Name: Detecção e quantificação de nanotubos de tunelamento usando imagens de visualização de volume 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Aprenda a detectar e quantificar nanotubos de tunelamento usando visualização de volume 3D a partir de imagens confocal de z-stack. Este método manual oferece precisão superior para estudar comunicação intercelular em doenças neurodegenerativas e câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.K.V e A.R agradecem à Academia Manipal de Ensino Superior pela bolsa TMA Pai. Agradecemos ao Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia da Índia pelo SERB-SRG (#SRG/2021/001315), bem como ao Conselho Indiano de Pesquisa Médica da Índia (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) e ao fundo Intramural da Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Índia. Agradecemos à instalação confocal do JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Índia) e à B. Suma pela microscopia confocal no JNCASR.

NOTA: As células SH-SY5Y cultivadas em meio DMEM/F-12 foram diferenciadas com ácido retinóico de 10 μM por 7 dias e tratadas com oligômeros de 1 μM oAβ por 2 h a 37 °C (5% de CO2). Após o tratamento, as células foram fixadas com solução fixadora de Karnovsky e duplamente imunocoradas com anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e faloidina ligadora de F-actina. Posteriormente, imagens confocais de pilha z foram obtidas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Os TNTs foram quantificados por contagem manual e distinguidos de outras neurites/saliências celulares por meio da construção de imagens de visualização de volume 3D e identificação das estruturas a partir de sua característica de pairar entre duas células sem tocar o substrato (Figura 1).
1. Cultura e diferenciação celular
<ol><li>Cultura das células neuronais SH-SY5Y em meio DMEM/F12 (Ham) 1:1 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de mistura de penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN). Semeia as células em um prato de imagem de 35 mm com um poço de 14 mm composto por uma tampa # 1.5 no centro do prato preso ao fundo. Semeia as células na placa de imagem a uma concentração de 12.000 células/cm2 e realize os experimentos com 60% a 70% de confluência.</li>
	<li>Diferenciar parcialmente as células com ácido retinóico (AR) de 10 μM de uma solução-mãe de 100 mM (5 mg de AR em 15 mL de dimetilsulfóxido [DMSO]). Em seguida, incubar as células por 7 dias a 37 °C (5% de CO 2) para diferenciação com mudança de meio a cada2 dias. NOTA: Tenha cuidado ao manter a confluência (60%-70%) das células (células indiferenciadas e parcialmente diferenciadas). A densidade celular pode influenciar a formação de TNTs entre as células.</li>
</ol>2. Preparação de oligômeros de βamiloide 1-42 (oAβ) para tratar células neuronais
<ol><li>Dissolver Aβ 1-42 (1 mg) em 200 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol e dividir a solução em 20 alíquotas, cada uma contendo 0,05 mg de péptidos. Liofilizar e armazenar as alíquotas a -20 °C para utilização posterior.</li>
	<li>Preparar a solução-mãe (5 mM) do Aβ 1-42 liofilizado em DMSO adicionando 2,2 μL de DMSO a 0,05 mg de péptido liofilizado. Para dissolver cuidadosamente os peptídeos, vortex a solução e sonicate por 2 min em um sonicator de banho de água.</li>
	<li>Diluir a solução-mãe até uma concentração de 100 μM em DMEM, pH 7,4 e vórtice para converter os peptídeos em monômeros, seguida de incubação a 4 °C por 24 h para obtenção de oligômeros de Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22. </li>
	<li>Caracterizar oAβ antes dos experimentos como relatado anteriormente21,22 por microscopia eletrônica de transmissão.</li>
	<li>Trate as células SH-SY5Y parcialmente diferenciadas com 1 μM oAβ. Remova o meio antes dos tratamentos e adicione DMEM fresco sem FBS. Após a mudança do meio, adicionar oAβ previamente preparado (100 μM) ao meio até uma concentração final de 1 μM. Incubar as células com 1 μM oAβ durante 2 h a 37 °C (5% CO2). Inclua um controle negativo na forma de células não tratadas.</li>
</ol>3. Imunocoloração de F-actina e PAK1 ativada para caracterização de TNTs
<ol><li>Realize imunocoloração diferencial usando o anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e faloidina falotoxina ligadora de F-actina.</li>
	<li>Lavar as células de controle e as células tratadas com oAβ com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 2 x 2 min antes da fixação. Preparar a solução fixadora de Karnovsky utilizando fixador de formalina a 2% e glutaraldeído a 2,5% dissolvido em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2. Em seguida, fixe as células no prato de imagem adicionando a solução fixadora de Karnovsky (apenas o suficiente para cobrir as células) por 45 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as células fixas 2 x 2 min usando tampão de incubação. Preparar o tampão de incubação (20x) dissolvendo 0,1 g de saponina em 5 mL de FBS e diluir para 1x adicionando 95 mL de 1x PBS.</li>
	<li>Após a fixação, adicionar o primeiro anticorpo contra o fofo-PAK1 a uma diluição de 1:250 no tampão de incubação e incubar durante a noite a 4 °C numa câmara húmida escura.</li>
	<li>No dia seguinte, após 24 h de incubação, lavar as células 2 x 2 min com o tampão de incubação; em seguida, adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 (diluição 1:1.000) e à faloidina 555 (diluição 1:1.000). Incubar as células na câmara escura húmida durante 1,5 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a incubação, lave as células 2 x 2 min com tampão de incubação. Coloração do núcleo adicionando 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em uma diluição de 1:2.000 e incubar por 5 min a 10 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Prepare o meio de montagem DABCO usando 25 mg de DABCO em 90% de glicerol e 10% 1x PBS. Para dissolver corretamente, ajuste o pH para 8,6 usando o grau espectrofotométrico, dilua o HCl (diluído 1:20 com água) e mantenha a solução em um balancim para mistura.</li>
	<li>Como agente antibranqueador, adicione o meio de montagem DABCO diretamente no prato de imagem que contém a tampa na parte inferior. Aguarde pelo menos 1-2 h e prossiga diretamente para a realização de imagens confocais. NOTA: Não são necessários adesivos para fixar as tampas.</li>
</ol>4. Imunocoloração de F-actina e tubulina β-III para distinguir TNTs de neurites
<ol><li>Realizar imunocoloração diferencial com anticorpo de tubulina β-III e falotoxina faloidina ligadora de F-actina.</li>
	<li>Lave as células tratadas com oAβ 2x com 1x PBS antes de adicionar a solução fixadora de Karnovsky. Incubar as células por 45 min à temperatura ambiente e lavar as células 2 x 2 min com tampão de incubação.</li>
	<li>Após a fixação, adicionar o anticorpo contra a tubulina β-III (TUBb3) a uma diluição de 1:250 no tampão de incubação e incubar a 4 °C durante a noite na câmara húmida escura.</li>
	<li>No dia seguinte, lave as células com tampão de incubação (2 x 2 min) e adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 (diluição 1:1.000) e à faloidina 555 (diluição 1:1.000) juntos ao mesmo prato. Em seguida, incubar as células por 1,5 h à temperatura ambiente na câmara escura e úmida.</li>
	<li>Lave as células 2x com tampão de incubação e adicione DAPI de coloração nuclear em uma diluição de 1:2.000 por 5-10 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Adicione o agente antibranqueamento DABCO no meio de montagem, conforme mencionado acima, e aguarde 2 horas antes da imagem.</li>
