Name: In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo enteróide apical-out para enterocolite necrotizante in vitro. Este método permite acessar a superfície apical e testar terapêuticas orais de forma eficaz em condições inflamatórias intestinais.

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Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos Institutos Nacionais de Saúde. O HC é apoiado pela concessão P20GM134973 dos Institutos Nacionais de Saúde. A KB é apoiada pela Fundação Hospitalar Infantil (CHF) e pela Fundação Presbiteriana de Saúde (PHF). Agradecemos ao Laboratório de Biologia Molecular e Pesquisa de Citometria da OUHSC pelo uso da Instalação Central, que forneceu imagens confocal.

Todos os procedimentos animais deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oklahoma Health Sciences Center. Amostras de conveniência do intestino delgado de um primata não humano pré-médio (NHP, 90% de gestação, babuíno de oliva, Papio anubis) foram obtidas após eutanásia para estudo separado (Protocolo nº 101523-16-039-I).
1. Estabelecimento do modelo enteroid nec-in-a-dish apical-out
<ol><li>Preparação de mídias e tratamentos enteróides NOTA: Uma vez preparada seguindo a técnica asséptica padrão, a mídia pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.<ol><li>Prepare a mídia livre de antibióticos (AFM) misturando 50 mL de mídia de crescimento organoide humano com 50 mL de suplemento organoide (ver Tabela de Materiais). Prepare 5 mM ácido etilenodiaminatotraacético/1x salina tamponada de fosfato (EDTA/PBS) adicionando 100 μL de 0,5 M EDTA a 9.900 μL de PBS.</li>
		<li>Chill Dulbecco's modified eagle's medium/nutrient Ham's mistura F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) a 2-8 °C.</li>
		<li>Prepare a solução de estoque TNF-α suspendendo 100 μg de pó de α TNF em 1 mL de PBS 1x. Diluir ainda mais o estoque de TNF-α para 20 ng/mL e 50 ng/mL concentrações usando AFM como solvente. Prepare a solução de estoque LPS suspendendo 2 mg de LPS em 1 mL de 1x PBS. LpS de estoque diluído para 100 μg/mL e 200 μg/mL usando AFM como solvente.</li>
	</ol></li>
	<li>Invertendo a polaridade dos enteróides 3D NOTA: O procedimento a seguir destina-se à reversão de uma única placa de cultura de tecido de fundo plano de 24 poços em duas placas de cultura de tecido de apego ultra-baixo de 24 poços. As placas de cultura tecidual devem ser aquecidas a 37 °C por pelo menos 30 minutos antes do uso. A derivação de enteróides 3D basolateral foi alcançada como descrito anteriormente por muitos grupos35,36, com pequenas modificações para mídia (detalhado acima). O procedimento geral de derivação enteróide não difere do dos humanos. Resumindo, o tecido excisado é lavado, cortado em pequenos fragmentos e incubado no tampão de interrupção celular. A solução celular é então executada através de um coador de células de 70 μM, resultando em criptas que são banhadas a uma alta densidade.<ol><li>Aspirar mídia de cada poço de uma placa de 24 poços de enteróides basolaterais 3D estabelecidos.</li>
		<li>Adicione 500 μL de EDTA/PBS gelado de 5 mM a cada poço da placa de 24 poços e interrompa suavemente a cúpula da membrana do porão/ECM, tubulando para cima e para baixo com uma pipeta p200 um mínimo de 5x-6x.</li>
		<li>Transfira o conteúdo de quatro poços para um tubo cônico de 15 mL e adicione 8 mL de EDTA/PBS gelado ao tubo cônico. Transfira os 20 poços restantes da mesma forma.</li>
		<li>Incubar tubos cônicos de 15 mL a 4 °C por 1h em uma plataforma rotativa ou agitador a 330 rpm. Após a incubação de 1 h, centrifugar os tubos cônicos a 300 x g por 3 min a 4 °C. Remova e descarte o sobrenatante de cada tubo.</li>
		<li>Combine e lave as pelotas celulares com 5 mL de DMEM/F12 e distribua a suspensão da célula em dois tubos cônicos de 15 mL.</li>
		<li>Pelota as células por centrifugação a 300 x g por 3 min a 4 °C. Remova o supernatante e adicione 12 mL de AFM a cada tubo, garantindo que as pelotas celulares sejam resuspendidas.</li>
		<li>Pipeta 500 μL da suspensão enteróide em cada poço de duas placas de fixação ultra-baixas de 24 poços.</li>
		<li>Incubar as placas a 37 °C e 5% de CO2 por 2-5 dias ou até que as enteroids tenham invertido a polaridade.</li>
		<li>Para verificar a reversão enteróide, primeiro estabeleça a coloração imunofluorescente confirmatória e o tempo médio de reversão (~3 dias), depois confirme a reversão da polaridade usando uma visualização básica do microscópio de luz. Enteroids apical-out são muito celulares na aparência, enquanto enteróides basolaterais são frequentemente dominados pela presença de um grande lúmen central ou brotação (ver Figura Suplementar 1). NOTA: Uma vez padronizado o procedimento, a taxa de conversão para apical-out normalmente excede 95%. O uso de enteróides apical-out é destinado como um experimento terminal, embora seja teoricamente possível passar enteróides apical-out em um pequeno número de enteróides basolaterais.</li>
