Name: Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: Aprenda a aplicar espectroscopia CARS para imagem de mielina em fatias cerebrais. Esta técnica de microscopia óptica permite visualizar bainhas de mielina e combinar com imunofluorescência, auxiliando pesquisas sobre esclerose múltipla e autismo.

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Suportado por NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) e NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 e FRAXA (McCullagh). A imagem CARS foi realizada na parte do núcleo de microscopia de luz avançada do Centro de Neurotecnologia do Campus Médico Anschutz da Universidade do Colorado, apoiada em parte pelo NIH P30 NS048154 e NIH P30 DK116073.

Todos os experimentos cumpriram todas as leis aplicáveis, diretrizes do National Institutes of Health e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado em Anschutz.
1. Animais
<ol><li>Use camundongos C57BL/6J (estoque #000664) (Mus musculus ) obtidos do Laboratório Jackson ou gerbilos mongóis (Meriones unguiculatus) originalmente obtidos do rio Charles.</li>
</ol>2. Preparação de tecidos
<ol><li>Para perfusão transcárdica, overdose de espécies de roedores de interesse com pentobarbital (120 mg/kg de peso corporal) e transcardialmente perfundi-los com solução salina tamponada com fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) seguido de4% de paraformaldeído (PFA)24.<ol><li>Especificamente, abra o abdômen e a caixa torácica usando uma tesoura e segure a caixa torácica no lugar com pinça hemostática de Kelly para expor o coração.</li>
		<li>Insira uma agulha de 23 GA conectada a uma bomba de perfusão no ventrículo esquerdo e corte rapidamente o átrio direito usando uma tesoura fina.</li>
		<li>Administrar PBS através da bomba de perfusão e da agulha no coração por 10 minutos para limpar o cérebro e o corpo de sangue.</li>
		<li>Mude a bomba de perfusão para PFA a 4% por 10 minutos e verifique a rigidez dos membros e da cauda para confirmar o sucesso da perfusão.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a perfusão, decapite os animais e remova o cérebro do crânio. Mantenha os cérebros durante a noite em 4% de PFA antes de transferir para PBS. Incorpore os caules cerebrais em agarose a 4% (em PBS) e corte coronalmente usando um vibratome de 200 μm de espessura.</li>
</ol>3. Coloração
<ol><li>Corte livre de cortes flutuantes para Nissl, para visualizar corpos celulares (1:100), em meio de anticorpos (meio AB: tampão fosfato 0,1 M (PB: 50 mM KH 2 PO 4,150 mM Na2HPO4), NaCl 150 mM, Triton-X 3 mM, albumina sérica bovina a 1% (BSA)) por 30 min à temperatura ambiente em um agitador de laboratório padrão25.<ol><li>Proteja as seções da luz usando papel alumínio e/ou uma tampa. Comprimentos de onda de 550 nm ou menos são compatíveis com imagens CARS (Figura 1). NOTA: Embora não esperemos que o Triton-X ou outros reagentes tenham um impacto na imagem CARS de lipídios, controles adicionais com meios de anticorpos específicos podem ser justificados.</li>
	</ol></li>
	<li>PONTO DE PAUSA: Armazene seções flutuantes livres (enquanto protegidas da luz) no PBS até a geração de imagens. Uma vez seccionado, imagens do cérebro seções dentro de 2 semanas.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig01.jpg"> Figura 1: A imagem CARS pode ser combinada com imagens imunofluorescentes. Os gráficos mostram que a imagem CARS ocorre no espectro de sinal vermelho de 660/640 nm26. Esse comprimento de onda está suficientemente distante da faixa verde, azul ou UV, permitindo a combinação do sinal CARS com a imunofluorescência nessas faixas. Especificamente, o gráfico também indica a excitação e a emissão de Nissl marcada com fluoróforo azul, que foi combinado com CARS durante a coleta de resultados representativos para esta publicação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Imagens
NOTA: A configuração do laser CARS contém um laser de fibra que fornece o relógio de 80 MHz e um laser OPO (Optical Parametric Oscillator) com uma faixa ajustável de 770-990 nm com o feixe Stokes fixado em 1031 nm, que são necessários para coletar o sinal CARS. Há uma abertura para ambos os feixes.
<ol><li>Antes de trazer amostras para o microscópio, ligue e aqueça o laser CARS por pelo menos 1 h, alinhe o laser CARS e Koehler a óptica do condensador e o diafragma do microscópio para imagens CARS para frente. NOTA: Esta etapa é fundamental para o bom funcionamento da microscopia CARS.<ol><li>Para o alinhamento espacial dos dois feixes de laser (bomba e stokes), acesse os dois PSDs internos (detectores sensíveis à posição) através da GUI do laser CARS.</li>
