios críticos que limitam sua aplicação. Por exemplo, o cultivo manual envolve etapas complicadas de manipulação e introduz obstáculos para alcançar aplicações em larga escala. Além disso, em cada estágio de desenvolvimento na cultura dos organoides cerebrais, são necessárias mudanças em diferentes mídias e citocinas4. No entanto, no estágio inicial, os organoides ou EBs têm tamanhos minúsculos (aproximadamente 200 μm a 300 μm) e são quase visualmente inacessíveis sem aparelhos apropriados. Inevitavelmente, uma certa quantidade de amostras organoides preciosas são lavadas quando o meio é alterado. Muitas técnicas têm sido exploradas para superar isso em outros tipos de culturas organoides, e alguns exemplos incluem a imersão de chips organoides inteiros em um meio de cultura por 3 dias sem intervenção5; adicionando um meio fresco através do deslizamento de tampas depois que o meio antigo é absorvido usando papel absorvente5; ou aplicar dutos microfluidos complexos para troca de fluidos 6,7,8. Outro obstáculo encontrado no estágio inicial do cultivo organoide é a dificuldade de alcançar observações diretas a olho nu, o que pode causar más operações que levam a danos organoides e perda durante as etapas de transferência organoide. Portanto, é necessário estabelecer um protocolo mais viável que facilite a mudança média e a transferência organoide para gerar organoides.
Propõe-se uma operação otimizada correspondente com base nos princípios da engenharia para superar esses problemas, o que facilita significativa e convenientemente muitos procedimentos organoides. Na natureza, quando o sol brilha em uma casa através de uma abertura de janela, o olho nu pode ver a poeira dançando no feixe de luz. Devido ao reflexo difuso da luz solar sobre a poeira, alguma luz é refratada no globo ocular para produzir uma imagem visual. Inspirado no princípio desse fenômeno 9,10, este estudo fez uma lâmpada de luz macia e iluminou os EBs lateralmente. Verificou-se que os EBs poderiam ser visualmente claros sem afetar o escopo de visualização. Um fluxo secundário apontando para o centro é gerado no líquido girando a placa de cultura devido às correntes de eddy11. EBs originalmente dispersos se acumulam no centro da placa. Com base nisso, e no fenômeno de que a velocidade de sedimentação dos organoides é mais rápida que a das células, propõe-se um método de operação fácil de mudança média e transferência organoide sem centrifugação. Os organoides no meio da cultura podem ser efetivamente separados de células livres e fragmentos de células mortas através desta operação de transferência.
Aqui, um protocolo de fácil funcionamento é proposto para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes humanas. A tecnologia de operação foi otimizada aplicando o princípio da engenharia, tornando as operações na cultura 3D tão simples e viáveis quanto as da cultura 2D. O método de troca de líquidos melhorado e a operação de transferência organoide também são úteis para outros tipos de cultura organoide e o projeto de máquinas de cultura automática.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Filtro</td><td>NEST Biotechnology, China</td><td>331001</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; Ponteira de pipeta de diâmetro largo L</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>9405163</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; Ponta de pipeta de calibre largo L</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>9405020</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Merck, Alemanha</td><td>8057400005</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído</td><td>Servicebio, China</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>Placa de baixa adesão de 6 poços</td><td>NEST Biotechnology, China</td><td>703011</td><td>É usado para culturas de suspensão de EBs</td></tr><tr><td>Solução de desprendimento celular</td><td>STEMCELL Technologies, Canadá</td><td>07920</td><td>É usado para digerir iPSC em células únicas.</td></tr><tr><td>AggreWell800 STEMCELL Technologies de 24 poços</td><td>, Canadá</td><td>34811</td><td>Placa de cultura microporosa para preparação de EBs.</td></tr><tr><td>Solução de enxágue antiaderente</td><td>STEMCELL Technologies, Canadá</td><td>07010</td><td>Solução de enxágue para cultura para evitar a adesão celular</td></tr><tr><td>B27-vit. Um suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech, EUA</td><td>GMP100-18B</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime Biotechnology, China</td><td>ST025</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td>5810 R</td><td>Pode ser usado para centrifugação de vários tipos de tubos de centrífuga, frascos de reagentes e placas de trabalho.</td></tr><tr><td>Equipamento de laboratório Shitai</td> <td>de vidro de cobertura</td>, China <td>10212020C</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology, China</td><td>C1002</td><td>Usado para coloração nuclear. Depois que o DAPI foi combinado com DNA de fita dupla, o comprimento de onda máximo de excitação foi de 364 nm e o comprimento de onda máximo de emissão foi de 454 nm.</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>ES-quality FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque</td><td>General Electric Company, EUA</td><td>17-5442-02</td><td>Isole as células mononucleares do sangue periférico de acordo com o método Ficoll-Paque.</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sangon Bioteach, China</td><td>A609764</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Frango IgY&nbsp; anticorpo secundário</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab150171</td><td>Cabra anti-Frango IgG. Conjugação: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use na diluição de 1:500.</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário IgG anti-rato de cabra</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab150120</td><td>IgG anti-rato de cabra. Conjugação: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use na diluição de 1:500.</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho IgG de cabra</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab150077</td><td>IgG anti-coelho de cabra. Conjugação: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use na diluição de 1:500.</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Merck, Alemanha</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Agitador horizontal</td><td>Servicebio, China</td><td>DS-H200</td><td>A força centrífuga relativa (RCF) de 0,11808 x g é mais adequada, de acordo com o fabricante INFORS HT (Suíça).</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Merck, Alemanha</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, EUA</td><td>354277</td><td>Matrigel solidificará no ambiente superior a 4 &deg; C, por isso deve ser subembalado em baixa temperatura.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies, Canadá</td><td>85850</td><td>suplemento de N2 do meio de cultura iPSC</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo primário OCT4</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab19857</td><td>Anfitrião: Coelho. Dissolva com 500 &mu; L PBS. Use na diluição de 1:200.</td></tr><tr><td>Fatiador patológico congelado</td><td>Leica, Alemanha</td><td>Anticorpo primário Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>PAX6</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab78545</td><td>Hospedeiro: Mouse. Use na diluição de 1:100.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>STEMCELL Technologies, Canadá</td><td>37350</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>15140122</td> Solução de <td></td></tr><tr><td>dissociação PSC</td><td>Beijing Saibei Biotechnology, China</td><td>CA3001500</td><td>A solução de dissociação sem enzimas pode ser usada para digestão e passagem de iPSC.</td></tr><tr><td>Kit de Reprogramação Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>A16518</td><td>Estabeleça o iPSC de acordo com o protocolo do Kit de Reprogramação Sendai.</td></tr><tr><td>Equipamento de laboratório de Shitai de vidro deslizante</td><td>, China</td><td>188105W</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de luz suave</td><td>NUT</td><td>NUT</td><td>Um dispositivo simples feito por si mesmo, consulte a figura suplementar 2 para preparação.</td></tr><tr><td>Kit de Organoides Cerebrais STEMdiff STEMCELL</td><td>Technologies, Canadá</td><td>8570</td><td>Contém: 1. Meio de Formação EB; 2. Meio de Indução; 3. Meio de expansão; 4. Meio de maturação.</td></tr><tr><td>Kit de Maturação Organoide Cerebral STEMdiff</td><td>STEMCELL Technologies, Canadá</td><td>8571</td><td>Meio de Maturação</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sangon Bioteach, China</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck, Alemanha</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1 anticorpo primário</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab41489</td><td>Anfitrião: Frango. Use na diluição de 1:1000.</td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Sangon Bioteach, China</td><td>A510146</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies, Canadá</td><td>72302</td><td>Prepare uma solução estoque de 5 mM em PBS, ressuspenda 1 mg em 624 &micro; L da PBS.</td></tr><tr><td>Weblink</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dados brutos de sequenciamento Arquivo de</td><td>sequência do genoma (genômica, proteômica e Bioinformática 2021) no Centro Nacional de Dados de Genômica (Ácidos Nucleicos Res 2022), Centro Nacional de Bioinformação da China / Instituto de Genômica de Pequim, Academia Chinesa de Ciências</td><td>GSA-Human: HRA002430</td><td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td></tr></tbody></table>

facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Atualmente, a tecnologia de cultura organoide cerebral ainda é complicada de operar e difícil de aplicar em larga escala. É necessário encontrar uma solução simples e prática. Portanto, um protocolo organoide cerebral mais viável é proposto no presente estudo. Para resolver o inevitável inconveniente na mudança média e na transferência organoide no estágio inicial, a pesquisa atual otimiza a tecnologia de operação aplicando o princípio da engenharia. Uma lâmpada de luz macia foi adotada para iluminar lateralmente as amostras do corpo embrionário (EB), permitindo que os EBs fossem vistos a olho nu através do efeito de reflexão difusa aprimorado. Utilizando o princípio do fluxo secundário gerado pela rotação, os organoides se reúnem em direção ao centro do poço, o que facilita o funcionamento de mudança média ou transferência organoide. Comparado com a célula dispersa, o corpo embrionário se instala mais rápido na pipeta. Usando este fenômeno, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem ser efetivamente removidos de forma simples, impedindo que os EBs incorram em danos causados por centrifugação. Este estudo facilita o funcionamento da cultura organoide cerebral e ajuda a promover a aplicação de organoides cerebrais.

O presente estudo induziu iPSCs (Figura 2B) em organoides cerebrais (Figura 2C). Os EBs cultivados na fase inicial expressaram o marcador OCT4 (Figura 2A), que indicava boa pluripotência. No estágio posterior, os EBs desenvolveram-se em organoides cerebrais maduros (Figura 2D). A pesquisa cultivou iPSCs de indivíduos saudáveis normais e pacientes SCA3 em organoides cerebrais (Figura...

Organoides cerebrais oferecem oportunidades sem precedentes para estudar o desenvolvimento de órgãos e a patologia da doença humana. Embora tenha sido alcançado grande sucesso com sistemas de cultura organoides cerebrais, ainda há dificuldades operacionais na aplicação dessa tecnologia. O presente protocolo descreve um procedimento organoide cerebral que facilita a mudança média e a transferência organoide.

Facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave

At present, cerebral organoid culture technology is still complicated to operate and difficult to apply on a large scale. It is necessary to find a simple ...

O protocolo facilita o funcionamento da cultura dos organoides cerebrais e ajuda a promover a aplicação de organoides cerebrais. O organoide do estágio anterior pode ser visto a olho nu usando uma lâmpada de luz macia lateral que é conveniente para muitas operações. Os métodos aprimorados de mudança média e as operações de transferência de organoides também são úteis para outros tipos de culturas organoides e para o desenho de máquinas de culturas automáticas.Para começar, cultura os iPSCs com mTeSR1 médio em um matrigel coberto 35 milímetros placa petri e mudar o meio todos os dias. A densidade de crescimento do iPSC não deve exceder 75% Em seguida, pipeta fora do mTeSR1 médio dos iPSCs e lavá-lo duas vezes com um milímetro de PBS. Após a pipetação do PBS, adicione 300 microliters da solução de descolamento celular para digerir os iPSCs em células únicas por três a quatro minutos a 37 graus Celsius.Posteriormente, resuspenge as células em dois milímetros de média de formação de EB e centrifugar a amostra por cinco minutos a 300 vezes g. Trate a placa especializada de 24 poços com 500 microliters por poço de solução anti-adesão por cinco minutos. Agora, resuspensar as células no me

facilitating-cerebral-organoid-culture-via-lateral-soft-light

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Ibanez-Rios, M.I., et al., Um Modelo Organoide Cerebral Humano de Transplante de Células Neurais. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra a injeção de células progenitoras neurais (NPCs) marcadas com fluorescência em organoides cerebrais humanos usando uma mistura de matriz celular. O método é reprodutível e livre de animais, permitindo o transplante com o mínimo de ruptura organoide. Ele oferece uma plataforma valiosa para modelar transplantes neurais e doenças do sistema nervoso...

Injeção de células progenitoras neurais fluorescentes em organoides cerebrais humanos para modelagem de transplante

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este vídeo descreve a preparação e o cultivo de organoides de tumores cerebrais a partir de suspensão de célula única. Usando uma matriz extracelular rica em laminina como andaime e meio de cultura para nutrientes, as células são facilitadas a se multiplicar e se auto-organizar dentro do organoide. Consequentemente, organoides ex vivo são gerados, mimetizando a diversidade celular e o microambiente dos tumores cerebrais.

Gerando uma cultura organoide a partir de uma suspensão de células tumorais cerebrais

Este vídeo descreve a criação de organoides do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs), demonstrando a progressão de agregados de células-tronco para estruturas complexas que imitam o córtex do cérebro e se diferenciam em vários tipos de neurônios.

Geração de organoides cerebrais do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Este vídeo mostra a utilização de uma técnica de iluminação lateral de luz suave para melhorar a visualização a olho nu de corpos embrióides, facilitando assim sua manipulação e transferência durante a cultura de organoides cerebrais. Ele elucida a configuração da iluminação de luz suave, métodos para mudanças de mídia e transferência de corpos embrióides, bem como o procedimento para induzir a diferenciação neural em corpos embrióides para o desenvolvimento de organoides cerebrais.

Uma técnica para otimizar a cultura de organoides cerebrais usando iluminação lateral de luz suave

Concebemos um aparelho de cultura contínua para uso com sistemas de optogenetic para iluminar culturas de micróbios e regularmente células de imagem no efluente com um microscópio invertido. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados para que as respostas dinâmicas a iluminação pode ser medida ao longo de vários dias.

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Este trabalho apresenta um protocolo de fabricação para um novo tipo de substrato de cultura com centenas de microrecipientes por mm2, no qual organoides podem ser cultivados e observados por microscopia de alta resolução. Os protocolos de semeadura celular e imunocoloração também são detalhados.

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

O presente protocolo fornece um procedimento passo a passo para a geração, manutenção e envelhecimento reprodutíveis de organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Este método permite cultivar e amadurecer organoides cerebrais por longos períodos, o que facilita a modelagem dos processos envolvidos no envelhecimento cerebral e na patogênese relacionada à idade.

Fabricação robusta de tecidos para cultura de longo prazo de organoides cerebrais derivados de iPSC para pesquisa de envelhecimento

Descrevemos pipelines de imagem e rastreamento confocais aplicados a duas estratégias de repórteres: organoides mosaico para resolver comportamentos individuais de células e organoides repórteres de destino para monitoramento de transições de tipos celulares em organoides intestinais humanos e murinos.

Imagens de células vivas e rastreamento de células únicas para monitorar dinâmicas clonais e transições de destino em organoides intestinais humanos e murinos

Aprenda a cultivar organoides cerebrais usando iluminação lateral suave para melhorar a visibilidade e facilitar as operações de troca de meio e transferência. Este protocolo simplifica a cultura de organoides para pesquisa em neurociência.

Facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave

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