Name: Um Guia para Examinar a Formação de Gordura Intramuscular e sua Origem Celular no Músculo Esquelético (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar gordura intramuscular em tecido esquelético usando fixação em PFA e injeção de glicerol. Este método preserva a morfologia dos adipócitos para análise rigorosa da formação de gordura em doenças musculares.

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Agradecemos aos membros do laboratório Kopinke por ajudarem na coleta de dados e na leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também aos membros do Instituto de Myology da Universidade da Flórida por sua valiosa contribuição sobre o manuscrito. O trabalho foi apoiado pela subvenção do NIH 1R01AR079449. A Figura 2 foi criada com o Biorender.

<ol><li>Milad, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+plasma+lipid+levels+exacerbate+muscle+pathology+in+the+mdx+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+skeletal+muscle+strength%2C+mass%2C+and+quality+in+older+adults%3A+the+health%2C+aging+and+body+composition+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+lipid+content+is+increased+in+obesity+and+decreased+by+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss.</a> Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).</li>
<li>Burakiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+fat+replacement+of+muscle+by+quantitative+MRI+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy.</a> Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).</li>
<li>Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+normal+and+pathologic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">MRI of normal and pathologic skeletal muscle.</a> American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).</li>
<li>Willcocks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+longitudinal+study+of+magnetic+resonance+biomarkers+in+a+large+duchenne+muscular+dystrophy+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort.</a> Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).</li>
<li>Wokke, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+MRI+and+strength+measurements+in+the+assessment+of+muscle+quality+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).</li>
<li>El Agha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic disease.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).</li>
<li>Joe, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+adipose+is+derived+from+a+non-Pax3+lineage+and+required+for+efficient+regeneration+of+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles.</a> Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).</li>
<li>Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hic1+defines+quiescent+mesenchymal+progenitor+subpopulations+with+distinct+functions+and+fates+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).</li>
<li>Hogarth, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroadipogenic+progenitors+are+responsible+for+muscle+loss+in+limb+girdle+muscular+dystrophy+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B.</a> Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Stumm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odd+skipped-related+1+%28Osr1%29+identifies+muscle-interstitial+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+activated+by+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury.</a> Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).</li>
<li>Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+Hedgehog+signaling+restricts+injury-induced+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis.</a> Cell. 170 (2), 340-351 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+promotes+adipogenic+differentiation+of+bovine+stromal+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells.</a> PLoS One. 7 (10), 47496(2012).</li>
<li>Sun, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR%CE%B1+regulated+by+miR-34a+and+FoxO1+promotes+adipogenesis+in+porcine+intramuscular+preadipocytes+through+Erk+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).</li>
<li>Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+characterization+of+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+and+myogenic+progenitors+%28MPs%29+in+skeletal+muscle+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).</li>
<li>Santini, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+PDGFRalpha%28%2B%29+progenitor+cells+contribute+to+fibrosis+versus+healing+in+a+context-+and+spatiotemporally+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner.</a> Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+PDGFRalpha%2B+mesenchymal+progenitors+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle.</a> Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+potential+of+Hic1-expressing+cardiac+stromal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+BMP%2FSMAD+signaling+regulates+lung+alveolar+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation.</a> Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+activate+ciliary+FFAR4+to+control+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis.</a> Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+unbiased+segmentation+and+quantification+of+myofibers+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), 71084(2013).</li>
<li>Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+muscle+regeneration+following+cardiotoxin+and+glycerol+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Anatomy+%3D+Anatomischer+Anzeiger%3A+Official+Organ+of+the+Anatomische+Gesellscaft%22%5BJournal%5D)">Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury.</a> Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).</li>
<li>Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+skeletal+muscle+adiposity%3A+a+glycerol+treatment+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).</li>
<li>Kawai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+glycerol+myopathy%3A+a+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Experimental glycerol myopathy: a histological study.</a> Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Bmp3b+expression+maintains+skeletal+muscle+integrity+and+decreases+in+age-related+sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).</li>
<li>Biferali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm16-mediated+H3K9+methylation+controls+fibro-adipogenic+progenitors+identity+during+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair.</a> Science Advances. 7 (23), 9371(2021).</li>
<li>Biltz, N. K., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+fatty+infiltration+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).</li>
<li>Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tissue+clearing+and+three-dimensional+imaging+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease.</a> iScience. 23 (8), 101432(2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Este protocolo descreve um protocolo extenso e detalhado que permite uma visualização eficiente e uma quantificação rigorosa da gordura intramuscular. Ao dividir o mesmo músculo em duas partes, sendo uma sendo usada para imunofluorescência e outra para análise rt-qPCR, este protocolo também é muito versátil. Também pode ser combinado com o rastreamento de linhagem genética de FAPs para estudar sua conversão em adipócitos sob certas condições e é altamente adaptável ao rótulo e imagem de vários tipos de células adicionais.
As formas mais utilizadas para visualizar a gordura intramuscular são seções de parafina seguidas de manchas de hematoxilina e eosina ou seções congeladas manchadas para corantes lipofílicos, como o Óleo Vermelho O (ORO). No entanto, enquanto os tecidos processados por parafina mantêm a melhor histologia, o mesmo processo também extrai todos os lipídios impedindo o uso de corantes lipofílicos. Embora os métodos de coloração lipofílica funcionem em seções de tecidos fixos e nãofixados da PFA, as gotículas lipídicas são facilmente deslocadas aplicando pressão ao deslizamento de cobertura, distorcendo assim a distribuição espacial da gordura intramuscular. Para contornar isso, um estudo recente estabeleceu um protocolo rigoroso para visualizar adipócitos ORO+ usando uma abordagem de montagem inteira. Para isso, os autores descelularizaram o TA para visualizar a distribuição espacial da gordura intramuscular em toda a TA41. Por mais poderosa que essa técnica seja, também impede o uso de outras co-manchas para marcar estruturas celulares adicionais. Toda a abordagem de imunofluorescência de montagem apresentada aqui pode ser usada para co-manchar adipócitos com uma variedade de marcadores que permitem um mapeamento fino do ambiente celular. Um grande desafio, no entanto, é a penetração tecidual dos anticorpos. Quanto mais fibras forem mantidas juntas, mais difícil será para os anticorpos penetrarem igualmente e amarrarem todos os antígenos disponíveis. Assim, este método é mais eficaz quando se olha para pequenos grupos de fibras. Ao mesmo tempo, esta também é uma limitação, pois a localização anatômica geral da gordura intramuscular está sendo perdida quando se concentra apenas em pequenos feixes de fibras descascados. No entanto, com o desenvolvimento atual de novos métodos de limpeza de tecidos mais novas tecnologias de imagem, maior penetração e visualização de tecidos serão possíveis no futuro 42,43,44.
Embora a fixação prévia do tecido muscular preserve a morfologia adipócito, também cria um desafio para avaliar o tamanho dos miofibers, uma medida importante da saúde muscular. O tamanho da miofibra é determinado medindo a área transversal dos miofibers. Já noticiamos anteriormente que a fixação prévia do tecido muscular fará com que a maioria dos marcadores disponíveis para delinear myofibersfalhem 31. Para superar esse obstáculo, desenvolvemos um novo pipeline de segmentação de imagens, que permite a medição do tamanho da miofibra mesmo nas seções musculares fixas31. Assim, estabelecemos um robusto e eficiente pipeline de processamento de tecidos que, combinado com este protocolo, supera a maioria das desvantagens causadas pela fixação prévia do tecido muscular.
Outra grande vantagem dessa abordagem é a versatilidade. Ao dividir o TA em duas partes, a quantidade de informações que podem ser obtidas de um músculo é maximizada. Isso não só reduz o número de animais, mas também adiciona uma camada extra de controle, confirmando a histologia através da expressão genética e vice-versa. Além disso, muitos genes diferentes podem ser examinados além de genes adipogênicos. O RNA isolado também pode ser usado para um experimento rnaseq muscular inteiro. Finalmente, a peça muscular congelada também pode ser usada para o trabalho proteico. Uma limitação deste protocolo é a possibilidade de a lesão não ser consistente em toda a extensão do TA. Isso pode levar a um cenário em que as duas partes musculares divergem na quantidade de gordura intramuscular que contêm e podem justificar a exclusão de tal amostra de qualquer análise a jusante. Recomenda-se, portanto, não simplesmente confiar no RT-qPCR para tirar grandes conclusões sobre a quantidade de gordura intramuscular, mas sim como dados de apoio às quantificações histológicas.
Em conjunto, este protocolo descreve um robusto, eficiente e rigoroso pipeline de processamento de tecidos que permitirá a visualização e quantificação da gordura intramuscular, o primeiro passo no desenvolvimento de novas opções de tratamento para combater a fibrose gordurosa. Ao mesmo tempo, é versátil e pode ser adaptado a muitos tipos de células diferentes dentro do músculo, bem como adipócitos em outros tecidos.