		<li>Alcance o alinhamento temporal usando a função de atraso na GUI do laser CARS, que pode ajudar a sobrepor os pulsos dos dois lasers (bomba e stokes) que têm dispersões diferentes devido aos seus diferentes comprimentos de onda. Portanto, tanto a sobreposição temporal quanto a espacial dos feixes de bomba e stokes são feitas com a entrada do usuário através da GUI.</li>
		<li>Ajuste o periscópio externo (dois últimos espelhos da configuração) para centralizar os dois lasers espacialmente sobrepostos nos espelhos de cabeça de varredura do microscópio.</li>
		<li>Para uma melhor detecção CARS não descarada, certifique-se de que o condensador é Koehler-ed (o que significa que o condensador está centrado e focado no diafragma para obter iluminação uniforme)</li>
	</ol></li>
	<li>Para imagens confocais de imunofluorescência e imagens CARS, ajuste o laser CARS, com detectores não descantados (NDDs) CARS para frente e epi, incorporando um microscópio confocal equipado com lasers visíveis para imagem de fluorescência (Figura 2).</li>
	<li>Coloque seções em um prato de cultura com coverslip (para microscopia invertida), PBS para evitar que o tecido seque e um peso de vidro para manter o tecido perto do coverslip.</li>
	<li>Tire z-stacks ou imagens únicas com um objetivo de água corrigido no infravermelho de 60X, 1,2 NA, que serve para a coleta do sinal CARS na direção epi e através de um condensador de 0,55 NA na direção para a frente para imagens de áreas cerebrais, como o núcleo medial do corpo trapézio (MNTB).<ol><li>Tire as imagens CARS em aproximadamente 600 mW de bomba/sonda e 300 mW de Stokes, usando a GUI do laser CARS. Esses valores de potência do laser são medidos internamente pelo sistema. As potências de ambos os lasers no local da amostra são inferiores a 25 mW e seguras para a amostra de tecido.</li>
		<li>Sobreponha a bomba e os feixes de Stokes espacial e temporalmente. Ajuste o OPO para 797,2 nm. Isso produz um comprimento de onda CARS de 650 nm. Devido ao nível de energia mais alto, o retorno resultante ao estado fundamental é anti-Stokes (deslocado para o azul) para a excitação.</li>
		<li>Capture o sinal CARS em detectores epi ou encaminhados não desdecantados usando filtros passa-banda (640-680 nm) seguidos de detecção sequencial do rótulo de imunofluorescência (neste caso, marcado fluorescentemente Nissl). NOTA: O marcador de soma neuronal Nissl não é capturado no filtro passa-banda CARS 640-680 nm, permitindo a combinação de fluorescência e imagem CARS nas imagens apresentadas abaixo.</li>
		<li>O CARS e a fluorescência não compartilham PMTs. Use essas configurações para obter o sinal lipídico ideal para visualizar seletivamente a mielinização na área do cérebro. CUIDADO: Proteja o usuário do feixe de laser</li>
	</ol></li>
	<li>Salve as imagens como arquivos .oib, que podem ser importados para um programa de análise de imagem para quantificação adicional (Figura 3).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama de instrumentos CARS mostrando lasers CARS (setas vermelhas) e detecção epi e forward não descanned (NDD) incorporados em uma varredura a laser confocal. No NDD para a frente adquirimos CARS para ligações C-H (setas vermelhas escuras) e SHG (segunda generatina harmônica) a 515 nm (seta laranja). Em epi NDD, adquirimos CARS para ligações C-H (setas vermelhas escuras) e autofluorescência 2PE (emissão de dois fótons) (seta azul clara). Sequencialmente, imagens confocais de fluorescência podem ser adquiridas (setas verdes para laser visível, setas azuis para detecção confocal). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig03v2.jpg"> Figura 3: O CARS pode iluminar a mielina (magenta) no tecido cerebral (tronco encefálico) enquanto também cria imagens de Nissl (ciano) ou marcadores fluorescentes. Os dois painéis mostram resultados representativos de um cérebro de gerbil mongol (imagem única M. unguiculatus, Figura 3A,C,E) e rato (projeção máxima de pilha z M. musculus, Figura 2B,D,F), indicando que esta técnica pode ser usada em todas as espécies. Figura 3A,B mostrando Nissl em ciano, C,D mostram o sinal CARS em magenta, E,F combinam os sinais Nissl e CARS com cada painel para gerbil ou mouse, respectivamente. Ambos os conjuntos de imagens mostram uma seção do núcleo medial do corpo trapézio (MNTB) no tronco cerebral. Os neurônios do MNTB recebem entradas de axônios fortemente mielinizados, que terminam no cálice de held, um tipo de sinapse gigante27. A barra de escala é de 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig03largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Um crescente corpo de literatura enfatiza o papel da mielina na função cerebral 13,16,21,28. Além disso, sabemos que a espessura da mielinização e o padrão de mielinização podem mudar em várias condições neurológicas, como esclerose múltipla (revisada em29), envelhecimento (revisada em30), autismo 20,31 e muitas ...

