Modelo de dor nas costas de camundongo induzido pelo ativador do plasminogênio do tipo uroquinase
September 1st, 2023
Métodos para indução simples e rápida de um modelo de dor nas costas em camundongos são fornecidos aqui usando uma injeção intraligamentar de ativador de plasminogênio urinário.
Este protocolo descreve um método não invasivo para induzir dor lombar crônica em camundongos por até 10 semanas, que pode ser realizado de forma rápida e confiável com treinamento mínimo. O aspecto mais difícil desta técnica é reconhecer como injetar ligamento se sente versus injetar músculo. Sentir resistência ao contato indica injeção ligamentar.
Sem resistência significa que a agulha pode estar no músculo ou na cavidade abdominal. Para começar, pegue uma superfície plana estéril para colocar o mouse. Em seguida, coloque uma estação de recuperação de almofada de aquecimento ao lado da configuração da cirurgia para transferir imediatamente os ratos após a injeção.
Em seguida, prepare a uroquinase e uma seringa de Hamilton. Desenhe a solução com antecedência para minimizar o tempo que o rato passa sob anestesia. Após anestesiar o camundongo, utilizar dois dedos para localizar os segmentos da coluna lombar em L2 e L3 abaixo da caixa torácica e verificar o local da injeção.
Coloque a ponta da seringa de Hamilton ao lado da coluna. Posicione a seringa em um ângulo de aproximadamente 45 graus no ligamento imediatamente adjacente ao osso. Insira a ponta da agulha suavemente, mas com firmeza, no ligamento e injete lentamente até que todos os cinco microlitros tenham sido injetados.
Retire a agulha suave e lentamente. Em seguida, coloque o mouse na estação de recuperação de calor até que ele acorde e se torne móvel. Verifique os ratos por uma hora após a cirurgia para garantir que toda a função motora normal continue.
Após a cirurgia, verifique o peso e o local de injeção dos ratos diariamente por uma semana para evitar qualquer infecção ou complicações. Antes de testar, mova cada animal para um cubículo transparente separado na mesa de teste com uma parte superior da tela. Em seguida, estimule o coxim pé com o filamento de Von Frey 3,61 que provoca quatro gramas de força.
A retirada dos pés de três a cinco estímulos é considerada uma resposta positiva. Agora, aplique o próximo filamento mais fraco da série até que o animal pare de responder ao estímulo mecânico. Use o filamento superior até que uma resposta seja obtida e, em seguida, volte para o filamento inferior.
Usando um algoritmo de ajuste de curva, calcule o limiar de retirada mecânica, que é a quantidade mínima de força necessária para provocar uma resposta em 50% do tempo. Para realizar o Teste de Hargreaves, coloque os ratos em cubículos em uma superfície de vidro aquecida por baixo por um emissor infravermelho. Meça o tempo desde a aplicação do estímulo de luz infravermelha na pata traseira do rato até a retirada como latência do pé.
Para o Teste da Placa Fria, coloque os ratos no aparelho de placa fria resfriado a menos nove graus Celsius. Registre o tempo que o mouse leva para levantar o pé após ser colocado no aparelho como a latência para retirar o pé. Para realizar o Teste de Ansiedade, posicione cada animal na caixa de teste de preferência de local com uma passagem entre duas câmaras.
Uma câmara do aparelho deve estar iluminada com clareza, enquanto o lado oposto deve permanecer escuro. Usando um computador, monitore os tempos de ocupação e transições claros e escuros do animal durante um teste de 10 minutos. Em seguida, coloque os roedores modelo ou animais ingênuos no labirinto zero, ou use o teste de preferência de lugar claro ou escuro de duas câmaras.
Avalie o tempo gasto em áreas fechadas e abertas do labirinto usando um cronômetro. Para o Sucarose Splash Depression Test, borrife uma solução de sacarose a 10 a 30% no código dorsal e pontue a frequência, duração e latência da tosa por 10 minutos. Para realizar novos testes com objetos, aclimate camundongos individualmente a uma gaiola de plástico transparente com uma tampa aberta por uma hora.
Adicione duas mini figuras de brinquedo idênticas em cantos opostos da gaiola por cinco minutos. Aclimatar os animais no dia do teste por uma hora e colocar as duas mini figuras idênticas nas mesmas posições da gaiola por cinco minutos antes de devolvê-los à gaiola de origem. Em seguida, substitua uma das figuras originais por um objeto novo distintamente diferente.
Após quatro horas, devolva os ratos à gaiola de teste e registre o tempo gasto explorando os objetos. Para avaliação da função motora, construa um túnel a partir de um tubo de papel toalha cortado longitudinalmente em uma borda. Espalhe o túnel em um pedaço limpo de papel de impressora.