A infiltração de tecido muscular saudável com fibrose gordurosa é uma característica proeminente da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e outras doenças neuromusculares, bem como sarcopenia, obesidade e diabetes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Embora o aumento da infiltração de gordura nessas condições esteja fortemente associado à diminuição da função muscular, nosso conhecimento sobre o porquê e como as formas de gordura intramuscular ainda são limitadas. Os FAPs são uma população multipotente de células estromal mesenquimais presentes na maioria dos órgãos adultos, incluindo músculo esquelético11,12. Com a idade e as doenças crônicas, no entanto, as FAPs produzem tecido cicatricial fibroso e diferenciam-se em adipócitos, que estão localizados entre os miofibers individuais e formam gordura intramuscular 13,14,15,16,17,18,19,20.
Para começar a combater a formação de gordura intramuscular, os mecanismos de como as FAPs se transformam em adipócitos precisam ser definidos. PDGFRα é o marcador "padrão-ouro" no campo para identificar FAPs dentro do músculo de múltiplas espécies 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. Como resultado, várias linhas cre indutíveis de tamoxifeno murine, sob o controle do promotor Pdgfrα, foram geradas, permitindo a manipulação genética de FAPs in vivo usando o sistema Cre-LoxP 27,28,29. Por exemplo, combinando esta linha de Cre indutível com um repórter genético, o rastreamento de linhagem de FAPs pode ser realizado, uma estratégia que aplicamos com sucesso ao mapa do destino FAPs em tecido adiposo muscular e branco20,30. Além do rastreamento de linhagem, essas linhas Cre fornecem ferramentas valiosas para estudar a conversão FAP-para-gordura.
Um grande obstáculo na definição do mecanismo da conversão adipogênica das FAPs em gordura intramuscular é a capacidade de quantificar rigorosamente e reprodutivelmente a quantidade de gordura intramuscular que se formou em diferentes condições. A chave é equilibrar a preservação do tecido muscular e adiposo e combinar isso com os métodos de coloração disponíveis para visualizar adipócitos. Por exemplo, o músculo esquelético é muitas vezes congelado sem fixação prévia, preservando miofibers, mas interrompendo a morfologia adipócito (Figura 1). Em contraste, a fixação seguida de incorporação de parafina, enquanto exibe a melhor histologia tecidual, incluindo adipócitos, remove todos os lipídios, tornando assim a maioria dos corantes lipofílicos, como o corante comumente usado Oil Red O, inutilizável.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2.jpg"> Figura 1: Imagens representativas de gordura intramuscular em tecidos musculares congelados e fixos. (A) Visão geral esquemática da configuração experimental. Imagens imunofluorescentes que mostram adipócitos (amarelo), miofibers (cinza) e núcleos (ciano) dentro de ambos (B) snap-frozen e (C) fixaram TAs em 21 dias após lesão glicerol. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O protocolo aqui descrito preserva a morfologia da miofibra e adipócito e permite a visualização e análise de múltiplos tipos de células. Esta abordagem baseia-se na coloração de imunofluorescência de adipócitos em tecido muscular fixo paraformaldeído (PFA), que permite a co-coloração com múltiplos anticorpos. Também pode ser facilmente adaptado para exibir espacialmente gordura intramuscular em tecido intacto usando imagens de montagem total, fornecendo assim informações sobre o microambiente celular de gordura dentro do músculo. Além disso, este protocolo pode ser combinado com nossa abordagem recentemente publicada para determinar a área transversal de miofibers em tecidos musculares fixos31, uma medida importante para avaliar a saúde muscular. Combinando essa abordagem com o rastreamento de linhagem genética ao mapa do destino, a diferenciação das FAPs em adipócitos também é descrita aqui. Assim, o protocolo versátil aqui descrito permite uma avaliação rigorosa e reprodutível das FAPs e sua diferenciação em gordura intramuscular em seções teciduais e tecidos intactos.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2.jpg"> Figura 2: Visão geral do protocolo esquemático. Visão geral esquemática do processamento de tecidos em que um terço do TA é removido, congelado por snap e homogeneizado para análise subsequente de isolamento e transcrição do RNA via RT-qPCR. Os outros dois terços do TA são fixos e processados por PFA para imunossuagem em seções congeladas ou fibras de montagem inteira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>16% PFA (Pacote de 12, garrafas de 10 mL)</td> <td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Tubos de Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>para congelamento/batimento de esferas</td></tr><tr><td>2-Metilbutano (4 L)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>O3551-4</td><td>isopentano</td></tr><tr><td>Etanol Absoluto (200 provas)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Fragmento AffiniPure Fab anti-rato de burro Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>bloqueio de rato com rato</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo secundário anti-frango de burro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo secundário anti-rato de burro</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo</td> <td>secundário anti-coelho de burroInvitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anticorpo secundário anti-cabra de burro</td><td>Invitrogen</td><td>A11057</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anticorpo secundário de coelho de