	</ol></li>
	<li>Apical-out NEC-in-a-dish NOTA: Uma vez que os enteróides tenham invertido a polaridade, use as culturas em experimentos subsequentes rapidamente, pois sua longevidade na conformação apical-out não foi confirmada além de 3-4 dias. Para o modelo nec-in-a-dish seguinte, os enteróides foram tratados por 24 horas, depois coletados imediatamente depois e preservados para experimentos a jusante.<ol><li>Uma vez que os enteróides tenham visualmente invertido polaridade com pelo menos 95% de eficiência, remova as placas da incubadora e colete oito poços de uma placa de 24 poços em um tubo cônico de 15 mL. Como os enteróides apical-out estão em suspensão, basta pipeta a solução enteroid/mídia. Centrifugar o tubo de 15 mL a 300 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Uma vez que as células são pelotas, remova o supernaspecido e resuspenque a pelota celular em 4 mL de AFM misturado com o volume desejado (10 μL aqui para corresponder ao maior volume de tratamento adicionado) de 1x PBS (controle).</li>
		<li>Pipeta 500 μL de suspensão enteróide/PBS/AFM em oito poços de uma placa de fixação ultra-baixa de 24 poços e incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.</li>
		<li>Repetição passos 1.3.1.-1.3.3. para tratamentos TNF-α (20 ng/mL e 50 ng/mL) e LPS (100 μg/mL e 200 μg/mL) em normoxia. Para todos os tratamentos de hipóxia, repita as etapas 1.3.1.-1.3.3., mas coloque a placa em uma incubadora separada a 37 °C, 5% CO2 e 1% O2 por 24 h. NOTA: Passo 1.3.4. pode ser feito simultaneamente com as Etapas 1.3.1.-1.3.3, mas, para maior clareza, o procedimento acima foi separado pelo tratamento, a fim de reduzir a complexidade.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coloração imunofluorescente e microscopia confocal
<ol><li>Elaboração de soluções de coloração<ol><li>Prepare 0,1% Triton X-100 misturando 7 μL de Triton X-100 em 1x PBS a um volume final de 7 mL. Prepare PBST (PBS-Tween) adicionando 30 μL de Tween-20 a 1x PBS a um volume final de 30 mL.</li>
		<li>Prepare 10% de soro de burro normal (NDS)/PBST adicionando 700 μL de NDS a 6,3 mL de PBST. Prepare 1% NDS/PBST adicionando 70 μL de NDS ao PBST a um volume final de 7 mL. NOTA: O soro de burro foi usado aqui para se correlacionar com o hospedeiro de anticorpos secundários. No entanto, as espécies de soro de bloqueio devem corresponder às espécies de anticorpos secundários, a fim de bloquear adequadamente a ligação não específica.</li>
	</ol></li>
	<li>Manchas (Dia 1)<ol><li>Transfira o conteúdo de quatro poços de uma placa de 24 poços para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL. Repita para todos os poços/tratamentos desejados, com cada tratamento em um tubo separado. Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C. Uma vez que os enteróides são pelotas, remova o supernatante.</li>
		<li>Resuspenda as pelotas de célula em 300 μL de 4% de formaldeído fixador por 30 min a temperatura ambiente (RT). Depois de 30 min, centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C, remover o supernasal e lavar a pelota com 500 μL de estéril, RT 1x PBS.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C. Remova o supernasal e adicione 500 μL de 0,1% Triton X-100, e deixe sentar por 1h no RT.</li>
		<li>Depois de 1h, centrifufique os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C e remova o sobrenatante. Lave com 500 μL de 1x PBS e coloque os tubos em um rotador ou agitador a 200 rpm por 15 min a 2-8 °C. Repita isso um total de 4x.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C e remover o sobrenatante. Adicione 500 μL de 10% NDS/PBST e incubar na RT por 45 min. Durante a incubação, prepare soluções primárias de anticorpos combinando 20 μL de anticorpo anti-villin recombinante, 10 μL de anticorpo E-cadherin e 1970 μL de 1% NDS/PBST para oito poços de uma placa de 24 poços.</li>
		<li>Após a incubação de 45 min, centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C. Coloque os tubos no gelo. Remova o supernatante e substitua por 250 μL de solução de anticorpos primários. Incubar os tubos durante a noite a 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Manchas (Dia 2)<ol><li>Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C e remover o sobrenatante. Adicione 250-500 μL de PBST a cada tubo, dependendo do tamanho da pelota, e coloque no rotador ou agitador a 200 rpm por 1h a 2-8 °C. Repita a lavagem PBST 4x.</li>
		<li>Prepare a solução de anticorpos secundários adicionando 52 μL de Cy3 burro anti-coelho IgG (H + L) a 50% glicerol e 5,2 μL de anti-rato de burro verde fluorescente 488 anticorpos secundários a 5142,8 μL de 1% NDS/PBST.</li>
