Name: Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a isolar vesículas extracelulares de plasma e tecidos sólidos com alta pureza e rendimento. Este método permite analisar antígenos de superfície e cargas proteicas por citometria de fluxo e Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e as diretrizes do ARRIVE. Para o presente estudo, camundongos C57Bl/6 com 8 semanas de idade (sem preferência por fêmeas ou machos) foram utilizados. As etapas envolvidas no isolamento dos EVs plasmáticos e teciduais estão ilustradas na Figura 1. O plasma é tomado como um representante para descrever o procedimento de isolamento EV de fluidos corporais. O osso maxilar é tomado como um representante para explicar o procedimento de isolamento EV dos tecidos sólidos.
1. Preparo das amostras de plasma e osso maxilar
<ol><li>Prepare as amostras de plasma seguindo os passos abaixo.<ol><li>Determine o peso corporal do rato utilizando uma balança de laboratório padrão.</li>
		<li>Adicionar 20 μL, 2 mg/mL de heparina a um tubo de centrífuga de 1,5 mL e usar o dispositivo misturador (ver Tabela de Materiais) para deixar a heparina se fixar à parede do tubo. NOTA: Os tubos de anticoagulação também podem ser usados diretamente para coletar o sangue.</li>
		<li>Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (ver Tabela de Materiais). Agarre o pescoço do rato com o polegar e o indicador, depois fixe a cauda e a perna traseira esquerda com o dedo mínimo e injete o pentobarbital sódico com uma seringa de injeção de 1 ml depois de expor a barriga.</li>
		<li>Confirme se o rato está adequadamente anestesiado com base na ausência de reflexo corneano e reação dos membros quando o coxim plantar é comprimido.</li>
		<li>Faça a barba dos pelos do rosto e dos cílios dos olhos com uma tesoura curva.</li>
		<li>Pegue a pele do pescoço do rato e pressione a pele ao redor dos olhos para a parte de trás do pescoço para que o globo ocular se projete. Use uma pinça oftálmica para prender rapidamente o globo ocular e colete a saída de sangue com os tubos centrífugos de 1,5 mL preparados na etapa 1.1.2. Sacrifique o rato deslocando a vértebra cervical. CUIDADO: Cuidado com os pelos e cílios, pois eles podem causar hemólise.</li>
		<li>Vire suavemente o tubo de cabeça para baixo várias vezes para evitar a coagulação do sangue. CUIDADO: Vire o tubo de cabeça para baixo o mais rápido possível.</li>
		<li>Centrifugar a amostra de sangue durante 15 minutos a 1.200 x g a 4 °C.</li>
		<li>Transfira cuidadosamente o sobrenadante para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 ml e utilize a amostra de plasma imediatamente ou armazene-a a 4 °C durante algumas horas.</li>
		<li>Diluir o sobrenadante com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e misturar bem. NOTA: O protocolo fornecido acima para coletar o plasma é fatal. O sangue também pode ser coletado por punção da veia subclávia11 sem sacrifício do camundongo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare as amostras de osso maxilar seguindo os passos abaixo.<ol><li>Isole o osso maxilar com pinça oftálmica e tesoura e lave-os com PBS para se livrar dos tecidos moles com pinça.</li>
		<li>Coloque o osso maxilar em tubos de centrífuga de 1,5 mL e corte o osso em pequenos pedaços (o tamanho deve ser inferior a 1 mm de diâmetro) com uma tesoura. Adicionar uma certa quantidade de Liberase (5 μg/ml, ver Tabela de Materiais) para cobrir o tecido (geralmente 1 ml para amostras ósseas de um rato com 8 semanas de idade) e, em seguida, incubar durante 30 minutos a 37 °C.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 800 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfira cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Extração de EVs
<ol><li>Centrifugar as amostras (preparadas nos passos 1.1.10 e 1.2.4) durante 15 minutos a 2.500 x g (4 °C) para remover os restos de grandes células e as plaquetas remanescentes.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente os sobrenadantes para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 ml e centrifuga durante 30 minutos a 16.800 x g (4 °C). NOTA: A velocidade de centrifugação pode ser ajustada para mais de 10.000 x g para extrair EVs12. Quanto maior a velocidade da centrífuga, mais quantidade de EVs pode ser obtida. Como o limite de velocidade da centrífuga que utilizamos é de 16.800 x g (ver Tabela de Materiais), optamos por essa velocidade neste protocolo.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em cada tubo com 1 mL de PBS. Centrifugar durante 30 minutos a 16.800 x g (4 °C).</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em cada tubo com 50 μL de PBS. Conservar estas amostras a 4 °C durante menos de 24 horas ou, de preferência, utilizar imediatamente para as seguintes análises (passos 3-5). CUIDADO: O armazenamento a -80 °C é inaceitável, pois isso reduzirá a concentração de EVs e aumentará o tamanho das partículas de EVs13, influenciando assim a análise seguinte de EVs.</li>
</ol>3. Identificação morfológica dos EVs
<ol><li>Realizar análise NTA.<ol><li>De acordo com a quantidade de EVs (aproximadamente julgada pelo tamanho dos pellets, as partículas de 50 μL de plasma são o mínimo), transferir 5-50 μL de ressuspensão (passo 2.4), diluir em 10 mL de solução tampão (PBS filtrado com filtro de 0,22 μm) e misturar com 1 mL de micropipetadores suficientemente. Use esta suspensão final para medição de partículas.</li>
		<li>Use uma seringa estéril de 1 mL para injetar pelo menos 5 mL de água destilada com uma velocidade moderada e constante até que o número de partículas exibidas na interface de detecção seja inferior a cinco. NOTA: Depois de injetar 1 mL de água destilada através de todo o canal, o número de partículas é mostrado diretamente na interface de detecção. Se o número ainda for superior a cinco, continuar injetando 1 mL de água destilada até que os critérios sejam atendidos.</li>
		<li>Reconstituir 1 μL de solução de calibração em 1 mL de água destilada para gerar uma solução primária e, em seguida, tomar 100 μL da solução primária para 25 mL de água destilada para preparar uma solução-mãe padrão (1:250.000). Conservar este reagente de trabalho a 4 °C durante 1 semana.</li>
		<li>Calibrar o instrumento NTA com a solução-mãe padrão (passo 3.1.3). Injetar 1-5 mL da solução de calibração de trabalho com uma seringa estéril de 1 mL para lavar o canal da máquina até que o número de partículas exibidas na interface de detecção esteja entre 50-400 (de preferência em torno de 300). Execute o programa de calibração.</li>
		<li>Repita o passo 3.1.2 para limpar o canal da máquina antes de cada medição da amostra.</li>
		<li>Use uma seringa estéril de 1 mL para injetar pelo menos 2 mL de solução tampão para lavar o canal da máquina a uma velocidade constante até que o número de partículas exibidas na interface de detecção seja inferior a 10.</li>
		<li>Injectar 1 ml da amostra de EV preparada no passo 3.1.1 com uma velocidade moderada e constante (a velocidade recomendada é de 0,5-1 ml/s). NOTA: A concentração ideal de partículas está fazendo com que o número de partículas exibidas na interface de detecção varie de 50 a 400, de preferência em torno de 300. Se o número de partículas for demasiado elevado, repetir o passo 3.1.2 para lavar imediatamente o canal da máquina para evitar a retenção de partículas na parede do canal e ajustar a concentração da amostra de EV com o passo 3.1.1 e, em seguida, repetir o passo 3.1.5.</li>
		<li>Realizar a análise de partículas e gerar os relatórios de análise de acordo com as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais).</li>
		<li>Se a amostra for preciosa, bombeie de volta a amostra de EV com a seringa de 1 mL e colete-a em tubos de centrífuga de 1,5 mL. Repita a etapa 2.2 para extrair os EVs.</li>
		<li>Depois de detectar todas as amostras, injetar pelo menos 2 mL de solução tampão no canal da máquina e, em seguida, injetar pelo menos 5 mL de água destilada até que o número de partículas exibidas na interface de detecção seja inferior a cinco.</li>
		<li>Use uma seringa estéril de 5 mL para injetar pelo menos 10 mL de ar a uma velocidade constante (a velocidade recomendada é de 1 mL/s) para remover a água no canal.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar análise de TEM. Observação : execute as seguintes etapas com novas resuspensões EV. A grade do microscópio eletrônico revestido com formvar-carbono tem dois lados, com o lado de trabalho sendo luminoso nas grades centrais. O volume mínimo de plasma para extrair os EVs para o procedimento abaixo é de 50 μL.<ol><li>Misturar a amostra de EV (passo 2.4) com um volume igual de paraformaldeído a 4% (PFA). Depositar 4 μL dos EVs em uma grade e incubar por 15 min à temperatura ambiente (TR).</li>
		<li>Coloque quatro gotas de PBS (uma gota é igual a 50 μL) em uma folha de filme de polietileno (ver Tabela de Materiais). Transfira as grades com pinças microscópicas limpas e lave o lado de trabalho da grade em PBS de uma gota para outra.</li>