</ol>5. Imagem com microscopia confocal
<ol><li>Para identificar TNTs, capture imagens z-stack de células imunocoradas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Tire as imagens usando a objetiva DIC de óleo 40x/1.40 com DAPI, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e conjuntos de filtros de tetrametilrodamina (TRITC).</li>
	<li>Primeiro, selecione os canais clicando nos lasers necessários sequencialmente nas janelas Faixa 1, Faixa 2 e Faixa 3 no software confocal. Clique na opção T-PMT abaixo da janela Faixa 1 para obter as imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) com canais de fluorescência. NOTA: As imagens DIC são capturadas por um detector diferente rotulado como T-PMT.</li>
	<li>Selecione a guia de aquisição do software, clique na guia Z-stack e aguarde a abertura de uma janela. Em seguida, clique em varredura ao vivo para focar as células na parte inferior do prato. Selecione essa imagem focada como a primeira pilha. Em seguida, concentre-se para ver a parte superior da célula e selecione-a como a última pilha. Pare a varredura ao vivo e clique no número ao lado da guia ideal para corrigir o tamanho da etapa das pilhas. O tamanho da etapa determina o número de fatias e os intervalos com base na espessura das células. NOTA: O tamanho da etapa será selecionado com base na amostragem de Nyquist para obter fatias suficientes e garantir que não haja lacunas entre as duas pilhas. A amostragem de Nyquist é determinada com base na objetiva e nos comprimentos de onda das luzes23.</li>
	<li>Tire imagens sequenciais de três canais de DAPI, FITC e TRITC com lasers de 405 nm, 488 nm e 561 nm e capture com um tempo de permanência de pixels de 1,02 μs. Capture imagens no canal DIC com canais de fluorescência para observar o limite celular.</li>
	<li>Capture uma pilha de imagens com as dimensões de x: 224,92 μm e y: 224,92 μm, com cada pixel de 220 nm2 de tamanho e z-scaling de 415 nm.</li>
	<li>Tire imagens capturando várias pilhas z (15-22 pilhas) da parte inferior para a parte superior das células. Adquira pelo menos 10 imagens do campo aleatório do prato de cultura para obter um total de ~ 200-300 células.</li>
	<li>Analise as imagens capturadas off-line para identificar os TNTs por análise de visualização de volume 3D</li>
</ol>6. Análise de imagens confocais z-stack para identificar e quantificar TNTs
<ol><li>Abra as imagens confocais salvas no formato de dados .czi no software Fiji para análise.</li>
	<li>Selecione a opção Hyperstack para ver cada z-stack e canal da imagem. Procure as hiperpilhas das pilhas z e canais, que são abertos em uma única janela, como mostra a Figura 2. Role as barras de rolagem do canal (indicado pelas setas vermelha e verde) e z-stack (indicado pelas setas azuis) para selecionar a pilha exata de um determinado canal de interesse. NOTA: Em células fixas, como os TNTs pairando ou os conduítes de membrana permanecem acima da superfície, as estruturas não são visíveis nas partes inferiores das pilhas z. No entanto, em células fixas, os neurites encontram-se na superfície e são detectáveis nas partes inferiores das pilhas z (z = 0 a 2). Consulte a Figura 2 para as etapas de identificação.</li>
	<li>Como mostrado na Figura 2, selecione o canal manchado de F actina (indicado por setas vermelhas) primeiro rolando a barra de canais. Em seguida, role manualmente as pilhas z (indicadas por setas azuis) para ver cada pilha uma a uma. Identifique as estruturas coradas com actina F que parecem estar conectando células, são visíveis nas partes inferiores das pilhas z e estão próximas à superfície do prato de imagem (z = 2) como neurites (indicadas por setas brancas). NOTA: A maioria dos neurites é fácil de identificar, pois aparecem como saliências estendidas (indicadas por setas rosas).</li>
	<li>Identifique os TNTs, os conduítes F-actin-positivos, pairando célula a célula, rolando as pilhas z em direção ao topo (de z = 4 na Figura 2; indicado por setas amarelas). Procure neurites perto das partes inferiores das pilhas z em direção à superfície e observe que elas começam a desaparecer com a rolagem das pilhas z em direção ao topo (em z = 6 na Figura 2; neurites não são claramente visíveis).</li>
	<li>Identifique TNTs fosfo-PAK1-positivos de forma semelhante aos TNTs F-actin-positivos analisando a natureza pairando dos conduítes das pilhas z. Como a coloração fosfo-PAK1 é mais fraca do que a coloração F-actina, procure TNTs corados com fosfo-PAK1 em z = 4 (fracamente visível) e em z = 6 (proeminente).</li>
	<li>Além disso, observe as imagens DIC para verificar se as estruturas TNT coradas com F-actina e fosfo-PAK1 são condutos de membrana entre as células (Figura 3). Além disso, mescle os canais F-actina (vermelho) e fosfo-PAK1 (verde) para verificar se os TNTs identificados são estruturas cocoradas de F-actina e fosfo-PAK1 (Figura 3).</li>
	<li>Para quantificar os TNTs, conte o número total de células e os TNTs identificados manualmente e represente os números como porcentagens.</li>
	<li>Para distinguir TNTs positivos para F-actina e conduítes flutuantes β-III positivos para TNT (TUBb3) de imagens de pilha z, mescle os canais F-actina (vermelho) e TUBb3 (verde) (Figura 4). Em seguida, analise as pilhas z das imagens mescladas.<ol><li>Procure TNTs exclusivamente corados com F-actina que sejam fracamente visíveis em z = 3 e proeminentes em z = 6 e z = 9 (setas amarelas). Da mesma forma, identifique os conduítes flutuantes duplo-positivos para F-actina e β-III (TUBb3), semelhantes a TNT, em z = 6 e z = 9 (setas ciano). Identifique outras saliências coradas de tubulina F-actina e β-III, sem pairar, das partes inferiores das pilhas z (setas brancas).</li>
	</ol></li>
	<li>Meça o diâmetro dos TNTs usando a ferramenta de linha em Fiji. Verifique a escala de medição clicando em Analisar | Defina Escala para que a "distância em pixels" seja definida automaticamente a partir das imagens .czi. Meça os diâmetros dos TNTs no plano xy. NOTA: A maioria dos diâmetros está entre 1 pixel e 4 pixels (ou seja, 220-880 nm); cada pixel tem 220 nm. Consulte a Figura 5 para um resumo do protocolo para a análise de imagens confocais z-stack.</li>
</ol>7.3D reconstrução de imagens z-stack para caracterizar TNTs
<ol><li>Use o plug-in visualizador de volume em Fiji, que permite o reconhecimento 3D e a visualização 3D habilitada para limite (Figura 6).</li>
	<li>Divida as imagens z-stack em canais individuais. Em seguida, corte as imagens z-stack de canal único (canal F-actina) para usar a visualização de reconstrução 3D para destacar um ou dois TNTs ou neurites de cada vez. Habilite o plug-in de visualização de volume para visualizar as visualizações xy, yz e xz.</li>
	<li>Fixe um único TNT ou neurito no plano xy (setas brancas representam neurites na Figura 6A; setas amarelas representam TNTs na Figura 6B) e marque as seções transversais dos eixos xz (vermelho) e yz (verde). Observe os neurites na parte inferior do plano xz nos planos xz e yz (setas brancas, Figura 6A) e os TNTs nas pilhas z superiores (setas amarelas, Figura 6B).</li>
	<li>Selecione o TNT ou neurito individual para reconstruir a visualização do volume 3D no plano xz (Figura 6C, D). Na reconstrução 3D, observe os neurites na parte inferior do plano z (setas brancas, Figura 6C) e os TNTs aparecendo como estruturas pairando conectando duas células sem tocar no plano z inferior (setas amarelas, Figura 6D).</li>
</ol>