		<li>Após a última lavagem pbst e centrifugação, remova o sobrenatante dos tubos. Dispense 200 μL de solução de anticorpos secundários para cada tubo e incubar no escuro durante a noite a 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem de enteróides apical-out manchados (Dia 1)<ol><li>Leve o montador à base de glicerol contendo corante nuclear azul para RT acima de 1 h.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C. Remova 100 μL do supernante e resuspense as células no restante ~100 μL de supernante. Transfira a suspensão celular para tubos de 0,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 s para pellet as células. Remova o supernatante e resuspende as pelotas celulares em 100 μL de mancha de ácido nucleico vermelho distante. Incubar os tubos na RT por 10 minutos.</li>
		<li>Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 s para pellet as células. Remova o supernasciente e resuspense as pelotas de célula em 100 μL de 1x PBS. Repita para uma segunda lavagem.</li>
		<li>Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 s para pelotar as células e remover 70 μL do supernatante. Resuspenque as células no volume restante do PBS e transfira o conteúdo para um deslizamento de cobertura rotulado (24 mm x 60 mm).</li>
		<li>Aplique 75 μL de montagem diretamente na amostra e remova quaisquer bolhas com uma ponta de pipeta. Deixe as tampas curarem durante a noite (18-24 h) no RT no escuro.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem de enteróides apical-out manchados (dia 2)<ol><li>Depois de curar durante a noite, aplique uma camada fina (~15 μL) de glicerol nas tampas. Monte a tampa no deslizamento de vidro e pressione suavemente no lugar. Toque para remover quaisquer bolhas entre o deslizamento e o slide.</li>
		<li>Deixe que a mancha de cobertura seja definida em RT no escuro por um mínimo de 2h, antes de fotografar a ampliação de 20x com um microscópio confocal. Para visualização microscópica de enteróides utilizando vários métodos de aquisição confocal, consulte Lallemant et al.37.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação imunofluorescente NOTA: Este método determina a fluorescência total corrigida removendo o sinal de fundo usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).<ol><li>Abra as imagens confocal no ImageJ e delineie a área desejada com a ferramenta região de interesse (ROI).</li>
		<li>Defina parâmetros definidos pelo usuário navegando para analisar > definir medidas. Selecione Área > Densidade Integrada > Valor Cinza Médio na guia Configurações.</li>
		<li>Navegue até analisar > Medida. Uma janela pop-up aparecerá contendo as medidas. Copie e cole essas medidas em uma planilha.</li>
		<li>Para subtrair o sinal de fundo, selecione uma pequena área não fluorescente da imagem. Navegue até Analisar > Medida para aquela região. Uma janela pop-up aparecerá contendo as medidas. Copie e cole a saída em uma planilha.</li>
		<li>Multiplique a área da célula selecionada pela fluorescência média das leituras de fundo e subtraia a soma da densidade integrada para calcular a fluorescência celular total corrigida (CTCF). Repita as etapas acima para todas as imagens de interesse, mantendo registros em uma planilha ou pacote de software estatístico (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Viabilidade celular NEC-in-a-dish
<ol><li>Tratamentos enteróides<ol><li>Estabeleça o modelo NEC-in-a-dish apical-out por 24 h, como no Passo 1.</li>
		<li>Degelo da viabilidade celular ensaio reagente durante a noite a 4 °C. No dia do ensaio, leve o reagente para RT 30 min antes de usar. Inverta o reagente para misturar.</li>
		<li>Antes de realizar o ensaio, remova 100 μL de mídia de cada poço, deixando os 400 μL restantes. Adicione 400 μL de reagente de ensaio de viabilidade celular a cada poço.</li>
		<li>Misture vigorosamente bem o conteúdo em um agitador de placas em RT por 5 min a 200 rpm para induzir a lise celular. Após o tremor, incubar a placa na RT por mais 25 minutos.</li>
		<li>Após 25 min de incubação, misture o conteúdo de um poço através de pipetagem e transfira 200 μL dos 800 μL para um único poço de uma placa de 96 poços, opacos, poliestireno, de fundo claro. Repita para os 600 μL restantes, criando quatro réplicas técnicas por poço. Transfira o conteúdo restante de cada poço da placa de 24 poços para uma placa de 96 poços desta maneira.</li>
		<li>Utilizando um leitor de placas capaz de luminescência, registos de integração de 0,25 ms e compare os valores relativos entre os tratamentos. Alternativamente, compare a luminescência do tratamento com um padrão de triptofato de adenosina (ATP).</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar e não têm conflitos de interesse.