Os potenciais de ação são a unidade básica de informação no cérebro, e a propagação do potencial de ação através dos axônios constitui um pilar do processamento da informação 1,2,3. Os neurônios normalmente recebem entradas aferentes de vários outros neurônios e integram essas entradas dentro de uma determinada janela de tempo estreita 4,5. Portanto, os mecanismos de propagação do potencial de ação nos axônios têm recebido uma quantidade significativa de atenção dos pesquisadores.
Ao se propagar através de um axônio, um potencial de ação é regenerado repetidamente ao longo do axônio para garantir uma propagação confiável6. Na maioria dos neurônios de vertebrados mandibulares (gnatohostomas) os axônios são cercados por uma bainha de mielina, que é uma substância rica em lipídios produzida por oligodendrócitos próximos ou células de Schwann, que são tipos de células gliais (revisadas em 7,8). Esta bainha de mielina isola eletricamente o axônio, reduzindo sua capacitância e permitindo a propagação do potencial de ação de forma eficiente, rápida e com menor consumo de energia. A mielina não cobre o axônio uniformemente, mas revestia o axônio em segmentos que têm lacunas curtas entre eles, chamados de nós de Ranvier (revisado em 9,10). Tanto a espessura da mielinização, que controla o nível de isolamento elétrico de um axônio, quanto o espaçamento dos nós de Ranvier, que controlam a frequência com que os potenciais de ação são regenerados ao longo de um axônio, influenciam a velocidade de propagação do potencial de ação (revisado em11).
Há um grande corpo de literatura sugerindo que a espessura da mielinização afeta a velocidade de propagação do potencial de ação em axônios12,13,14. Além disso, alterações na mielinização axônica podem resultar em vários déficits do SNC 15,16,17,18,19,20,21. Portanto, não é surpreendente que o foco de muitos esforços de pesquisa envolva a medição e caracterização da mielinização axônica. As medições da espessura da mielina têm sido mais comumente feitas com microscopia eletrônica, uma técnica que requer uma quantidade significativa de preparação tecidual e é difícil de usar em combinação com a imuno-histoquímica. No entanto, existe também uma técnica mais rápida e simples para medir a mielinização axônica que é baseada na Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS). Um laser CARS pode ser sintonizado em várias frequências e, quando sintonizado em frequências adequadas para excitar lipídios, a mielina pode ser fotografada sem a necessidade de rótulos adicionais22. A imagem lipídica pode ser combinada com imuno-histoquímica padrão, de modo que os lipídios possam ser fotografados juntamente com vários canais fluorescentes23. A mielinização por imagem com CARS é significativamente mais rápida do que a microscopia eletrônica e tem uma resolução que é, embora menor que a EM, suficiente para detectar até mesmo pequenas diferenças na mielinização no mesmo tipo de axônios.