burro</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anticorpo de faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td>Dissolvido em 1,5 mL de metanol (~ 66 &micro; Solução de trabalho M)</td></tr><tr><td>BioLite Multiplacas de 24 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>930186</td><td>placa de 24 poços para incubação de tecido PFA</td></tr><tr><td>Biometra TOne</td><td>analytikjena</td><td>8462070301</td><td>Termociclador</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP de frango</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio / álcool isoamílico 24: 1 (v / v) para biologia molecular, DNAse, RNAse e ThermoFisher livre de protease</td><td> Óleo</td><td>de milho da Scientific AC327155000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>DAPI mancha</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>150 &micro; Solução de trabalho M em dH2O</td></tr><tr><td>Soro de Burro (100 mL)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5058837</td><td>para solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5 Pinças</td><td>de ponta afiada</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td></tr><tr><td>Tesouras Finas Retas 9 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>meio de montagem</td></tr><tr><td>Glicerol, 99,5%, para biologia molecular (500 mL)</td><td>Acros Organics</td><td>327255000</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anticorpo anti-PDGFR&alfa;</td><td>R& D</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>Forno de Hibridização</td><td>VWR</td><td>230301V</td><td>para incubação de Tamoxifeno</td></tr><tr><td>Caneta PAP de Barreira Hidrofóbica ImmEdge</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Insulina com Agulha Micro-Fine IV (28 G)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Insulina com Ponta Deslizante, 1 mL</td><td>BD</td><td>329654</td><td>Seringa de Insulina sem agulha, para uso oral kit de síntese de</td></tr><tr><td>cDNA iScript</td> de gavagem <td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson</td><td>78938441</td><td></td>Microscópio</tr><tr><td>invertido Leica DMi8</td> Microscópio <td>Leica</td><td></td><td>usado para IF de campo amplo e imagens confocais</td></tr><tr><td>Micro Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>lâminas de microscópio carregadas positivamente</td></tr><tr><td>anticorpo anti-MYOD</td> <td>de ratoAnticorpo</td> anti-PAX7 de camundongo Invitrogen <td>MA1-41017</td><td></td></tr><tr><td>(sobrenadante)</td> <td>DSHB</td><td>AB 428528</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Premier + Lâminas de micrótomo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3052835</td><td>lâminas de micrótomo</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop 2000 ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>ND2000</td><td>para rendimento de RNA</td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td>Composto de modelagem Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25742</td><td>corante verde PCR master mix</td></tr><tr><td>Puralube Vet Pomada</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>pomada oftálmica veterinária</td></tr><tr><td>QuantStudi 6 Flex Sistema de PCR em tempo real de 384 poços</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485694</td><td>qPCR máquina</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-perilipina de coelho</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9349S</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de rotor vermelho</td><td>Hoefer Scientific</td><td>PR70-115V</td><td>agitador para coloração IF</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>152460</td><td>lamínulas</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td>contém mini colunas</td></tr><tr><td>giratórias Tubos Safe-Lock 1,5 ml, natural</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Sample Tubes RB (2 mL)</td><td>QIAGEN</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Alfa Aesar</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço inoxidável, 2,8 mm</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-101. Contas pequenas BK</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço inoxidável, contas</td><td>médias</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td> de 5 mm</tr><tr><td>Contas de aço inoxidável, contas</td><td>grandes</td><td>QIAGEN</td><td>69990</td> de 7 mm</tr><tr><td>Bisturis descartáveis de aço inoxidável</td><td>Bisturi</td><td>Miltex</td><td>327-4102</td></tr><tr><td>Tubo de alimentação de aço inoxidável, 20 G x 38 mm, reto</td> Agulha <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de gavagem Instech Laboratories FTSS-20S-3Tamoxifeno</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>T006000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus O.C.T. Composto</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td><td>meio de incorporação</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>QIAGEN</td><td>85600</td><td>batedor de contas</td></tr><tr><td>Adaptador TissueLyser LT, 12 tubos</td><td>QIAGEN</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de amostra Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td>Triton</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>tiocianato de guanídio</td></tr><tr><td>Tween20 (500 mL)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides - Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311703</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin frascos de coloração</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6016</td><td>Coplin jar</td></tr></tbody></table>