O desenvolvimento recente de modelos enteróides derivados de criptes epiteliais intestinais permite um tecido in vitro mais fisiologicamente relevante no qual estudar a patogênese de enterocolite necrosante. Apesar de incluir todos os principais tipos de células diferenciadas do epitélio intestinal, os enteróides 3D ainda estão sujeitos a várias limitações significativas. Os enteróides convencionais de saída basolateral são suspensos em cúpulas de hidrogel 3D ECM, a composição e a densidade das quais podem limit...

A enterocolite necrosante (NEC), doença inflamatória grave do intestino delgado que ocorre em até 10% dos bebês prematuros, está comumente associada à alta morbidade e mortalidade 1,2. As taxas de mortalidade que se aproximam de 50% em bebês com baixo peso ao nascer (<1500 g), que necessitam de intervenção cirúrgica, não são incomuns3. Embora a etiologia exata da NEC não seja compreendida atualmente, acredita-se que fatores de risco, como a alimentação de fórmulas, se compõem com anomalias fisiológicas, como disbiose, epitélio intestinal imaturo e barreira intestinal disfuncional, no desenvolvimento da doença 2,4. Apesar do esforço significativo, pouco progresso na prevenção ou tratamento da NEC ocorreu na última década5. Um novo método in vitro para estudar nec e disfunção da barreira epitelial intestinal associada é necessário para avançar na compreensão da patogênese da doença, uma vez que os achados de modelos animais têm, até agora, traduzido mal para a cabeceira6.
Vários modelos in vitro foram utilizados para investigar os mecanismos em jogo durante a NEC. A linha de células epiteliais intestinais humanas, Caco-2, está entre os modelos in vitro mais utilizados da NEC 7,8. As células caco-2 emulam características morfológicas da borda da escova do intestino delgado, mas, como linha celular, não se diferenciam na grande variedade de tipos de células in vivo, incluindo células de cálice produtoras de muco, necessárias para um modelo altamente traduzível. HT-29-MTX, células humanas de adenocarcinoma de cólon, incluem um fenótipo de células de cálice e cálice misto, mas ainda não possuem tipos de células baseadas em criptografia do epitéliointestinal 9. IEC-6 e IEC-18 são linhas celulares não transformadas com uma morfologia imatura semelhante a criptologia ileal, mas não são derivadas do tecido humano, limitando sua capacidade translacional. As linhas de células intestinais FHs 74-Int e H4 são derivadas do tecido fetal humano e não formam junções apertadas ou monocamadas polarizadas10,11, sendo assim imaturas em comparação até mesmo com os bebês mais prematuros suscetíveis à NEC. Tipicamente, os modelos in vitro nec utilizam tratamentos de lipopolisacarídeo (LPS) para induzir o receptor 4 (TLR4), um receptor importante que inicia inflamação intestinal na NEC12. Os danos mediados através do tratamento reativo de espécies de oxigênio (ROS), tipicamente via peróxido de hidrogênio, é frequentemente usado para induzir danos oxidativos semelhantes à NEC e à apoptose13,14. Como principal condutor da inflamação intestinal, o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), um componente a jusante da sinalização inflamatória TLR4, também é comumente utilizado nestes modelos in vitro para imitar a patogênese in vivo 15.
Os organoides, gerados a partir de células-tronco pluripotentes indutíveis (iPSCs), cresceram em popularidade como modelo in vitro do intestino devido à sua capacidade de recapitular a complexa arquitetura in vivo e a composição do tipo celular do tecido do qual são derivados16,17. Um sistema in vitro relacionado, enteroids, são organoides derivados de criptas intestinais resseccionadas que são mais facilmente estabelecidas e mantidas do que organoides derivados do iPSC. Os enteróides são tipicamente cultivados em uma matriz extracelular tridimensional (3D) (ECM) com acesso experimental limitado à superfície celular basolateral. Métodos, como a microinjeção 18,19, foram desenvolvidos para superar essa barreira à superfície apical, mas o acúmulo de detritos celulares e muco sloughed dentro do lúmen torna a microinjeção tecnicamente difícil e inconsistente. Como as plataformas de microinjeção robótica personalizadas não são amplamente acessíveis20, a variabilidade de laboratório para laboratório em capacidade técnica e técnica geral tornam-se variáveis significativas para serem superadas com protocolos de microinjeção. Monocamadas bidimensionais (2D) derivadas de enteróides 3D dissociados, ainda compreendendo todos os principais tipos celulares do epitélio intestinal, permitem o acesso à superfície apical, mas têm sido tradicionalmente difíceis de manter sem uma camada alimentador de miofibroblastsmesenquimais 21. Embora a cultura celular suportes permeáveis possam ser usados para acessar os lados apical e basolateral das monocamadas enteróides sem o uso de miofibroblasts subjacentes, essas inserções requerem excisão e montagem da membrana antes do uso com modalidades como microscopia confocal, resultando em um processo mais exigente e difícil ao usar métodos tradicionais de microscopia22. A NEC foi modelada in vitro usando enteróides 3D tradicionais 23,24,25 e suportes permeáveis 26,27, e a inflamação intestinal foi recentemente replicada com modelos 3D-on-a-chip28,29. Embora os modelos gut-on-a-chip que incorporam microfluidos sejam, de longe, os modelos mais avançados e traduzíveis, essa tecnologia é cara, complexa e inacessível para a maioria dos investigadores30.