<ol><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li>
<li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484(2018).</li>
<li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789(2021).</li>
<li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984(2017).</li>
<li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798(2021).</li>
<li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+communication+by+tunneling+nanotubes%3A+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li>
<li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li>
<li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090(2018).</li>
<li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes%3A+Diversity+in+morphology+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934(2014).</li>
<li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research%3A+How+far+from+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306(2021).</li>
<li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes%3A+Reshaping+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li>
<li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246(2021).</li>
<li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li>
<li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+block+of+tunneling+nanotube+%28TNT%29+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li>
<li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547(2017).</li>
<li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes%3A+Implications+in+disease+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36(2021).</li>
<li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li>
<li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li>
<li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429(2012).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li>
<li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li>
<li>Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+Of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook Of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).</li>
<li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li>
<li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li>
<li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li>
<li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711(2021).</li>
<li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Vários pesquisadores nas últimas 2 décadas vêm tentando entender e caracterizar a estrutura dos TNTs18. A falta de marcadores específicos dificulta o progresso, e há uma demanda crescente por um método conveniente e padronizado que possa ser usado para identificar, caracterizar e quantificar TNTs. Os TNTs são definidos como conduítes de membrana à base de actina F que pairam entre duas células. Estudos têm demonstrado que neurites em desenvolvimento β-tubulina-positivas, fechadas, pairam entre dua...

Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são condutos de membrana à base de actina F, principalmente abertos, e desempenham um papel vital na transferência intercelular de carga e organelas1. A característica única dos TNTs é que eles conectam células vizinhas sem qualquer contato com o substrato; têm mais de 10-300 μm de comprimento e os seus diâmetros variam entre 50 nm a 1 μm 2,3. Os TNTs são estruturas transitórias e sua vida útil dura entre alguns minutos a várias horas. Os TNTs foram demonstrados pela primeira vez em células neuronaisPC12 1; posteriormente, numerosos estudos mostraram sua existência em vários tipos celulares in vitro e in vivo 4,5. Diversos estudos têm revelado a significância patológica dos TNTs em diversos modelos de doenças, como doenças neurodegenerativas, câncer e infecções virais 6,7,8.
As heterogeneidades estruturais dos TNTs têm sido demonstradas por diversos estudos em diversos sistemas celulares9. As diferenças são baseadas na composição do citoesqueleto, no mecanismo de formação e nos tipos de carga transferidos10. Primeiramente, considera-se que a continuidade da membrana aberta e positiva para F-actina que paira entre duas células vizinhas e transfere organelas consiste em TNTs11. No entanto, a falta de clareza ou diversidade observada na formação de TNTs aumenta a dificuldade no desenvolvimento de marcadores específicos de TNT. Assim, é difícil identificar estruturas de TNT por métodos convencionais de detecção e distinguir nanotubos de membrana em termos de saliências abertas e fechadas12. No entanto, a característica dos TNTs pairarem como saliências de membrana de actina F entre duas células é relativamente mais fácil e mais viável de identificar usando técnicas de imagem convencionais. Outras saliências celulares à base de actina, como filópodes e filópodes dorsais, não podem pairar entre duas células distantes, particularmente quando as células são fixas. É importante ressaltar que neurites em desenvolvimento fechadas, eletricamente acoplados e são frequentemente denominados estruturas semelhantes ao TNT13.
Sabe-se que a F-actina desempenha um papel importante na formação de TNT, e vários estudos têm demonstrado que o inibidor de F-actina citocalasina D inibe a formação de TNTs14,15. Em contraste, os inibidores dos microtúbulos não têm qualquer efeito sobre a formação de TNT16. Nas últimas 2 décadas, houve vários relatos sobre o papel significativo que os TNTs desempenham na disseminação da patologia e da resistência e terapia tumoral17. Portanto, há uma demanda interminável por melhores técnicas para caracterização do TNT.
A falta de marcadores específicos de TNTs e a diversidade na morfologia e composição citoesquelética dificultam o desenvolvimento de um método único de caracterização. Alguns estudos têm utilizado técnicas automatizadas de detecção de imagens e quantificação de TNT18,19. No entanto, existem várias vantagens do atual método de análise manual de volume 3D sobre a análise automática de imagens para a detecção e quantificação de TNTs. Muitas vezes, os olhos humanos treinados podem detectar essas nanoestruturas pairando mais facilmente do que um método automatizado de detecção de imagem. Além disso, os métodos de detecção automática podem ser difíceis de implementar em laboratórios sem experiência em algoritmos. O presente método poderia ser amplamente adotado pelos pesquisadores devido à sua precisão e reprodutibilidade.
Em um estudo recente, mostramos que a oAβ promove a biogênese de TNTs em células neuronais por meio de um mecanismo de endocitose mediado por PAK1, dependente deactina12. TNTs induzidos por oAβ também expressam PAK1 ativado (ou fosfo-PAK1). Desenvolvemos um método de reconstrução de imagem de visão de volume 3D para distinguir TNTs imunocorados por oAβ, F-actina e fosfo-PAK1. β-III tubulina positiva, neurites em desenvolvimento muitas vezes se assemelham a estruturas flutuantes semelhantes a TNT20. Assim, distinguimos ainda mais os TNTs à base de F-actina dos neurites positivos para tubulina β-III e de outras saliências semelhantes ao TNT. Imagens de visualização de volume 3D têm sido usadas para identificar TNTs com base em suas características de pairar sobre o substrato e permanecer conectado entre duas células vizinhas. Este trabalho descreve a identificação e detecção de condutos de membrana contendo actina ou TNTs usando imagens confocais z-stack e, finalmente, quantificação manual das estruturas identificadas a partir de imagens de reconstrução de visualização de volume 3D. O método apresentado não pode distinguir TNTs próprios abertos de estruturas semelhantes a TNT fechadas; este método ajuda a identificar TNTs em cultura de células 2D in vitro em um substrato plano. No entanto, o método é fácil de implementar e reproduzir e pode ser amplamente utilizado para a quantificação precisa de apenas TNTs à base de actina e para distingui-los de neurites e estruturas β-tubulina positivas semelhantes a TNT.