<table><tbody><tr><td><forte>Anestésico:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL seringa descartável com agulha 27 GA x 0.5"</td><td>Exel int</td><td>260040</td><td></td></tr><tr><td>Fatal +</td><td>Vortech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgery:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors - 8mm Ferramentas</td><td>de Ciência Fina</td> de Ponta <td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinças padrão</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF994 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras Finas - Sharp</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13019-14</td><td></td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponta da agulha, 23 GA x 1"</td><td>BD deslizamento de precisão</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Bomba monobase de fosfato de potássio</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>com fluxo variável ou equivalente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td><forte>Dissecação: frasco de </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL com 4% PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colher Química Bochem 180mm</td><td>Bochem</td><td>230331000</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15011-12</td><td></td></tr><tr><td>Par de pinças finas (Graefe)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja rasa de vidro ou plástico, aproximadamente 10" x 10"</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pinças padrão Tesoura Cirúrgica</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>- Blunt</td><td>Fine Science Ferramentas</td><td>14000-20</td><td></td></tr><tr><td>Fatiamento: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, planta</td><td>RPI</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000s</td><td></td></tr><tr><td>placa de</td><td>poço Alkali Sci.</td><td>TPN1048-NT</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Coloração:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB Meio:</td><td></td><td></td> <td>1n 1.000 mL de Millipore H2O</td></tr><tr><td>Tamponado com fosfato (PB):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio Monobase</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio Dibásico</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumina de soro bovino)</td><td>Sigma life science</td><td>A2153-100g</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>x100-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Nissl 435/455</td><td>Invitrogen</td><td>N21479</td><td></td></tr><tr><td>CARS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APE&nbsp; Picoemerald laser</td><td>Física de Picoesmeralda & Elektronik&nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda GmbH (420-520 nm)</td>Filtro passa-banda <td>Chroma Technology</td><td>HQ470/100m-2P</td><td></td></tr><tr><td>(500-530 nm)</td>Filtros <td>passa-banda Chroma Technology HQ515/30m-2P</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(640-680 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ660/40m-2P</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de corte</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>longpass dicróico 565 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>565dcxr</td><td></td></tr><tr><td>longpass dicróico 585 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>585dcxr</td><td></td></tr><tr><td>shortpass dicróico 750 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>T750spxrxt</td><td></td></tr><tr><td>prato de cultura com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>peso do vidro (10 mm x 10 mm haste boro)</td> <td>Allen Scientific Filtro de</td> emissão passa-curta multifotônico Glass Inc <td></td><td></td></tr><tr><td>680 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>ET680sp-2p8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação coerente de espectroscopia raman anti-stokes (cars) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

A espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) é uma técnica classicamente empregada por químicos e físicos para produzir um sinal coerente de vibrações de assinatura de moléculas. No entanto, essas assinaturas vibracionais também são características de moléculas dentro do tecido anatômico, como o cérebro, tornando-o cada vez mais útil e aplicável para aplicações de Neurociência. Por exemplo, o CARS pode medir lipídios por ligações químicas especificamente excitantes dentro dessas moléculas, permitindo a quantificação de diferentes aspectos do tecido, como a mielina envolvida na neurotransmissão. Além disso, em comparação com outras técnicas tipicamente usadas para quantificar a mielina, o CARS também pode ser configurado para ser compatível com técnicas de imunofluorescência, permitindo a co-marcação com outros marcadores, como canais de sódio ou outros componentes da transmissão sináptica. As alterações da mielinização são um mecanismo inerentemente importante em doenças desmielinizantes, como a esclerose múltipla ou outras condições neurológicas, como a Síndrome do X Frágil ou os transtornos do espectro do autismo, é uma área emergente de pesquisa. Em conclusão, o CARS pode ser utilizado de maneiras inovadoras para responder a questões prementes em Neurociência e fornecer evidências de mecanismos subjacentes relacionados a muitas condições neurológicas diferentes.

Uma das maiores vantagens da microscopia CARS em relação a outras técnicas é a compatibilidade com imagens fluorescentes23. A Figura 1 mostra os espectros CARS em comparação com o Nissl marcado com marcador imunofluorescente mostrando pouca ou nenhuma sobreposição nos espectros. A Figura 2 ilustra a configuração do laser para o CARS em combinação com a microscopia confocal. A Figura 3 demonstra duas imagens r...

Visualizar a mielinização é um objetivo importante para muitos pesquisadores que estudam o sistema nervoso. CARS é uma técnica compatível com a imunofluorescência que pode fotografar nativamente lipídios dentro do tecido, como o cérebro, iluminando estruturas especializadas, como a mielina.

Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Esta técnica pode visualizar a mielina em seções de tecido cerebral. A mielinização desempenha um papel importante na condução dos potenciais de ação e a compreensão da mielina nos ajudará a entender a função cerebral. A principal vantagem da técnica CARS sobre, por exemplo, a microscopia eletrônica é que a CARS é uma técnica de microscopia de luz, e pode ser facilmente combinada com outras imagens de fluorescência, como as usadas em imuno-histoquímica.Várias condições médicas são devidas a alterações na mielinização, por exemplo, esclerose múltipla, envelhecimento e autismo. Entender essas alterações nos ajudará a entender as condições médicas subjacentes. Neste caso, o laser CARS é sintonizado para lipídios de imagem ou, especificamente, ligações CH2.No cérebro, a maior fonte de lipídios é a mielina. Assim, esta é uma técnica para a imagem da mielina no tecido cerebral. Deve ser possível usar o mesmo método para outros tipos de tecido quando a imagem lipídios é de interesse.O ajuste e o alinhamento do laser CARS exigem experiência significativa e são melhor realizados por um especialista em laser ou microscopia de luz. Depois de preparar os tecidos, conforme descrito no manuscrito, core seções flutuantes livres para nisel e meios de anticorpos para visualizar os corpos celulares e, em seguida, incube as seções em um agitador de laboratório padrão por 30 minutos à temperatura ambiente. Antes de trazer as amostras para o microscópio, ligue e aqueça o laser CARS por pelo menos uma hora, alinhe o laser CARS sobrepondo espacialmente a bomba e alimentando os feixes de laser e ajuste o atraso entre os dois feixes de laser.Colora a óptica do condensador e o diafragma do microscópio para imagens CARS avançadas e, em seguida, ajuste o periscópio externo para centralizar os dois lasers espacialmente sobrepostos nos espelhos de cabeça de varredura do microscópio. Para melhor encaminhamento CARS detecção não descartada. Certifique-se de que o condensador é atraído por cores.Para imunofluorescência, imagens confocais e imagens de carros, ajuste o laser CARS com detectores não descantados CARS para frente e epi CARS, incorporando um microscópio confocal equipado com lasers visíveis para imagens de fluorescência. Agora, coloque as seções em um prato de cultura com um fundo deslizante de cobertura e PBS para evitar a secagem do tecido. Além disso, use um peso de vidro para manter o tecido perto do deslizamento da tampa.Usando a interface gráfica do usuário, defina os parâmetros de aquisição de imagem para carros e imagens confocais de fluorescência de mísseis. Coloque a amostra no estágio do microscópio, foque a amostra e capture as imagens. Os espectros do CARS variam de 640 a 660 nanômetros e parece não haver sobreposição nos espectros com o marcador imunofluorescente marcado com nisel, indicando que os sinais CARS podem ser usados com sinais imunofluorescentes.O Nisel foi usado para visualizar os corpos celulares de gerbil mongol e cérebros de camundongos, e a imagem do CARS foi usada para visualizar a bainha de mielina, indicando que essa técnica poderia ser usada em todas as espécies. Ambos os conjuntos de imagens mostram uma seção do núcleo medial do corpo trapézio no tronco cerebral. A resolução do CARS é menor do que com o microscópio eletrônico e é da ordem de várias centenas de nanômetros.As imagens podem ser analisadas com um software de análise de imagem padrão, como o ImageJ para quantificar os parâmetros de interesse, por exemplo, espessura ou comprimento da mielina.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A combinação de três único comprimento de onda curto lasers pulsados ​​é usado para gerar espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) e CARS duplamente ressonante (DR-CARS). A diferença entre estes sinais fornece maior sensibilidade para a outra forma difíceis de detectar sinais Raman coerente, permitindo que imagens de fraca dispersores Raman.