um guia para examinar a formação de gordura intramuscular e sua origem celular no músculo esquelético

A Guide to Examining Intramuscular Fat Formation and its Cellular Origin in Skeletal Muscle

Progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) são células mesenquimais estromicas que desempenham um papel crucial durante a homeostase e regeneração muscular esquelética. As FAPs constroem e mantêm a matriz extracelular que age como um andaime molecular de miofibra. Além disso, os FAPs são indispensáveis para a regeneração da miofibra, pois secretam uma infinidade de fatores benéficos sentidos pelas células-tronco musculares (MuSCs). Em estados doentes, no entanto, as FAPs são a origem celular da gordura intramuscular e do tecido cicatricial. Esta fibrose gordurosa é uma marca registrada de sarcopenia e doenças neuromusculares, como distrofia muscular de Duchenne. Uma barreira significativa na determinação do porquê e como as FAPs se diferenciam em gordura intramuscular é a preservação efetiva e posterior visualização de adipócitos, especialmente em seções de tecido congelado. Métodos convencionais de processamento do tecido muscular esquelético, como o congelamento de snaps, não preservam adequadamente a morfologia dos adipócitos individuais, impedindo assim a visualização e quantificação precisas. Para superar esse obstáculo, foi desenvolvido um protocolo rigoroso que preserva a morfologia adipócito em seções musculares esqueléticas que permitem visualização, imagem e quantificação de gordura intramuscular. O protocolo também descreve como processar uma porção de tecido muscular para RT-qPCR, permitindo que os usuários confirmem alterações observadas na formação de gordura, visualizando diferenças na expressão de genes adipogênicos. Além disso, pode ser adaptado para visualizar adipócitos por imunofluorescência de montagem total de amostras musculares. Finalmente, este protocolo descreve como realizar o rastreamento de linhagem genética de FAPs que expressam Pdgfrα para estudar a conversão adipogênica de FAPs. Este protocolo produz consistentemente imagens imunofluorescentes de alta resolução e morfologicamente precisas de adipócitos, juntamente com a confirmação pelo RT-qPCR, permitindo uma visualização e quantificação robusta, rigorosa e reprodutível de gordura intramuscular. Juntos, o pipeline de análise descrito aqui é o primeiro passo para melhorar nossa compreensão de como as FAPs se diferenciam em gordura intramuscular, e fornece uma estrutura para validar novas intervenções para prevenir a formação de gordura.