Os recentes avanços nas técnicas de enteroid apical-out permitiram acesso mais fácil à superfície apical de enteróides 3D sem correr o risco de danos à integridade estrutural do epitélio in vitro 31,32,33. Os enteróides apical-out compartilham a composição do tipo celular e a função de barreira do epitélio intestinal in vivo, mas, ao contrário dos enteróides 3D típicos, as superfícies apical dessas células enfrentam o meio da cultura, permitindo estudos mais fisiologicamente relevantes sobre absorção de nutrientes, infecção microbiana e secreção luminal31. Uma vantagem adicional dos enteróides apical-out é a capacidade de distribuir homogeneamente agentes experimentais para enteróides. Não é necessário variar os volumes de tratamento com base no tamanho do enteroid, como é com a microinjeção, e a capacidade de manter esses enteróides na cultura de suspensão nega qualquer interferência de ECM na difusão de agente experimental32.
Enterocolite necrosante é uma doença multifatorial que envolve múltiplos tipos de células epiteliais intestinais e uma variedade de fatores ambientais e fisiopacionológicos34. A composição celular variada de enteróides intestinais é uma clara melhora sobre monoculturas na modelagem de uma doença complexa como a NEC. Curiosamente, enquanto uma única exposição inflamatória é muitas vezes suficiente para induzir danos em monoculturas in vitro , os enteróides, como acontece com os modelos de camundongos23, parecem exigir um mínimo de dois componentes inflamatórios para induzir danos semelhantes à NEC6. Aqui, apresentamos um modelo nec-in-a-dish apical-out, usando enteróides apical-out em combinação com hipóxia (uma característica clínica importante da NEC6) e LPS ou TNF-α, como um modelo in vitro melhorado e mais fisiologicamente relevante para estudar respostas epiteliais à inflamação semelhante à NEC e, potencialmente, identificar alvos terapêuticos. Descrevemos um protocolo para reverter a polaridade de pequenos enteróides intestinais 3D, bem como um protocolo de coloração imunofluorescente para identificar a interrupção da barreira epitelial e alterações na expressão da proteína juncional. Finalmente, demonstramos ainda um simples ensaio de viabilidade enteroid para determinar o impacto do nosso modelo NEC-in-a-dish de dois sucessos.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensaio de viabilidade de células 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de 24 poços Corning Costar Ultra-Low Attachment</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura 24 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário Anti-Rato IgG (H+L) Altamente Adsorvido Cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>Anticorpo IgG</td> Anti-Coelho Anti-Coelho <td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Burro, conjugado Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco/Mistura de Presunto Nutriente F-12 (DMEM-F12) com tampão HEPES de 15 mM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo E-caderina (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído 4%, tamponado, pH 6,9</td><td>Millipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Meio de Crescimento Organoide (Humano)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 Microscópio Confocal</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O111:B4, purificados por cromatografia de filtração em gel</td> Lâminas de microscópio <td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Microplaca de fundo plano</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato), 1x [-] cálcio, magnésio, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass Antifade Mountant com NucBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vilina recombinante [SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa; proteína 100 &micro humano recombinante; g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Leitor de Microplacas Multimodo</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Tri-Gas com Camisa de Água Thermo Forma Série II, 184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodeto (642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, 0,5 mL, tampa plana</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