		<li>Use papéis de filtro para remover PBS extras que permaneceram nas grades.</li>
		<li>Incubar o lado de trabalho da grelha em ácido fosfotúngstico a 1% (ver Tabela de Materiais) durante 2 minutos e, em seguida, repetir o passo 3.2.2. CUIDADO: Como o ácido fosfotúngstico é venenoso, esse procedimento precisa ser operado no exaustor de fumaça, e o ácido fosfotúngstico redundante precisa ser especificamente reciclado em vez de descartado diretamente.</li>
		<li>Coloque as grades viradas para cima em um prato de 10 cm coberto com papéis de filtro. As grades podem ser armazenadas em RT por vários anos.</li>
		<li>Observe as grades sob um microscópio eletrônico seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). NOTA: Para garantir que as partículas individuais sejam observadas, a concentração dos EVs deve ser ajustada e a suspensão precisa ser clara sem turbidez óbvia. Antes de cair, a amostra deve ser bem misturada. As análises representativas do ETM e NTA são mostradas na Figura 2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise de origem dos EVs
NOTA: A identificação da origem celular dos EVs requer a aplicação de anticorpos para marcadores típicos da membrana celular. O volume plasmático mínimo para extrair os EVs para o procedimento abaixo é de 300 μL. Com base nas estruturas da bicamada lipídica dos EVs, o corante de membrana pode ser usado para marcá-los. Para amostras de plasma sanguíneo, o CD18 para linfócitos14 é escolhido para representação. Para amostras de osso maxilar, o receptor associado aos osteoclastos (OSCAR) para osteoclastos15 é selecionado como exemplo. Antes da CF, certifique-se de que o citômetro de fluxo esteja adaptado para a medição de EVs16, pois o limite inferior de tamanho é amplamente diferente entre citômetros de fluxo distintos.
<ol><li>Ressuspender as amostras (passo 2.4) com 500 μL de PBS e transferir 50 μL para um tubo de centrífuga novo e limpo de 1,5 ml como controlo em branco (tubo A) e outros 50 μL para um tubo de centrifugação novo e limpo de 1,5 ml como um tubo de coloração simples para FITC (tubo B). Adicionar 0,5 μL de corante de membrana ao tubo primário para coloração da membrana. Incubar por 5 min no TR.</li>
	<li>Centrifugar o tubo primário durante 30 minutos a 16.800 x g (4 °C). Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets com 200 μL de PBS.</li>
	<li>Divida cada amostra de 50 μL em quatro tubos de centrífuga de 1,5 mL para tubos de coloração simples para PE (tubo C), coloração de marcador de superfície (tubo D) e controles somente com anticorpos secundários (tubo E).</li>
	<li>Adicionar o anticorpo primário de OSCAR em amostras de EV ósseo, bem como o anticorpo CD18 em amostras de EV plasmático (ver Tabela de Materiais) ao tubo B (passo 4.1) e ao tubo D (passo 4.3) separadamente (diluído a 1:100). Incubar durante 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Centrifugar os tubos durante 30 minutos a 16.800 x g (4 °C). Descarte o sobrenadante, ressuspenda os pellets com 500 μL de PBS e, em seguida, centrifugue novamente por 30 min a 16.800 x g (4 °C) para remover os anticorpos primários extras.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante e ressuspender os pellets com 50 μL de PBS, seguindo-se a adição de anticorpos secundários conjugados com FITC (ver Tabela de Materiais), respetivamente (diluídos a 1:200) (tubo E). Adicionar os mesmos anticorpos secundários ao tubo B (passo 4.1) e ao tubo D (passo 4.3). Incubar todos os tubos durante 1 h, a 4 °C no escuro. NOTA: Os anticorpos de marcação conjugados por fluorescência direta também podem ser usados para processar a detecção de FC com controles de isotipo adequados.</li>
	<li>Dilua uma gota de esferas de 0,2, 0,5 e 1 μm (ver Tabela de Materiais) respectivamente em 1 mL de PBS e execute primeiro as contas de cada tamanho para se certificar do portão escolhido para EVs. Defina o limiar do citômetro de fluxo para procurar as contas e a população de EV usando uma dispersão direta adequada (FSC) e uma dispersão lateral (SSC).<ol><li>Defina a condição terminal como calculando 100.000 partículas tingidas por membrana. Analise a amostra através de um citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Os resultados representativos são apresentados na Figura 3. NOTA: Equipamentos NTA com canais de fluorescência também podem ser usados para análise de origem, e a preparação da amostra é a mesma que FC.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise do teor de proteínas de EVs
NOTA: A análise do teor de proteínas dentro dos EVs é realizada via western blot. Por exemplo, os EVs plasmáticos e ósseos foram selecionados para analisar a 6-fosfogluconato desidrogenase (PGD) e a piruvato quinase M2 (PKM2) quanto ao estado metabólico. Golgin84 (organela de Golgi) foi usado como controle negativo, e Flotillina (proteína de membrana), Caveolina (proteína integral das cavéolas) e β-actina (citoesqueleto)17 foram usadas como controle positivo em EVs em comparação com amostras celulares. Mitofilina e α-Actinina-4 foram escolhidas como grandes marcadores de EV, enquanto CD9 e CD81 foram escolhidos como pequenos marcadores de EV para demonstrar as subpopulações de EV18. A apoa1 foi selecionada como marcador de lipopartículas plasmáticas19. Para obter os respectivos detalhes do reagente, consulte Tabela de materiais.
<ol><li>Ressuspender os pellets (passo 2.4) em 50 μL de tampão de lise RIPA e incubar durante 30 min sobre gelo.</li>
	<li>Quantificar as concentrações de proteínas de todas as amostras na microplaca de 96 poços através do ensaio de proteína BCA seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).<ol><li>Diluir os 2 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) com 0,9% de solução salina normal (NS) (contendo 0,9% (p/v) de cloreto de sódio) em 0,5 mg/mL. Acrescentar 0,5 mg/mL de SC e 0,9% de SN em três poços duplicados com determinados volumes, como mostra a Tabela 1.</li>
		<li>Soltar 2 μL das amostras (passo 5.1) e adicionar 18 μL de SN em três poços duplicados separadamente.</li>
		<li>Prepare uma solução de trabalho misturando o Reagente A de BCA com o Reagente B (Reagente A:B 50:1). Adicionar 200 μL da solução de trabalho a cada poço e agitar suavemente durante 30 s.</li>
		<li>Incubar a microplaca de 96 poços durante 20-25 min a 37 °C.</li>
		<li>Medir o DO a 596 nm pelo espectrofotômetro (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Exporte os dados.</li>
		<li>Desenhar uma curva padrão e calcular a concentração de proteína das amostras.</li>
	</ol></li>
	<li>De acordo com os resultados, diluir as amostras a 1 μg/μL com 0,9% de NS e tampão de carregamento SDS-PAGE 5x (Tris· 250 mM HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) Glicerol, 10 mM TDT, 0,05% (p/v) Azul de bromofenol, ver Tabela de Materiais). Sele bem os tubos com filme e aqueça por 5 min a 100 °C.</li>
	<li>Coloque as amostras e a escada de proteína em uma concentração gradiente de 4%-20% de gel Hepes-Tris (ver Tabela de Materiais). OBS: Escolha a porcentagem do gel de acordo com o peso molecular das proteínas de interesse.</li>
	<li>Passe o gel no tampão de corrida a 80 V até que as proteínas formem uma linha e, em seguida, mude para 120 V por 1 h até que o corante de carga esteja na parte inferior do gel. OBS: O tempo de execução pode variar de acordo com o equipamento utilizado ou com o tipo e concentração do gel.</li>
	<li>Transfira o gel para a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (ver Tabela de Materiais), pré-incubada em álcool metílico por 20 s. Use um sistema de transferência úmida para transferir por 1 h a 200 mA. CUIDADO: Certifique-se de que não haja nenhuma bolha dentro do sistema de transferência e mantenha a membrana PVDF molhada. NOTA: O tempo de transferência pode variar de acordo com o peso molecular da proteína alvo; 1 KD geralmente precisa de 1 min.</li>
	<li>Preparar tampão de bloqueio de BSA a 5% adicionando 2,5 g de BSA (ver Tabela de Materiais) em 50 mL de solução salina-Tween tamponada com Tris (TBST) (2 mL de Tween adicionados em 2 L de solução PBS) em um tubo de centrífuga de 50 mL. Agitar até dissolver o pó. Bloquear as membranas neste tampão por 2 h na RT com agitação.</li>
	<li>Incubar as membranas com anticorpos primários específicos diluídos com TBST em concentração adequada (Mitofilin, 1:1000; α-Actinina-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotina 1, 1:1000; Caveolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actina, 1:3000) durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lavar as membranas no tampão de lavagem (2 mL de Tween adicionados em 2 L de solução de PBS) quatro vezes (15 min cada vez) e incubar as membranas com os anticorpos secundários adequados a 1:4000 por 1 h na RT com agitação.</li>
	<li>Lave as membranas no tampão de lavagem quatro vezes (15 min cada vez) e obtenha imagens das membranas usando o Kit de quimioluminescência e um sistema de imagem em gel (consulte a Tabela de Materiais).</li>
</ol>