<table><tbody><tr><td>Prato de 35 mm com tamanho de poço de 14 mm feito de lamínula #1.5</td><td>Cellvis</td><td>D35-14-1.5-N</td><td>Prato de imagem usado para semear células para experimentos de coloração</td></tr><tr><td>A&beta; (1-42) 1 mg</td><td>AnaSpec</td><td>#64129</td><td>Oligômeros de beta amilóide para tratar as células</td></tr><tr><td>Farinha Alexa 488 Cabra Anti-coelho IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>Anticorpo secundário para fosfo-PAK1</td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica</td><td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td><td>51025411</td><td>Fornecer condições ascéticas durante a cultura de células</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td><td>51026556</td><td>Para células em crescimento à temperatura corporal ou próxima à temperatura corporal</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>ZEISS (Carl Zeiss)</td><td>LSM 880</td><td>Capaz de gerar imagens tridimensionais de grandes espécimes em super-resolução</td></tr><tr><td>DABCO [1,4-Diazobiciclo-(2,2,2) octanas]</td><td>Merck</td><td>8034560100</td><td>Reagente anti-branqueamento</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>Neuclear corante</td></tr><tr><td>Mídia DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Usado para a preparação de 100uM de A&beta; (1-42)</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM/F12 (mistura 1:1 de DMEM e presunto» s F12)</td> <td>Gibco</td><td>12500062</td><td>Meios de cultura para SH-SY5Y</td></tr><tr><td>DMSO (sulfeto de dimetila) Grau de cultura de células</td><td>Cryopur</td><td>CP-100</td><td>Grau de cultura de células usado como agente de dissolução para ácido retinóico</td></tr><tr><td>DMSO (sulfeto de dimetila) Grau molecular</td><td>Himedia</td><td>MB058</td><td>Usado como um dos agentes de dissolução para o liofilizado A&beta; (1-42)</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>&nbsp; Suplemento principal para meios de cultura (origem americana)</td></tr><tr><td>Fixador de formalina (tamponado neutro 10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td>Componente na solução fixadora de Karnovsky</td></tr><tr><td>Glutaraldeído (Grau I, 25% em H2O)</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>Componente na solução fixadora de Karnovsky</td></tr><tr><td>Solução HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)</td><td>TCI</td><td>H024</td><td>Usado para dissolver A&beta; (1-42) Software</td></tr><tr>de<td>processamento/análise de imagem de 1 mg: FIJI (ImageJ)</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>Usado para processar/analisar as imagens e diferenciar os TNTs dos neurites usando seu plug-in chamado "visualizador de volume".</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Cristo, Alfa</td><td>2,4 LDmais</td><td>0,05 mg alíquotas de A&beta; (1-42) pode ser armazenado em -20 &deg; C após liofilização apenas</td></tr><tr><td>Mistura de penicilina-estreptomicina-neomicina</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>15640055</td><td>Mistura de antibióticos</td></tr><tr><td>Faloidina-iFlor 555</td><td>Abcam</td><td>ab176756</td><td>Coloração de ligação à F-actina</td></tr><tr><td>Fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) [Coelho]</td> <td>CST</td> <td># 2601</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal para tubulina beta 3 (TUBb3)</td> <td>Clone de</td> <td>nuvemPAE711Hu01</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Reagente diferenciador</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Merck</td><td>8047-15-2</td><td>Detergente usado no tampão de incubação em imunocoloração</td></tr><tr><td>Sonicator em banho-maria (Quart, Aquecedor de válvula de drenagem)</td> <td>Limpador ultrassônico</td><td>3,0 L / 3,2</td><td>Sonicator usado para dissolver A&beta; (1-42) estoque, após DMSO adicionado a ele durante a preparação de 100 &micro; M A&beta; (1-42)</td></tr><tr><td>Software de microscopia</td><td>ZEN ZEISS (Carl Zeiss)</td><td></td><td>Software de imagem para aquisição de imagens de microscopia confocal com automação inteligente</td></tr></tbody></table>

detecção e quantificação de nanotubos de tunelamento usando imagens de visualização de volume 3d