Visualização imunofluorescente de gordura intramuscular Seguindo os passos acima e vendo a Figura 1A, as seções de tecido TA foram coletadas a partir de uma lesão pós glicerol de 21 dias que foram congeladas imediatamente após a colheita em isopentane resfriada em LN2 ou foram fixadas em 4% pfa por 2,5 h. Após a crioseção e coloração de ambas as amostras, as imagens foram tiradas no meio da barriga, a maior área do TA. Os adipócitos PERILIPIN+ dos TAs não fixados (Figura 1B) alteraram significativamente a morfologia em comparação com as seções fixas (Figura 1C), tornando sua identificação, visualização e quantificação subsequente muito mais difíceis e potencialmente imprecisas. Para notar, as primeiras gotículas lipídicas PERILIPIN+ foram detectadas em torno de 5 dias após a lesão, com a maioria dos adipócitos tendo se formado até o dia 7. Por 21 dias após a lesão, os adipócitos tinham amadurecido completamente.
Como a quantidade de gordura por TA se correlaciona fortemente com a gravidade da lesão induzida, os TAs devem ser feridos significativamente para observar e estudar efetivamente a formação de gordura intramuscular. Praticar injeções usando tinta em TAs de cadáver é uma ótima maneira de melhorar a gravidade da lesão. Lesões bem sucedidas tendem a ser acima de 50% do músculo. Note-se que as áreas lesionadas do músculo representam áreas desprovidas de fibras musculares ou áreas que são povoadas por fibras musculares que contêm pelo menos um núcleo localizado centralmente, uma marca conhecida de uma fibra muscular regeneradora.
Este protocolo pode ser prontamente adaptado à mancha para FAPs e gordura em 3D. Para isso, vários miofibers da pós-fixação do TA foram cuidadosamente separados, seguidos por imunofluorescência de montagem total. A chave é fixar adequadamente as fibras na lâmina de vidro e, ao mesmo tempo, evitar a super-compressão do tecido. Usando pés de argila moldáveis, o usuário pode ajustar a espessura necessária e fixar a mancha de cobertura no slide, permitindo até mesmo o uso de um microscópio invertido (Figura 4A). Este método foi usado com sucesso para rotular FAPs PDGFRα+ , myofibers de Phalloidin+ e adipócitos expressos perilipin (Figura 4B, Vídeo Suplementar 1 e Vídeo Suplementar 2). Depois de obter imagens em vários z-planes que abrangem até 150 μm de espessura, o módulo de renderização 3D dentro do software de microscópio foi usado para criar uma reconstrução 3D.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3.jpg"> Figura 4: Coloração imunofluorescente de montagem total. (A) Visão superior e lateral de como montar a amostra e adicionar tampas para coloração de montagem inteira. (B) Reconstruções 3D representativas de FAPs (verde; esquerda) e adipócitos (vermelho; direita) juntamente com miofibers (cinza) e núcleos (azul). Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Quantificação da gordura intramuscular Uma vez que as imagens foram tiradas de gordura intramuscular, a função Cell Counter em ImageJ/FIJI foi usada para contar manualmente o número de adipócitos PERLIPIN+ (Figura 5A). Em seguida, foi determinada a área total da seção muscular, bem como a área lesionada, definida por núcleos localizados centralmente dentro dos myofibers. Para controlar a gravidade da lesão, o número total de adipócitos foi dividido pela área lesionada, resultando no número de células de gordura por 1 mm2 de músculo ferido. Normalmente, os TAs que exibem &lt; 30% de lesão são excluídos das quantificações. Note-se que, embora os adipócitos sejam raros sem ferimentos, variando de zero a oito por área transversal, o número total de adipócitos ainda é normalizado pela área total. Como destacado na Figura 5B, uma lesão de glicerol causa grandes quantidades de gordura intramuscular em comparação com um músculo TA ileso. Alternativamente, como a coloração de Perilipin é muito limpa com uma alta relação sinal-ruído, também é possível usar a função Analisar partícula para determinar a área total ocupada por Perilipin. No entanto, este método não será capaz de distinguir entre adipócitos menores versus menos. Até três seções de um mínimo de quatro animais individuais foram imagens e quantificadas, e o número médio de células de gordura presentes por camundongo foi relatado.