<ol><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+extracellular+vesicles%3A+biogenesis%2C+RNA+cargo+selection%2C+content%2C+release%2C+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases%3A+A+clinician%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li>
<li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).</li>
<li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-educated+pletelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li>
<li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+microvesicle+release%2C+uptake%2C+and+microvesicle-mediated+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li>
<li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).</li>
<li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment%3A+old+stories%2C+but+new+tales%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).</li>
<li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles%3A+A+systematic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).</li>
<li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+utilize+CD11b%2FCD18+for+adhesion+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li>
<li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+multinucleation%3A+review+of+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).</li>
<li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).</li>
<li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+exosomal+isolation+methods%3A+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma%3A+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li>
<li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Görgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).</li>
<li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li>
<li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li>
<li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lipid+rafts+%28detergent-resistant+microdomains%29+and+comparison+to+extracellular+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Ao estudar as características, o destino e a função dos EVs, é crucial isolar EVs com alto rendimento e baixa contaminação. Existem vários métodos para extrair EVs, como centrifugação por gradiente de densidade (DGC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e ensaios de imunocaptura 4,20. Aqui, um dos métodos mais comumente utilizados, a centrifugação diferencial, foi usado; as vantagens disso são que não é demorado, gera um alto rendimento de EVs com fácil is...