Imagem diferencial de estruturas biológicas com Duplamente-ressonante Scattering Anti-Stokes Raman coerente (CARS)

Fonte: Espinoza, R., et al. Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores em tempo real do cérebro de camundongos para diagnóstico de tecidos. J. Vis. Exp. (2022).  O vídeo demonstra imagens de espalhamento Raman estimulado (SRS) de duas cores de seções de tecido cerebral de camundongos. Dois feixes de laser sincronizados são direcionados para a seção de tecido para excitar vibrações moleculares, resultando em uma mudança de intensidade relativa nos feixes. Lipídios e proteínas no...

Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores do tecido cerebral de camundongos

Fonte: McCullagh, E. A., et al. Aplicação de Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS) para mielinização de imagem em fatias de cérebro. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra imagens de fluorescência e espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) para visualizar a arquitetura neuronal no tecido cerebral de roedores. A coloração de Nissl marca os corpos celulares ligando-se ao RNA ribossômico, enquanto a imagem CARS tem como alvo a mielina rica em lipídios por meio de sinais induzidos...

Espectroscopia Raman anti-Stokes coerente para visualizar neurônios mielinizados no tecido cerebral de camundongos

Coherent dispersão anti-Stokes Raman (CARS) Microscopia baseado em vibração inerente de títulos molécula permite imagens de células vivas quimicamente seletiva sem rótulo. Este trabalho apresenta a implementação de uma técnica de microscopia complementar sobre um microscópio de varredura a laser padrão multiphoton baseado em um Ti femtosecond: laser de safira e um laser OPO.

Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope

Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

Apresentamos um protocolo para adquirir imagens químicas com microscopia de dispersão Raman estimulada por banda larga (SRS). Baseado em um microscópio SRS que opera com detecção diferencial de bloqueio multicanal, o protocolo descreve a preparação da amostra, o ajuste do aparelho SRS e a quimiometria para desembaraçar diferentes constituintes de amostras quimicamente heterogêneas.

Multiplex Imagem química baseada em banda larga estimulada raman dispersão microscopia

Utilizando uma plataforma multimodal que combina modalidades de imagem óptica sem rótulo, desenvolvemos um protocolo para visualizar e quantificar a dinâmica e o metabolismo celular. Por meio de imagens via fluorescência multifotônica, geração de segundo harmônico e microscopia de espalhamento Raman estimulada, podemos gerar uma visão holística do ambiente celular e molecular.

Plataforma de imagem óptica multimodal para estudar o metabolismo celular

Aprenda a aplicar espectroscopia CARS para imagem de mielina em fatias cerebrais. Esta técnica de microscopia óptica permite visualizar bainhas de mielina e combinar com imunofluorescência, auxiliando pesquisas sobre esclerose múltipla e autismo.

Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

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