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2.jpg"> Figura 5: Quantificações de gordura intramuscular. (A) Imagem representativa de como contar adipócitos PERILIPIN+ (branco) utilizando a função Contador de Células no ImageJ. Barra de escala: 50 μm. (B) Quantificações completas de adipócitos ta 21 dias após injeção de glicerol normalizada para 1 mm2 da área ferida. Cada ponto representa a média de um mouse. Barras de erro mostradas como SEM. **** = p &lt; 0,0001. (C) camada de RNA após homogeneização e posterior separação de fase por clorofórmio está sendo usada para análise de RT-qPCR. (D) Dobra as mudanças nos níveis de expressão de Pparg e Cepbα, genes adipogênicos precoces, e Plin1 e Adipoq, dois marcadores adipócitos maduros, em diferentes pontos de tempo após lesão glicerol. Cada ponto representa a média de um mouse. Barras de erro mostradas como SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para confirmar independentemente a quantidade de gordura intramuscular presente, podem ser determinados níveis de expressão genética de vários marcadores adipogênicos. Para isso, o RNA pode ser isolado de uma porção do mesmo músculo TA usado para imunofluorescência (ver passos acima) em diferentes pontos pós-lesão. Um batedor de contas foi usado em combinação com tiocianato de guanidium para homogeneizar o tecido. Após a adição de clorofórmio seguido de centrifugação, a camada superior contendo RNA foi cuidadosamente extraída, e mini colunas de spin foram usadas para limpeza de RNA (Figura 5C). Este método produz rotineiramente alta qualidade e quantidade de RNA adequado para todas as análises a jusante, como RT-qPCR e RNAseq. Para o RT-qPCR, os níveis relativos de expressão dos genes adipogênicos à limpeza foram determinados, e quaisquer alterações relativas foram avaliadas após o método ΔΔCT38. Como descrito na Figura 5D, em comparação com o músculo TA não ferido, a lesão do glicerol induz a expressão de marcadores adipogênicos precoces, como Pparg e Cebpα , logo após 3 dias de lesão. Marcadores maduros, como Adiponectin (Adipoq) e Perilipin (Plin1), podem ser detectados logo após a lesão do glicerol.
Rastreamento de linhagem genética de adipócitos O protocolo de coloração adipócito apresentado aqui pode ser facilmente adaptado para incluir o rastreamento de linhagem genética de FAPs para mapear e seguir seu destino em adipócitos. Demonstramos, por exemplo, anteriormente que a recombinação poderia ser induzida via administração de tamoxifen em PdgfrαCreERT2; CamundongosRosa26 EYFP 2 semanas antes da lesão, removendo efetivamente a codificação de parada floxed e ativando indelibavelmente a expressão EYFP em FAPs (Figura 6A). Conseguimos altas eficiências de recombinação com o regime de tamoxifeno aqui apresentado, com ~75% das FAPs PDGFRα+ expressando EYFP20, semelhante ao que outros laboratórios relataram 27,39,40. Demonstrando que as FAPs são de fato a origem celular da gordura intramuscular, a maioria dos FAPs se transformaram em adipócitos expressos de PERILIPIN 7 dias após lesão glicerol (Figura 6B).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3.jpg"> Figura 6: Rastreamento de linhagem de FAPs. (A) Visão geral esquemática da configuração experimental. (B) Imagens imunofluorescentes representativas que mostram recombinação e ativação bem-sucedidas de EYFP (amarelo) dentro de FAPs PDGFRα+ (vermelho, pontas de flecha) e adipócitos PERILIPIN+ (vermelho, asteriscos). Barras de escala: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Detecção de vários tipos de células Este protocolo também pode ser usado para visualizar o compartimento miogênico. Usando anticorpos contra PAX7 e MYOD1, células-tronco musculares (MuSCs) e míferas, respectivamente, podem ser prontamente detectadas 5 dias após lesão de glicerol mesmo na seção de tecido muscular fixo pfa (Figura 7). Assim, o protocolo apresentado é versátil e adaptável não só para adipócitos de etiqueta e imagem e FAPs, mas também outros tipos celulares da linhagem miogênica.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2.jpg"> Figura 7: Célula-tronco muscular e coloração imunofluorescente myoblast. (A) Visão geral esquemática da configuração experimental. (B) Imagens imunofluorescentes representativas mostrando a coloração bem sucedida de células-tronco musculares (MuSC) (amarelo, esquerda) com PAX7 e myoblasts (amarelo, direita) com MYOD1. LAMININ descreve os miofibers (branco), e os núcleos estão em ciano. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo suplementar 1: renderização 3D de FAPs. Reconstrução tridimensional de miofibers, FAPs e núcleos manchados para PHALLOIDIN (cinza), PDGFRα (verde) e DAPI (azul), respectivamente, 21 dias após lesão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAPs.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo suplementar 2: renderização 3D de gordura intramuscular. Renderização volumosa de pacotes de miofibra (cinza, PHALLOIDIN) e gordura intramuscular (vermelho, PERILIPIN), que substituiu uma lesão de miofibra 21 dias após a lesão de glicerol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAT.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