Vesículas extracelulares (EVs) têm sido propostas para definir estruturas extracelulares liberadas de lipídios e fechadas por bicamadas1, que desempenham papéis importantes em vários eventos fisiológicos e patológicos2. Os EVs liberados por células saudáveis podem ser amplamente divididos em duas categorias principais, a saber, exossomos (ou pequenos EVs) formados através de uma via de tráfego endocítico intracelular3 e microvesículas (ou grandes EVs) desenvolvidas pelo brotamento externo da membrana plasmática da célula4. Enquanto muitos estudos enfocam a função dos EVs coletados de células cultivadas in vitro5, os EVs derivados da circulação ou tecidos são mais complexos e heterogêneos, o que tem a vantagem de refletir o verdadeiro estado do organismo in vivo6. Além disso, quase todos os tipos de tecidos podem produzir EVs in vivo, e esses EVs podem atuar como mensageiros dentro do tecido ou ser transferidos por vários fluidos corporais, especialmente o sangue periférico, para facilitar a comunicação sistêmica7. Os EVs na circulação e nos tecidos também são alvos para o diagnóstico e tratamento da doença8.
Enquanto os exossomos têm sido intensamente estudados nos últimos anos, as microvesículas também têm funções biológicas importantes, que podem ser facilmente extraídas sem ultracentrifugação, promovendo pesquisas básicas eclínicas9. Notadamente, uma questão crítica em relação aos EVs isolados da circulação e dos tecidos é que eles são derivados de diferentes tipos celulares10. Uma vez que as microvesículas são sopradas da membrana plasmática e caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície celular9, o uso de marcadores da membrana da célula de origem para identificar a origem celular desses EVs é viável. Especificamente, a técnica de citometria de fluxo (FC) pode ser aplicada para detectar marcadores de membrana. Além disso, os pesquisadores podem isolar os EVs e fazer análises adicionais com base nas cargas funcionais.
O presente protocolo fornece um procedimento minucioso para extração e caracterização de EVs de amostras in vivo. Os EVs são isolados via centrifugação diferencial, e a caracterização dos EVs inclui identificação morfológica via análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET), análise de origem via FC e análise de carga proteica via western blot. O plasma sanguíneo e o osso maxilar de camundongos são usados como representantes. Os pesquisadores podem consultar este protocolo para EVs de outras fontes e fazer as modificações correspondentes.