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Descobertas recentes revelaram que as células realizam transferência intercelular direta, de longo alcance, através de conduítes de membrana de actina em nanoescala, ou seja, "nanotubos de tunelamento" (TNTs). Os TNTs são definidos como extensões de membrana abertas e circundadas por bicamadas lipídicas que medeiam a continuidade entre células vizinhas de diâmetros que variam entre 50 nm e 1 μm. Os TNTs foram demonstrados inicialmente em células neuronais, mas estudos sucessivos revelaram a existência de TNTs em vários tipos celulares e doenças, como doenças neurodegenerativas, infecções virais e câncer. Vários estudos se referiram a nanoestruturas de membrana fechadas e eletricamente acopladas entre células vizinhas como TNTs ou estruturas semelhantes a TNT.
A elucidação da ultraestrutura em termos de continuidade da membrana no desfecho é tecnicamente desafiadora. Além disso, estudos sobre comunicação célula-célula são desafiadores em termos de caracterização de TNTs usando métodos convencionais devido à falta de marcadores específicos. Os TNTs são definidos principalmente como saliências de membrana abertas à base de F-actina. No entanto, uma grande limitação é que a F-actina está presente em todos os tipos de saliências, tornando desafiador diferenciar TNTs de outras saliências. Uma das características notáveis dos TNTs à base de actina F é que essas estruturas pairam entre duas células sem tocar o substrato. Portanto, TNTs distintos corados com F-actina podem ser convenientemente distinguidos de outras saliências, como filópodes e neurites, com base em seu pairar entre as células.
Recentemente, mostramos que a internalização da amilóide-βoligomérica 1-42 (oAβ) via endocitose dependente de actina estimula a quinase-1 ativada por p21 ativada (PAK1), que medeia a formação de TNTs contendo F-actina coexpressos com fosfo-PAK1 entre células neuronais SH-SY5Y. Este protocolo descreve um método de análise de volume 3D para identificar e caracterizar TNTs a partir das imagens capturadas de z-stack de protuberâncias de membrana imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1 em células neuronais tratadas com oAβ. Além disso, os TNTs distinguem-se do desenvolvimento de neurites e excrescências neuronais com base em condutos de membrana imunocorados de tubulina F-actina e β-III.

Aqui, identificamos e caracterizamos TNTs induzidos por oAβ em células neuronais SH-SY5Y através da construção de visualizações de volume 3D a partir de imagens confocais z-stack (Figura 1). As células foram duplamente imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1. Imagens confocais de z-stack de células imunocoradas foram analisadas para identificar TNTs (Figura 2). Além disso, as imagens DIC foram analisadas para verificar se as estruturas TNT coradas com F-actina e ...

Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são principalmente nanotubos de membrana de actina F abertos que conectam células vizinhas, facilitando a comunicação intercelular. A característica notável que distingue os TNTs de outras saliências celulares é a natureza flutuante dos nanotubos entre as células. Aqui, caracterizamos os TNTs construindo uma visão de volume 3D de imagens confocais z-stack.

Detecção e quantificação de nanotubos de tunelamento usando imagens de visualização de volume 3D