A enterocolite necrosante (NEC) é uma doença devastadora que afeta bebês prematuros, caracterizada por inflamação intestinal e necrose. Os enteróides surgiram recentemente como um sistema promissor para modelar patologias gastrointestinais. No entanto, atualmente utilizados métodos para manipulação enteróide ou não têm acesso à superfície apical do epitélio (tridimensional [3D]) ou são demorados e intensivos em recursos (monocamadas bidimensionais [2D]). Esses métodos muitas vezes requerem etapas adicionais, como a microinjeção, para que o modelo se torne fisiologicamente translacionável. Aqui, descrevemos um protocolo fisiologicamente relevante e barato para estudar nec in vitro , invertendo a polaridade enteroid, resultando na superfície apical voltada para fora (apical-out). Um protocolo de coloração imunofluorescente para examinar a integridade da barreira enteróide e a expressão da proteína juncional após a exposição ao fator de necrose tumoral -alfa (TNF-α) ou lipopólise (LPS) sob condições normóxicas ou hipoxicas também são fornecidos. Também é avaliada a viabilidade de enteróides apical-out 3D expostos a LPS normóxicos ou hipoxicos ou TNF-α por 24 h. Enteroides expostos a LPS ou TNF-α, em combinação com a hipóxia, apresentaram interrupção da arquitetura epitelial, perda de expressão proteica de junção e redução da viabilidade celular. Este protocolo descreve um novo modelo nec-in-a-dish apical-out que apresenta uma plataforma fisiologicamente relevante e econômica para identificar potenciais alvos epiteliais para terapias NEC e estudar a resposta intestinal pré-clusão à terapêutica.