<table><tbody><tr><td>4% de paraformaldeído&nbsp;</td><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td> <td>143174 Biosharp</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-cabra Alexa fluor 488</td><td>Yeason</td><td>34306ES60</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 anticorpo secundário de coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD18</td><td>Abcam</td><td>ab131044</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD81</td><td>Abcam ab109201</td><td></td><td>Anticorpo anti-CD9 Western blot</td></tr><tr><td></td><td>Huabio</td><td>ET1601-9</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mitofilina</td> Western blot <td>Abcam</td><td>ab110329</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>APOA1 Rabbit pAb</td><td>Abclone</td><td>A14211</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA</td><td>TIANGEN</td><td>PA115</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94964-500UL</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>MP Biomedical</td><td>218072801</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo Caveolina-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53564</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>CellMask Coloração laranja da membrana plasmática</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Quimioluminescência</td><td>Amersham Biosciences</td><td>N / A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tesoura de operação curva</td><td>JZ Instrumento cirúrgico</td><td>J21040</td><td>EV isolamento</td></tr><tr><td>Balança eletrônica</td><td>Zhi Ke</td><td>ZK-DST</td><td>EV isolamento</td></tr><tr><td>Epoch espectrofotômetro</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Eppendorf tubos</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>3810X</td><td>EV isolamento</td></tr><tr><td>Flotillin-1 anticorpo</td><td>PTM BIO</td><td>PTM-5369</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel</td><td>Tanon</td><td>4600</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Golgin84</td><td>Novus</td><td>nbp1-83352</td><td>Grades de Western blot</td></tr><tr><td>- Formvar/Carbon Coated - Cobre 200 mesh</td><td>Polysciences</td><td>24915</td><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td>Solução</tr><tr><td>de heparina</td><td>Célula-tronco&nbsp;</td><td>7980</td><td>EV isolamento</td></tr><tr><td>Liberase Grau de pesquisa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td>isolamento EV</td></tr><tr><td>Pinça microscópica</td><td>JZ Instrumento cirúrgico</td><td>JD1020</td><td>EV isolamento</td></tr><tr><td>NovoCyte citômetro de fluxo</td><td>ACEA</td><td>N/A</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Omni-PAGE Hepes-Tris Géis Hepes 4~20%, 10 poços</td><td>Epizyme</td><td>LK206</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>OSCAR( D-19) anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-34235</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>PBS (2x)</td><td>ZHHC</td><td>PW013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-33-0</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>115-035-003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>111-035-003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico</td><td>RHAWN</td><td>12501-23-4</td><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td></tr><tr><td>PKM2(d78a4) xp rabbit&nbsp; mab&nbsp;</td><td>Sinalização Celular</td><td>4053t</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Filme de polietileno (PE)</td><td>Xiang yi</td><td>200150055</td><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td></tr><tr><td>Membranas de fluoreto de polivinilideno&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3010040001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Inibidores de protease</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PGD recombinante</td><td>Abcam</td><td>ab129199</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tampão de lise RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tampão de carregamento SDS-PAGE (5x)</td> <td>Cwbio</td><td>CW0027S</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Grânulos de</td> <td>tamanhoInvitrogen</td><td>F13839</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Microcentrífugas de mesa de alta velocidade</td><td>Hitachi</td><td>CT15E</td><td>EV isolamento</td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>HITACHI</td><td>H-7650</td><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>19472</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Vortex Mixer Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI0425</td><td>EV isolamento</td></tr><tr><td>ZetaView BASIC NTA - Microscópio de Vídeo de Rastreamento de Nanopartículas PMX-120</td><td>Particle Metrix</td><td>N/A</td><td>Análise de rastreamento de nanopartículas</td></tr><tr><td>&alfa;-Actinina-4 Rabbit mAb</td><td>Abclone</td><td>A3379</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>&beta;-actina</td><td>Cwbio</td><td>CW0096M</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