A substituição do tecido muscular saudável por gordura intramuscular é uma característica proeminente das doenças e condições humanas. Este protocolo descreve como visualizar, imagem e quantificar a gordura intramuscular, permitindo o estudo rigoroso dos mecanismos subjacentes à formação de gordura intramuscular.

Um Guia para Examinar a Formação de Gordura Intramuscular e sua Origem Celular no Músculo Esquelético

Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) are mesenchymal stromal cells that play a crucial role during skeletal muscle homeostasis and regeneration. FAPs build ...

Uma barreira significativa no estudo da gordura intramuscular, marca registrada de sarcopenia e doenças neuromusculares, é a efetiva preservação e posterior visualização de adipócitos, especialmente em seções de tecido congelado. O protocolo preserva a morfologia adipócito e seções musculares esqueléticas alinhadas para visualização robusta, rigorosa e reprodutível e quantificação de gordura intramuscular. Nosso pipeline de análise fornece uma estrutura para validar novas intervenções para prevenir a formação de gordura em doenças como distrofia muscular de Duchenne Demonstrando que o procedimento será Connor Johnson, um técnico de pesquisa do meu laboratório.Para começar, limpe a perna a ser injetada com um lenço de álcool fresco para desinfetar. Escante-se de 30 a 50 microliters de 50% glicerol na seringa de insulina. Escove suavemente o cabelo na canela para expor a localização do TA. Depois de localizar o TA, insira a agulha no TA distally perto do tornozelo.Insira totalmente a agulha no músculo e injete lentamente glicerol, enquanto gradualmente retira a agulha que ajuda a ferir a maior parte do músculo. Pulverizar liberalmente todas as áreas do mouse para serem cortadas com 70% de etanol para ajudar a manter o cabelo fora da área de dissecação e instrumentos. Use uma tesoura para cortar a pele ao redor da parte superior da perna perto da pelve.Puxe suavemente a pele da perna de cima para baixo até o tornozelo. Primeiro, remova a camada externa do tecido conjuntivo usando pinças afiadas antes de colher o TA. Deslize as pinças por baixo do TA a partir da parte inferior do músculo, começando no tendão distal e puxe suavemente para cima em direção ao joelho. Pare no final do músculo.Não empurre além da resistência sentida no joelho inferior. Se houver uma resistência significativa antes de atingir o joelho inferior, pare e continue removendo as camadas restantes do tecido conjuntivo. Uma vez que o TA tenha sido parcialmente levantado da perna com a pinça, use o mesmo movimento com um bisturi para cortar a conexão do TA com o joelho inferior.Estripe o tendão do tornozelo com uma tesoura para remover totalmente o TA. Só manuseie o músculo no tendão para evitar danificar as fibras. Corte um terço do TA no final, em frente ao tendão. Coloque-o no tubo de micro centrífuga e estonte-o, deixando-o em nitrogênio líquido.Submergir os outros dois terços do tecido em um poço rotulado com 4% de PFA para histologia. Certifique-se de acompanhar quando o primeiro e último tecido foi colocado em fixação. Coloque em um nutador por duas a duas horas e meia a quatro graus Celsius.Após a fixação, remova o PFA dos poços. Enxágüe os tecidos com um X PBS frio duas a três vezes e depois lave duas a três vezes com PBS 1X frio por cinco minutos por lavagem. Retire o PBS dos poços e adicione sacarose suficiente de 30% no PBS 1X para permitir que o tecido flutue.Coloque no nutador a quatro graus Celsius durante a noite. Ligue o microscópio e inicie o software de imagem. Segure o slide no palco.Use qualquer canal para identificar a área a ser imagen. No software de imagem, ajuste o tempo de ganho e exposição de cada canal. Pegue imagens de todo o tecido em cada canal e mescle telhas individuais para fazer um composto da seção transversal ta completa.Antes de começar, pré-aqueça a água livre RNase a 45 graus Celsius e prepare 70% de etanol fresco. Adicione 1000 microliters de tiocianato de guanidinium a cada tubo contendo a amostra. É importante que os tubos aprovados pelo Bead Beater estejam sendo usados.Adicione três contas médias, ou uma grande e uma pequena, em cada tubo. Homogeneize o tecido a 50 Hertz por dois a quatro minutos usando um Batedor de Contas. Dependendo do tipo de tecido e tamanho da amostra, pode levar até 10 minutos.adicionar 200 microliters de clorofórmio. Agite as amostras por 15 segundos. Incubar por dois a três minutos em temperatura ambiente.Centrifugar por 15 minutos a 12.000 vezes G.Pipette fora 350 microliters do supernatante claro e adicionar a um novo tubo de micro centrífugas contendo 350 microliters de 70% de etanol. Tenha cuidado para não aspirar as camadas de proteína e/ou DNA inferiores. Transfira até 700 microliters desta mistura para uma coluna mini spin colocada em um tubo de coleta de dois mililitros.Continue com o isolamento do RNA seguindo as instruções do fabricante. Elute com 30 a 50 microliters de água livre RNase, dependendo do rendimento esperado. Mantenha o RNA no gelo e meça o rendimento usando um espectrofotômetro.Mantenha o RNA armazenado a menos 80 graus Celsius. Use até um micrograma de RNA para sintetizar o CDNA com um kit de síntese cDNA, seguindo as instruções do fabricante. Depois que a corrida estiver completa, adicione 80 microliters de água livre RNase.Armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Usando um formato 384 bem, adicione um microliter de primer na parte inferior de cada poço. Primers de secagem grátis resultam em réplicas técnicas mais apertadas.Deixe coberto até que os primers tenham evaporado completamente. Configure reações amostrais com quatro a oito réplicas técnicas. Após a execução do PCR ser concluída, normalize os valores do limiar do ciclo bruto para os níveis genéticos de limpeza e determine mudanças de dobra calculando o Delta-Delta Ct.Perilipin e adipócitos positivos dos TAs não fixados têm morfologia significativamente alterada em comparação com seções fixas, tornando sua identificação, visualização e uma quantificação subsequente muito mais difícil e potencialmente imprecisa.Em contraste, a fixação pfa preserva a morfologia adipócito, permitindo a detecção precisa de gordura intramuscular. Em comparação com o músculo TA não ferido, a lesão do glicerol induz a expressão de marcadores adipogênicos precoces, como ppar gama e ALFA CEBP logo após três dias de lesão. Marcadores maduros como adiponectina e perilipina podem ser detectados até cinco dias após a lesão do glicerol.Usando rastreamento de linhagem genética, a maioria dos FAPs alfa do receptor PDGF expressam o marcador de linhagem EYFP. Sete dias após lesão de glicerol, as FAPs positivas da EYFP transformaram-se em perilipina positiva da EYFP expressando adipócitos, demonstrando que as FAPs são de fato a origem celular da gordura intramuscular. O protocolo também pode ser adaptado para visualizar o compartimento miogênico.Usando anticorpos contra PAX7 e MYOD1, os músculos células-tronco e marcadores myoblast, respectivamente podem ser facilmente detectados cinco dias após lesão glicerol, mesmo em seções de tecido muscular fixo PFA. Este protocolo também pode ser adaptado para visualizar e quantificar adipócitos e outros tecidos adultos. Além disso, nossa técnica de preservação de tecidos é compatível com a variedade de diferentes técnicas em pé.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Os adipocytes existem em depósitos discretos e têm papéis diversos dentro de seus microambientes originais. Como as diferenças regionais no caráter e na função do adipócitos são descobertas, a identificação estandardizada e a isolação dos depósitos são cruciais para o avanço do campo. Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a excisão de vários depósitos adiposos do rato.

Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo

Evidências crescentes indicam que a infiltração excessiva de lipídios dentro do músculo esquelético resulta em lipotoxicidade e diabetes. Aqui, apresentamos um protocolo completo, incluindo processamento de tecidos, coloração com Bodipy, aquisição de imagens e análise, para quantificar o tamanho, densidade e distribuição subcelular de gotículas lipídicas de forma específica do tipo fibra.

Tipo de fibra e análise subcelular-específica do conteúdo de gotícula lipídica no músculo esquelético

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

O presente estudo descreve metodologias baseadas na decelularização para visualizar e quantificar a deposição de tecido adiposo intramuscular (IMAT) através do volume muscular intacto, bem como quantificar métricas de adipócitos individuais que compõem o IMAT.

Quantificação da Infiltração Gordurosa do Músculo Esquelético Baseada na Decelularização

Investigamos o tecido muscular esquelético em Bos indicus e touros mestiços para explicar as diferenças nas características de qualidade da carne. A força de cisalhamento Warner-Bratzler (WBSF) variou de 4,7 kg a 4,2 kg. As isoformas de cadeia pesada da miosina revelaram diferenças entre os animais, e o índice de fragmentação da miofibrila forneceu mais informações sobre as variações da maciez (WBSF).

Explorando o músculo longuíssimo: desvendando sua correlação com a qualidade da carne em touros Bos indicus e mestiços

A biologia do tecido adiposo intermuscular (MAT) é amplamente inexplorada devido à acessibilidade limitada do tecido humano. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento de núcleos e preparação de biblioteca de IMAT humano congelado para sequenciamento de RNA de núcleo único para identificar a composição celular deste depósito adiposo único.

Isolamento de Núcleos do Tecido Adiposo Intermuscular Humano e Sequenciamento de RNA de Núcleo Único a Jusante

Neste estudo, descrevemos um método simples para realizar a análise do Corante Azul de Evans (EBD) em larvas de peixe-zebra.  Esta técnica é uma ferramenta poderosa para a caracterização da integridade do músculo esquelético e delineamento de modelos de distrofia muscular de peixe-zebra, e é um método valioso para o desenvolvimento de novas terapêuticas.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

O peixe-zebra é um excelente modelo para estudar a função muscular e doenças. Durante o início da embriogênese, o peixe-zebra inicia contrações musculares regulares, produzindo um comportamento rítmico de natação, que é alterado quando o músculo é interrompido. Aqui descrevemos um ensaio de resposta evocada por toque e locomoção para examinar o desempenho da natação como uma medida da função muscular.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

Aprenda a visualizar e quantificar gordura intramuscular em tecido esquelético usando fixação em PFA e injeção de glicerol. Este método preserva a morfologia dos adipócitos para análise rigorosa da formação de gordura em doenças musculares.

Um Guia para Examinar a Formação de Gordura Intramuscular e sua Origem Celular no Músculo Esquelético

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