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

A falta de marcadores específicos de nanotubos de tunelamento restringe o progresso no campo e há uma demanda crescente por um método para identificar, caracterizar e quantificar nanotubos de tunelamento. Os métodos de detecção automática são difíceis de implementar sem a experiência para desenvolver um algoritmo e / ou alterar o algoritmo existente, mas nosso método manual é fácil de implementar com melhor precisão. A transferência intercelular de longo alcance através de nanotubos de tunelamento é implementada de várias maneiras em vários modelos de doenças, incluindo patologia neurodegenerativa, disseminação viral e câncer.Assim, estudos sobre nanotubos de tunelamento para entender seu papel na patogênese são importantes. É possível que os nanotubos de tunelamento se quebrem durante o processo de coloração. Evite usar folhas de cobertura e montagem nas lâminas, usando pratos de imagem de fundo de vidro.O protocolo de fixação modificado ajuda a manter os nanotubos de tunelamento intactos. Demonstrando o procedimento estará Deepak KV, um estudante de doutorado do laboratório de Sangeeta NAF. Para começar, lave as células de controle e oligoméricas tratadas com A-beta duas vezes com PBS por dois minutos antes da fixação.Preparar a solução fixadora de Karnovsky usando fixador de formalina a 2% e glutaraldeído a 2,5% dissolvido em tampão fosfato molar a 0,1 de pH 7,2. Em seguida, fixe as células no prato de imagem adicionando a solução fixadora de Karnovsky por 45 minutos à temperatura ambiente. Preparar o tampão de incubação dissolvendo 0,1 grama de saponina em cinco mililitros de FBS e diluído adicionando 95 mililitros de PBS.Em seguida, lave as células fixas duas vezes usando tampão de incubação por dois minutos. Após a fixação, adicione o primeiro anticorpo contra a fosfo-PAK1, adicione uma diluição de um a 250 no tampão de incubação e incube durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara escura e úmida. No dia seguinte, após 24 horas de incubação, lave as células duas vezes com o tampão de incubação por dois minutos.Em seguida, adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 e à Faloidina 555. Incubar as células na câmara escura e húmida durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células duas vezes com tampão de incubação por dois minutos.Coloração do núcleo adicionando DAPI em uma diluição de um a 2000 e incubar por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Prepare o meio de montagem DABCO usando 25 miligramas de DABCO em 90% de glicerol e 10% PBS. Para dissolver corretamente, ajuste o pH para 8,6 usando ácido clorídrico diluído de grau espectrofotométrico e mantenha a solução em um balancim para mistura.Como agente antibranqueador, adicione o meio de montagem DABCO diretamente no prato de imagem que contém a tampa na parte inferior. Aguarde pelo menos uma a duas horas e prossiga diretamente para realizar imagens confocais. Para identificar nanotubos de tunelamento, capture imagens de pilha Z de células imunocoradas usando um microscópio confocal de varredura a laser, primeiro selecionando os canais e clicando nos lasers necessários sequencialmente nas janelas track one, track two e track three no software confocal.Clique na opção TPMT abaixo da janela de faixa um para obter as imagens de contraste de interferência diferencial com canais de fluorescência. Selecione a guia Aquisição do software, clique na guia Z-stack e aguarde a abertura de uma janela. Em seguida, clique em Live Scan para focar as células na parte inferior do prato.Selecione essa imagem focada como a primeira pilha e, em seguida, foque para cima para ver a parte superior da célula e selecione-a como a última pilha. Pare a varredura ao vivo e clique no número ao lado da guia Ótimo para corrigir o tamanho da etapa das pilhas, que determina o número de fatias e os intervalos com base na espessura das células. Tire imagens sequenciais de três canais de DAPI, FITC e TRITC com lasers de 405 nanômetros, 488 nanômetros e 561 nanômetros e capture com um tempo de permanência de pixels de 1,02 microssegundo.Capture imagens no canal DIC com canais de fluorescência para observar o limite celular. Abra as imagens confocais salvas no formato de dados czi no software Fiji para análise. Selecione a opção Hyperstack para ver cada Z-stack e canal da imagem.Role o canal e as barras de rolagem Z-stack para selecionar a pilha exata de um determinado canal de interesse. Em seguida, selecione o canal manchado de actina F primeiro rolando a barra de canais e role manualmente as pilhas Z para ver cada pilha uma a uma. Identifique as estruturas coradas com actina F que parecem estar conectando células que são visíveis nas partes inferiores das pilhas Z e estão próximas à superfície do prato de imagem com Z igual a dois como neurites.Identifique os nanotubos de tunelamento, a célula de pairar positiva para os condutos de célula positiva F, rolando as pilhas Z em direção ao topo de Z igual a quatro. Procure neurites perto das partes inferiores das pilhas Z em direção à superfície e observe que elas começam a desaparecer com a rolagem das pilhas Z em direção ao topo em Z igual a seis. Identifique nanotubos de tunelamento positivos para fosfo-PAK1 de forma semelhante aos nanotubos de tunelamento positivos para F-actina, analisando a natureza flutuante dos conduítes das pilhas Z.Como a coloração fosfo-PAK1 é mais fraca do que a coloração F-actina, procure nanotubos de tunelamento corados fosfo-PAK1 em Z igual a quatro e em Z igual a seis. Além disso, observe as imagens DIC para verificar se as estruturas de nanotubos de tunelamento coradas com F-actina e fosfo-PAK1 são condutos de membrana entre as células. Além disso, mescle os canais F-actina e fosfo-PAK1 para verificar se os nanotubos de tunelamento identificados são estruturas cocoradas de F-actina e fosfo-PAK1.Para quantificar os nanotubos de tunelamento, conte o número total de células e os nanotubos de tunelamento identificados manualmente e represente os números como porcentagens. Para distinguir nanotubos de tunelamento positivo de tubulina F e beta III, como conduítes pairando de imagens de pilha Z, mescle os canais de tubulina F-actina e beta III e, em seguida, analise as pilhas Z das imagens mescladas. Procure nanotubos de tunelamento exclusivamente corados com actina que sejam fracamente visíveis em Z igual a três e proeminentes em Z igual a seis e Z igual a nove.Da mesma forma, identifique F-actina e beta III tubulina. nanotubos de tunelamento duplo-positivos como conduítes pairando em Z igual a seis e Z igual a nove. Identifique outras saliências não pairantes coradas de F-actina e beta III das partes inferiores das pilhas Z.Meça o diâmetro dos nanotubos de tunelamento usando a ferramenta Line em Fiji. Verifique a escala de medição clicando em Analisar e, em seguida, defina a escala para que a distância em pixels seja definida automaticamente a partir das imagens czi. Meça os diâmetros dos nanotubos de tunelamento no plano XY.Usando o plugin Volume Viewer em Fiji, que permite o refatiamento 3D e a visualização 3D habilitada para limite, divida as imagens Z-stack em canais individuais. Em seguida, corte as imagens de pilha Z de canal único para usar a visualização de reconstrução 3D para destacar um ou dois nanotubos ou neurites de tunelamento de cada vez. Fixe um único nanotubo de tunelamento ou neurito no plano XY e marque as seções transversais de acesso XZ e YZ.Observe os neurites na parte inferior do plano XZ, nos planos XZ e YZ, e os nanotubos de tunelamento nas pilhas Z superiores. Selecione os nanotubos ou neuritos de tunelamento individuais para reconstruir a visualização do volume 3D no plano XZ. Na reconstrução 3D, observe os neurites na parte inferior do plano Z e os nanotubos de tunelamento aparecendo como estruturas pairando conectando duas células sem tocar no plano Z inferior.Imagens confocais de Pilha Z de células imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1 foram analisadas para identificar nanotubos de tunelamento. Além disso, as imagens DIC foram analisadas para verificar se as estruturas dos nanotubos de tunelamento coradas com F-actina e fosfo-PAK1 eram condutos de membrana entre as células. As células foram duplamente imunocoradas com F-actina e beta III tubulina e os condutos de membrana duplamente positivos de nanotubos de tunelamento e de encapsulamento de nanotubos F-actina e beta III tubulina foram distinguidos de apenas nanotubos de tunelamento positivos para F-actina.Os nanotubos de tunelamento co-expressos com fosfo-PAK1 e F-actina foram distinguidos das saliências celulares de outros neuritos através da construção de imagens de visualização de volume 3D com base em sua característica de pairar entre duas células sem tocar o substrato. O uso de agente fixador direito é importante, pois a fixação imperfeita da amostra pode levar à rápida degradação proteolítica das proteínas-alvo e a uma redução na imunorreatividade específica.