isolamento e análise de vesículas extracelulares rastreáveis e funcionalizadas do plasma e tecidos sólidos

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

As vesículas extracelulares (EVs) circulantes e residentes nos tecidos representam alvos promissores como novos biomarcadores teranósticos, e emergem como importantes atores na manutenção da homeostase do organismo e na progressão de um amplo espectro de doenças. Enquanto a pesquisa atual se concentra na caracterização de exossomos endógenos com origem endossomal, microvesículas que sopram da membrana plasmática têm ganhado atenção crescente na saúde e na doença, que são caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície recapitulando a assinatura da membrana das células parentais. Aqui, um procedimento reprodutível é apresentado baseado na centrifugação diferencial para extrair e caracterizar EVs do plasma e tecidos sólidos, como o osso. O protocolo descreve ainda o perfil subsequente de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, que são rastreáveis por suas derivações e identificados com componentes relacionados à função potencial. Este método será útil para análise correlacional, funcional e mecanística de EVs em estudos biológicos, fisiológicos e patológicos.

De acordo com o fluxo de trabalho experimental, os VE podem ser extraídos do sangue periférico e dos tecidos sólidos (Figura 1). O osso maxilar de um camundongo com 8 semanas de idade é de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, e cerca de 300 μL de plasma podem ser coletados do camundongo. Seguindo as etapas do protocolo, 0,3 mg e 3 μg de VE podem ser coletados, respectivamente. Conforme analisado por MET e NTA, as características morfológicas típicas dos EVs são vesículas redondas de membrana em for...