O uso de enteróides para modelar inflamação intestinal, mesmo dentro do contexto de enterocolite necrosante, agora é comum. No entanto, a maioria dos métodos atualmente utilizados ou não tem acesso à superfície apical dos enteróides, negando a relevância fisiológica dos compostos destinados a eventual uso como terapêutica oral, ou são tecnicamente difíceis e demorados, como acontece com as monocamadas derivadas de enteróides. Para aumentar a utilidade dos modelos enteroid in vitro atuais da NEC, invertemos a pol...

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Este protocolo descreve o primeiro modelo apical-out em um prato e é uma melhoria crítica sobre modelos enteroid lateral basal em um prato ao estabelecer modelagem in vitro de potenciais terapêuticas destinadas à administração oral. Este método permite o acesso à superfície apical de enteróides. Os compostos podem ser adicionados à mídia celular e os compostos são tomados apicamente como seriam in vivo.Pesquisadores interessados em estabelecer um sistema in vitro de inflamação intestinal para testar potenciais terapêuticas orais podem achar essa técnica especialmente útil. Tecidos provenientes de diferentes idades e espécies podem exigir maior padronização. Assim, pacientes ao estabelecer tempos de reversão de polaridade podem ser necessários.Para reverter a polaridade dos enteroids 3D aspiram a mídia de cada poço de uma placa de 24 poços de enteróides basolaterais 3D estabelecidos. Adicione 500 microliters de cinco mililitros de gelo frio, EDTA ou PBS a cada poço de uma placa de 24 poços e interrompa suavemente o extrato da membrana do porão ou a cúpula da matriz extracelular, pipeta para cima e para baixo cinco a seis vezes com uma pipeta P 200. Transfira o conteúdo de quatro poços para um tubo narrado de 15 mililitros.Em seguida, adicione oito mililitros de EDTA fria cortar PBS ao tubo. Transfira os 20 poços restantes da mesma forma. Incubar os tubos a quatro graus Celsius por uma hora em uma plataforma rotativa ou agitar a 330 RPM.Após a incubação centrifugar os tubos e descartar o sobrenatante de cada tubo. Combine e lave as pelotas com cinco mililitros de DMEM F12. Em seguida, centrifuse a suspensão das células e remova o sobrenatário antes de adicionar 12 mililitros de meio livre de antibióticos ao tubo, garantindo que as pelotas celulares sejam resuspendidas.Pippet 500 microliters da suspensão enteróide em cada poço de uma placa de fixação 24 bem ultra-baixa. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a cinco dias ou até que as enteroids tenham invertido a polaridade. No primeiro dia, transfira o conteúdo de quatro poços de uma placa de poço de 24 para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro.Repita para todos os poços desejados a cada tratamento em um tubo separado. Centrifugar os tubos e resuspensar a pelota em 300 microliters de 4% de fixação de aldeído à temperatura ambiente. Após 30 minutos lave as pelotas com 500 microliters de PBS.Adicione 500 microliters de 0,1%Triton X 100 aos tubos. Incubar os tubos por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, coloque os tubos em um rotador ou agitador a 200 RPM por 15 minutos a dois a oito graus Celsius.Após a última incubação, adicione 500 microliters de 10% NDS em PBS T e incubar em temperatura ambiente por 45 minutos. Durante a incubação, prepare a solução primária de anticorpos. No dia seguinte, adicione 250 a 500 microliters PBS T aos tubos, dependendo do tamanho da pelota, e coloque-os no rotador ou shaker a 200 RPM por uma hora a dois a oito graus Celsius.Adicione 200 microliters da solução secundária de anticorpos e incubar os tubos a dois a oito graus Celsius no escuro. No dia seguinte, prossiga para a montagem de enteróides apical manchados girando os tubos e removendo 100 microliters de supernascer. Resuspenja as células nos 100 microlitadores restantes de supernadante e transfira a suspensão celular para tubos de 500 microliteres.Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 segundos. Remova o supernatante e resuspenja as pelotas em 100 microliters de temperatura ambiente muito vermelha mancha de ácido nucleico. Após 20 minutos de incubação, centrifugar as células e resuspensar as pelotas em 100 microlitres de PBS.Após a segunda lavagem e centrifugação remova 70 microlitadores do supernatante e resuspenja as pelotas no volume restante de PBS. Em seguida, transfira a suspensão da célula para um deslizamento de cobertura de 24 por 60 milímetros. Aplique 75 microliters de montagem diretamente na amostra e remova quaisquer bolhas com uma ponta de pipeta.Depois de curar durante a noite no escuro, aplique uma fina camada de glicerol nos deslizamentos da tampa, em seguida, monte os deslizes de cobertura sobre o slide de vidro e pressione-o suavemente no lugar. Toque para remover quaisquer bolhas entre o deslizamento da tampa e o slide. Deixe que o deslizamento da tampa se estafina à temperatura ambiente no escuro por duas horas antes de imaginar os enteróides em 20 vezes a ampliação com um microscópio confocal.Para tratamentos enteróides, estabeleça uma enterocolite necrosante apical em um modelo de prato por 24 horas, conforme descrito no manuscrito do texto. Antes de realizar o ensaio, remova 100 microliters de mídia de cada poço deixando os 400 microliters restantes. Adicione 400 microliters de reagente de ensaio de viabilidade celular a cada poço.Misture vigorosamente o conteúdo em um agitador de placas por cinco minutos a 200 RPM para induzir a lise celular. Em seguida, transfira 200 microliters para um único poço de uma placa de fundo 96 bem clara. Repita para os 600 microliters restantes criando quatro réplicas técnicas por poço.Utilizando um leitor de placas capaz de luminescência, registos de integração de 0,25 milissegundos e compare os valores relativos entre os tratamentos. A coloração representativa da imunofluorescência de controle confirmou a localização apical dos núcleos em direção ao lúmen e a detecção de vilão na borda externa do epitélio. Em comparação com o controle, a exposição à lipo polissacarídeo, necrose tumoral alfa, ou hipoxia por si só não induziu alterações expostas na morfologia celular bruta E-cadherina ou localização de vilão ou intensidade fluorescente.O tratamento com polissacarídeo lipo ou tumor necrose alfa em combinação com a arquitetura epitelial interrompida por hipóxia e demonstrou uma perda significativa de junção de adesão e expressão de proteína de borda de escova revelada pela perda da audição do ECA e da coloração do vilão. A viabilidade celular apical foi determinada sob condições normóxicas ou hipoxicas. Sob condições normóxicas em comparação com o controle lipo polissacarídeo ou necrose tumoral alfa não afetou significativamente a viabilidade celular dos enteróides.No entanto, reduções significativas na viabilidade foram observadas em lipo polissacarídeo ou necrose tumoral alfa em combinação com hipóxia em comparação apenas com hipóxia. Ao mesmo tempo em que estabelece apical fora em um modelo de prato. Lembre-se de manter edta no gelo de suspensão celular frio.Isso aumentará a reversão da polaridade e garantirá que todo o ECM seja devidamente liquefeito e removido. Outras aplicações a jusante, como QPCR, RNA-seq, manchas ocidentais ou avaliações funcionais de permeabilidade de barreira podem ser realizadas ainda mais para caracterizar a resposta à sinalização inflamatória na hipóxia.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra o desenvolvimento da doença enterocolite necrosante em um modelo enteróide neonatal de origem humana induzido pelo tratamento com lipopolissacarídeos. Este modelo ajuda a estudar a fisiopatologia intestinal.