Segure os ratos suavemente até que estejam calmos. Aplique tinta indiana não tóxica nas patas de um rato, colocando-as em um poço de tinta, bloco de carimbo ou usando um cotonete. Solte os ratos na entrada do túnel.
Permita que eles corram pelo túnel e os capturem no final. Marcar impressões de patas com base no comprimento da passada, largura da passada e espalhamento dos dedos. Ensaios de hipersensibilidade mecânica e térmica demonstraram que os camundongos com dor lombar crônica tiveram sensibilidade mecânica, ao calor e ao frio significativamente aumentada em comparação com os controles virgens.
A análise de ansiedade mostrou que o tempo total gasto na câmara de luz da caixa clara e escura e o número de eventos de criação foram significativamente menores em camundongos com dor crônica nas costas, indicando ansiedade. Durante o Sucarose Splash Test, camundongos com dor lombar crônica apresentaram menor tempo de tosa e o número de tosas. No entanto, o tempo para o início da tosa aumentou significativamente.
O comprimento da passada entre camundongos com dor lombar crônica e camundongos virgens foi significativamente diferente. A coisa mais importante a lembrar ao tentar este procedimento é que você está visando os ligamentos ao redor da coluna, não o músculo. O modelo de dor lombar crônica fornece uma ferramenta confiável para avaliar uma variedade de novas pesquisas, farmacológicas e outras potenciais terapêuticas.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método não invasivo para induzir dor crônica nas costas em camundongos por até 10 semanas, que pode ser realizado rápida e confiavelmente com treinamento mínimo. A técnica concentra-se em reconhecer a diferença entre injeção no ligamento e no músculo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Modelos Animais
- Pesquisa sobre Dor
Fundamentos
- Dor crônica nas costas é um problema de saúde significativo.
- Modelos animais são essenciais para estudar mecanismos de dor.
- Métodos confiáveis para induzir dor em camundongos são necessários para a pesquisa.
- Este protocolo visa fornecer uma abordagem simples para pesquisadores.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método rápido para induzir dor nas costas em camundongos.
- Facilitar a pesquisa sobre mecanismos de dor crônica.
- Minimizar o treinamento necessário para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Injeção intraligamentar de ativador urinário do plasminogênio.
- Uso de uma superfície plana estéril para posicionamento do camundongo.
- Estação de recuperação com almofada térmica para cuidados pós-injeção.
- Técnica para identificar o local correto de injeção através da resistência.
Principais Resultados
- O método induz de forma confiável dor crônica nas costas em camundongos.
- Treinamento mínimo é necessário para implementação bem-sucedida.
- A técnica de injeção pode ser dominada com a prática.
- Os resultados podem ser observados por até 10 semanas.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma abordagem direta para indução de dor.
- Ele apoia pesquisas em andamento sobre mecanismos de dor crônica.
- Estudos futuros podem se basear neste método para várias aplicações.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Persistent lower back pain remains a major translational challenge in pain therapeutics, with limited preclinical models that accurately reflect chronicity and behavioral comorbidities. The urokinase-type plasminogen activator-induced mouse model enables rapid, reproducible induction of long-lasting back pain, supporting mechanistic de-risking and target validation for novel analgesic candidates. This model addresses a critical inflection point in the pain drug discovery pipeline by providing a robust platform for quantitative, cross-functional evaluation of therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pain pathway mechanisms and functional target validation in a disease-relevant context.
- Supports biological de-risking by modeling persistent pain and associated behavioral phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in target selection through quantifiable, reproducible endpoints.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for screening analgesic compounds against chronic pain phenotypes.
- Standardizes behavioral assays for mechanical, thermal, and cold hypersensitivity, as well as anxiety and depression-like measures.
- Enables reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints, including gait disturbance and affective comorbidities, for translational biomarker development.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by modeling persistent pain states.
- Provides risk-adjusted advancement criteria for candidate therapeutics targeting chronic pain.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and lead identification with translationally relevant behavioral outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for pain mechanisms using quantifiable behavioral endpoints.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible outputs for compound screening and comparative analysis.
- Analytics: Provides mechanical withdrawal thresholds, latency measurements, and behavioral scores for robust statistical analysis.
- Translational Research: Models clinically relevant pain and comorbidities, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for repeated use across pain research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pain target validation.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable induction of persistent pain phenotypes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of analgesic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in precise in vivo injection and behavioral assay execution.
- Needs access to specialized instrumentation for behavioral and sensory testing.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis.
- Adaptable across mouse strains but may require optimization for specific genetic backgrounds.
- Limitations include the need for careful injection technique to avoid off-target effects.