O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Este protocolo fornece uma maneira viável de isolar e coletar as vesículas extracelulares corretas da maioria dos tecidos sanguíneos e sólidos, especialmente analisar sua fonte e o conteúdo de proteínas, o que ajuda em experimentos funcionais posteriores. Além do alto rendimento e da baixa contaminação, a principal vantagem deste protocolo é a análise de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, o que é útil para estudos fisiológicos e patológicos. Facilita o diagnóstico de cânceres de doenças, como doenças inflamatórias e osteoporose através da detecção de marcadores de superfície de células parentais de vesículas extracelulares com citômetro de fluxo.A quantidade de vesícula extracelular tecidual é crítica para os experimentos seguintes. Certifique-se de que a concentração de vesícula extracelular não é alta. Tenha paciência para realizar a diluição.Para começar, prepare as amostras de osso maxilar isolando o osso maxilar com pinça oftálmica e tesoura e lave-as com PBS para se livrar dos tecidos moles com pinça. Em seguida, coloque o osso maxilar em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e corte o osso em pequenos pedaços de um milímetro de diâmetro com tesoura. Adicione uma certa quantidade de Liberase para cobrir o tecido e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, centrifugar a amostra a 800 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e transferir cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de centrífuga novo e limpo de 1,5 mililitro. Depois de centrifugar as amostras de plasma e osso preparadas por 15 minutos a 2, 500 G e quatro graus Celsius para remover grandes restos celulares e plaquetas remanescentes, transfira cuidadosamente os sobrenadantes para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 mililitro e centrífuga a 16.800 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em cada tubo com um mililitro de PBS.Após centrifugar e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente, ressuspenda os pellets em cada tubo com 50 microlitros de PBS e armazene essas amostras a quatro graus Celsius por menos de 24 horas ou, de preferência, use-as imediatamente para as análises. Ressuspenda amostras com 500 microlitros de PBS e transfira 50 microlitros para um novo e limpo tubo centrífugo de 1,5 mililitro como um controle em branco rotulado como tubo A e outros 50 microlitros para outro tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro como um tubo de coloração simples para FITC, rotulado como tubo B.Adicione 0,5 microlitros de corante de membrana ao tubo primário para coloração de membrana enquanto incuba por cinco minutos à temperatura ambiente. Após centrifugar o tubo primário por 30 minutos a 16,800 G e descartar o sobrenadante, ressuspender os pellets com 200 microlitros de PBS.Divida cada amostra de 50 microlitros em quatro tubos de centrífuga de 1,5 mililitro para tubos de coloração simples para PE marcados como tubo C, coloração de marcador de superfície marcada como tubo D e controles secundários somente de anticorpos rotulados como tubo E.Adicione o anticorpo primário do receptor associado aos osteoclastos e amostras de vesícula extracelular óssea, bem como amostras de anticorpos CD-18 e vesículas extracelulares plasmáticas ao tubo B e ao tubo D separadamente, incubando por uma hora a quatro graus Celsius. Centrifugar os tubos e descartar o sobrenadante conforme demonstrado anteriormente e ressuspender os pellets com 500 microlitros de PBS. Novamente, centrifugar por 30 minutos a 16, 800 G e quatro graus Celsius para remover os anticorpos primários extras.Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda os pellets com 50 microlitros de PBS, seguido da adição de anticorpos secundários conjugados FITC, respectivamente, no tubo E.Incube todos os tubos por uma hora a quatro graus Celsius no escuro. Diluir uma gota de 0,2, 0,5 e uma suspensão de contas de tamanho micrométrico, respectivamente, em um mililitro de PBS. Em seguida, execute cada tamanho de contas para certificar-se da porta escolhida para vesículas extracelulares e defina o limiar do citômetro de fluxo para procurar a população de contas e vesículas extracelulares usando uma dispersão interna adequada para frente.Defina a condição terminal como calculando 100.000 partículas tingidas por membrana e analise a amostra por meio de um citômetro de fluxo, conforme descrito no manuscrito. Ressuspender os pellets em 50 microlitros de tampão de lise RIPA e incubar por 30 minutos sobre gelo. Para quantificar as concentrações de proteína de todas as amostras na microplaca de 96 poços pelo ensaio de proteína BCA, diluir os dois miligramas por mililitros de BSA com 0,9% de solução salina normal em 0,5 miligramas por mililitros.A 0,5 miligramas por mililitro de BSA e 0,9% de soro fisiológico normal em três poços duplicados com certos volumes. Em seguida, solte dois microlitros das amostras e adicione 18 microlitros de soro fisiológico normal em três poços duplicados separadamente. Depois de preparar uma solução de trabalho misturando o reagente A de BCA com o reagente B, adicione 200 microlitros da solução de trabalho a cada poço e agite suavemente durante 30 segundos.Em seguida, incube a microplaca de 96 poços por 20 a 25 minutos a 37 graus Celsius e meça a densidade óptica em 596 nanômetros com o espectrofotômetro. Em seguida, exporte os dados, desenhe uma curva padrão e calcule a concentração de proteína das amostras. De acordo com os resultados, diluir as amostras para um micrograma por microlitro com 0,9% de soro fisiológico normal e cinco vezes a concentração do tampão de carregamento SDS-PAGE e selar os tubos com filme firmemente e aquecer por cinco minutos a 100 graus Celsius.Coloque as amostras na escada de proteína em um gradiente de concentração de quatro a 20% de gel tris de HEPy. Passe o gel no tampão de corrida a 80 volts até que as proteínas formem uma linha. Em seguida, mude para 120 volts por uma hora até que o corante de carga esteja na parte inferior do gel.Transferir o gel para a membrana de fluoreto de polivinilideno pré-incubada em álcool metílico por 20 segundos usando um sistema de transferência úmida para transferir por uma hora a 200 miliamperes. Prepare o tampão de bloqueio de BSA a 5% adicionando 2,5 gramas de BSA e 50 mililitros de TBST em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Bloquear as membranas neste tampão durante duas horas à temperatura ambiente com agitação.Incubar as membranas com anticorpos primários específicos diluídos com TBST em concentração adequada durante a noite a quatro graus Celsius. Lavar as membranas no tampão de lavagem quatro vezes e incubar as membranas com anticorpos secundários adequados durante uma hora à temperatura ambiente com agitação. Depois de lavar as membranas no tampão de lavagem quatro vezes, obtenha imagens das membranas usando o kit de quimioluminescência em um sistema de imagem em gel.A microscopia eletrônica de transmissão e a análise de rastreamento de nanopartículas revelaram que as características morfológicas típicas das vesículas extracelulares foram redondas e em forma de taça com um diâmetro variando de 500 a 300 nanômetros. A análise por citometria de fluxo mostra as porcentagens de marcadores de membrana específicos expressos em vesículas extracelulares que implicam sua origem a partir de células parentais. A análise de Western blot mostra a expressão de PGD e PKM2, respectivamente, como representante do conteúdo proteico e das vesículas extracelulares plasmáticas e extracelulares ósseas, indicando o estado metabólico.A expressão negativa de Golgin-84 em vesículas extracelulares foi detectada com a presença de mitofilina, alfa-actinina-4, flotillina-1, caveolina-1 e beta-actina, juntamente com o marcador de vesículas CD9, enquanto a expressão de CD81 é baixa ou ausente com a ausência de existência de APO-A-1 nas vesículas extracelulares plasmáticas. Pesquisadores, portanto, tendo em mente que a etapa 2.2, a preparação e a digestão das amostras de tecido devem ser feitas suficientemente. Caso contrário, o número de vesículas extracelulares extraídas dos tecidos é limitado.O marcador marcado coloração fluorescente das vesículas extracelulares pode ser injetado na boca para tratar a fase que está ligada à função potencial.