Indução de Enterocolite Necrosante em Modelo Enteróide Epitelial Humano

Enteroids estão emergindo como um novo modelo no estudo de doenças humanas. O protocolo descreve como simular um modelo enteroid de humano enterocolite necrosante usando lipopolissacarídeo (LPS) tratamento do enteroids gerados a partir de tecido neonatal. Enteroids coletados demonstram alterações inflamatórias parecido com aqueles vistos em enterocolite necrosante humana.

Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante

A enterocolite necrosante (NEC) é a doença gastrointestinal (GI) mais grave que ocorre frequentemente em bebês prematuros, especialmente bebês com baixo peso ao nascer, com alta mortalidade e patogênese pouco clara. A causa da NEC pode estar relacionada a anormalidades inflamatórias do sistema de regulação imunológica. Um modelo animal NEC é uma ferramenta indispensável para a pesquisa imunológica da doença NEC. Modelos animais NEC geralmente usam camundongos neonatais C57BL/6J; Os camundongos...

Um modelo de rato BALB/c neonatal de Enterocolite Necrotizante

Este protocolo descreve um método para estabelecer e executar um ensaio de arranhão em monocamadas bidimensionais (2D) derivadas de enteróides tridimensionais (3D) isolados de íleo de primatas não humanos.

Efeito do ácido hialurônico 35 kDa em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides

Este protocolo detalha o estabelecimento de enteróides, um modelo intestinal tridimensional, a partir do tecido intestinal fetal. Imagens imunofluorescentes de biomarcadores epiteliais foram utilizadas para caracterização do modelo. A exposição apical de lipopolissacarídeos, uma endotoxina bacteriana, utilizando a técnica de microinjeção induziu a permeabilidade epitelial de forma dose-dependente medida pelo vazamento de dextrano fluorescente.

Testando a permeabilidade epitelial em enteroides derivados de tecido fetal

O presente protocolo descreve um método que utiliza o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out para determinar a permeabilidade intestinal. Este método pode ser usado para determinar a permeabilidade paracelular em enteróides que modelam doenças inflamatórias intestinais, como enterocolite necrosante.

Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out

Escherichia coli causa sepse em neonatos que ingerem a bactéria na época do nascimento. O processo envolvido na capacidade da E. coli de viajar do trato entérico para a corrente sanguínea é pouco compreendido. Este modelo in vitro avalia a capacidade das cepas de E. coli de viajar através das células epiteliais intestinais.

Avaliação da Transcitose Intestinal de Isolados de Bacteremia de Escherichia coli Neonatal

Este protocolo descreve um modelo in vitro de enterocolite necrosante (ECN), que pode ser usado para estudos mecanísticos da patogênese da doença. Apresenta um chip microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados do intestino neonatal humano, células endoteliais e o microbioma intestinal de um neonato com ECN grave.

Modelo Microfluídico de Enterocolite Necrosante Incorporando Enteróides Intestinais Neonatais Humanos e um Microbioma Disbiótico

Este protocolo descreve um modelo de camundongo neonatal de enterocolite necrosante (NEC) e subsequente isolamento de células imunes da lâmina própria do intestino delgado murino neonatal.

Um modelo de camundongo neonatal de enterocolite necrosante e isolamento da lâmina própria para perfil de células imunes

Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Aprenda a desenvolver um modelo enteróide apical-out para enterocolite necrotizante in vitro. Este método permite acessar a superfície apical e testar terapêuticas orais de forma eficaz em condições inflamatórias intestinais.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

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