detection-quantification-tunneling-nanotubes-using-3d-volume-view

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Usamos síncrotron tomografia de raios-X no Laboratório Europeu de Radiação Síncrotron (ESRF) para não-invasiva produzir conjuntos de dados 3D tomográficos com um pixel de resolução de 0.7μm. Usando software de renderização de volume, o que permite a reconstrução de estruturas internas em seu estado natural, sem os artefatos produzidos por corte histológico.

Não-invasivo 3D Visualization com Sub-micron Resolução Usando Síncrotron-X-ray-tomografia

Nós apresentamos métodos para a fabricação de microestruturas com padrões de nanotubos de carbono alinhados verticalmente (CNT), e sua utilização como moldes de mestre para a produção de microestruturas de polímero com a textura da superfície organizada em nanoescala. As florestas CNT são densificados por condensação de solvente na superfície do substrato, o que aumenta significativamente a sua densidade de embalagem e permite autodirigido formação de formas 3D.

Fabricação, Densificação e Replica Moldagem de Microestruturas de Nanotubos de Carbono 3D

Neste estudo, o objetivo principal foi monitorar a captação celular e eventual exocitose de nanotubos de carbono (NTCs). Nessa perspectiva, propusemos aqui um método único usando citometria de fluxo de imagem multiespectral permitindo uma quantificação e localização de CNTs em um número estatisticamente relevante de células.

Localização e quantificação relativa de nanotubos de carbono em células com citometria de fluxo de imagem multiespectral

Este protocolo usa tridimensional (3D) de imagem e análise técnicas para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. As técnicas são aplicáveis a outras situações onde um sinal fluorescente é usado para isolar um subconjunto de dados de outro sinal fluorescente.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

Uma metodologia para a obtenção de informação sobre a estrutura de raiz visual e quantitativa a partir de dados de raios-X de tomografia computadorizada adquiridos em solo é apresentada.

Extraindo Métricas para sistemas radiculares tridimensionais: Análise de volume e de superfície de In-solo X-ray tomografia computadorizada de dados

Um protocolo para visualização 3D de estruturas microscópicas do tecido usando um método específico da coloração do raio X projetado para a tomografia computada do raio X é apresentado.

Imagem 3D de amostras de tecido sofx usando um método de coloração específica de raios-X e tomografia computadorizada nanoscópica

Aqui, é apresentado um protocolo padronizado para visualizar nanotubos de tunelamento entre queratinócitos epidérmicos humanos e fibroblastos dérmicos usando marcação por membrana e F-actina com imagem confocal z-stack, com co-coloração opcional α-tubulina, permitindo detecção reprodutível e caracterização do citoesqueleto para aplicações de engenharia de tecidos.

Método Padronizado para Detectar Nanotubos de Tunelamento em Células de Pele Humana para Aplicações de Engenharia de Tecidos

O músculo da perna opener crustáceo é apresentado por sua importância histórica e versatilidade experimental no fenótipo muscular, fisiologia e plasticidade sináptica.

Ver histórico e demonstração Fisiologia da MNJ da Muscle Opener Crayfish

Esta comunicação apresenta dados sobre a precisão e reprodutibilidade dos BioSpec nano-espectrofotômetro UV-VIS para dsDNA e quantificação de proteínas. Mesmo com ultra-pequenos volumes (1 a 2 L), a reprodutibilidade é excelente, enquanto a função automática de limpeza melhora o rendimento e os resultados em transição mínima para resultados mais precisos.

Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Aprenda a detectar e quantificar nanotubos de tunelamento usando visualização de volume 3D a partir de imagens confocal de z-stack. Este método manual oferece precisão superior para estudar comunicação intercelular em doenças neurodegenerativas e câncer.

Detecção e quantificação de nanotubos de tunelamento usando imagens de visualização de volume 3D

Explorar mais vídeos