isolation-analysis-traceable-functionalized-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vesículas extracelulares presentes no sangue têm sido sugeridas como novos biomarcadores para várias doenças. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes microvesículas derivadas da membrana plasmática de amostras de sangue periférico e sua posterior análise por citometria de fluxo convencional e Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

Este é um protocolo para isolar vesículas extracelulares do tecido (EVs) do fígado. O protocolo descreve um processo da dois-etapa que envolve a perfusão do colagenase seguida pelo ultracentlee diferencial para isolar EVS do tecido do fígado.

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Neste protocolo, descrevemos o fluxo de trabalho completo para isolamento rápido das vesículas extracelulares de sangue total humano e caracterização de marcadores específicos pela análise de controle de nanopartículas baseada em fluorescência. Os resultados apresentados mostram um elevado nível de reprodutibilidade e podem ser ajustados para sobrenadantes de cultura de células.

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para isolar pequenas vesículas extracelulares (EVs) de tecidos, incluindo amostras de cérebro e tumor. Este método oferece uma técnica reprodutível para extrair EVs do tecido sólido para mais análises a jusante.

Extração de vesículas extracelulares de todo tecido

O presente relatório destaca os requisitos cronológicos para o isolamento da vesícula extracelular (EV) de microglia ou macrófagos sanguíneos. Os EVs derivados de microglia foram avaliados como reguladores do crescimento do neurite, enquanto os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram estudados no controle da invasão celular C6 glioma em ensaios in vitro. O objetivo é entender melhor essas funções de EV como mediadores imunológicos em microambientes específicos.

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

O protocolo aqui demonstra que as vesículas extracelulares podem ser adequadamente separadas de meios de cultura celular condicionados usando cromatografia de exclusão de tamanho.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada

A última geração de ferramentas de caracterização de EV é capaz de uma única análise de EV em vários parâmetros simultaneamente. A citometria de nanofluxo mede todas as partículas biológicas maiores que 45 nm sem marcação e identifica características específicas de subpopulações por uma variedade de técnicas de marcação fluorescente.

Caracterização da Proteína Transmembrana da Vesícula Extracelular Única por Citometria de Nanofluxo

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.

Isolamento Químico por Afinidade de Vesículas Extracelulares de Biofluidos para Análise Proteômica e Fosfoproteômica

Este artigo descreve uma metodologia para o isolamento, caracterização e quantificação de vesículas extracelulares derivadas de plasma humano (EV) e apresenta um fluxo de trabalho para análise sem marcação do proteoma EV usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).

Isolamento, caracterização e análise proteômica de vesículas extracelulares derivadas de plasma para descoberta de biomarcadores cardiovasculares

Aqui, demonstramos o método de caracterização de vesículas extracelulares (EVs) coletadas de fluidos biológicos, como lágrimas e saliva, de seres humanos. O scanner usado neste método é capaz de detectar o fenótipo, tamanho e contagem total de partículas de EVs a partir de 1 μL da amostra.

Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Aprenda a isolar vesículas extracelulares de plasma e tecidos sólidos com alta pureza e rendimento. Este método permite analisar antígenos de superfície e cargas proteicas por citometria de fluxo e Western blot.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Explorar mais vídeos