Name: Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro usando placas de cultura revestidas com fosfato de cálcio e PBMCs. Este método melhora a visualização e facilita pesquisas em biologia óssea.

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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Conselho de Bolsas da China [CSC No. 201808440394]. W.C. foi financiado pelo CSC.

O protocolo foi revisado e aprovado pelo comitê de ética local (aprovação nº 287/2020B02).
1. Preparação de placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio
<ol><li>Preparação de solução de estoque de cálcio (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O no buffer Tris)<ol>
<li>Prepare o buffer tris de 1,0 M e ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl.</li>
		<li>Configure um béquer de vidro em um agitador magnético e adicione 100 mL de tampão tris de 1,0 M.</li>
		<li>Pesar 0,368 g de CaCl2·2H2O, 8,0 g de NaCl e 0,305 g de MgCl2·6H2O e dissolver-se no buffer Tris um a um.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Armazenar à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução de estoque fosfato (11,1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 em tampão Tris)<ol>
<li>Configure um béquer de vidro em um agitador magnético e adicione 100 mL de tampão tris de 1,0 M.</li>
		<li>Pese 0,158 g de Na2HPO4· H2O e 0,353 g de NaHCO3 e dissolver-se em tampão Tris um a um.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Armazenar à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pré-calcificação de placas de cultura celular de 96 poços<ol>
<li>Prepare 30 mL de solução de trabalho misturando 15 mL de tampão tris de 1,0 M, 7,5 mL de caldo de cálcio (etapa 1.1.4) solução e 7,5 mL de solução de estoque fosfato (etapa 1.2.3). Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm.</li>
		<li>Prepare uma placa de cultura celular de 96 poços com fundo plano. Pipeta 300 μL de solução de fosfato de cálcio (passo 1.3.1.) para cada poço. Cubra a placa com uma tampa e incubar a placa a 37 °C por 3 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução de fosfato de cálcio (2,25 mM Na2HPO4· H2O, 4 mM CaCl2·2H2O, 0,14 M NaCl, 50 mM Tris base em ddH2O)<ol>
<li>Adicione 2 mL de 1 M HCl a 40 mL de água deionizada em um béquer com uma conta de agitação magnética e dissolva 0,016 g de Na2HPO4· H2O, 0,0295 g de CaCl2·2H 2O, 0,409 g de NaCl, e 0,303 g de Tris base um a um.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Adicione água deionizada para encher o volume a 50 mL. Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcificação de placas de cultura celular de 96 poços<ol>
<li>Solução de pré-calcificação aspirada a partir das placas de cultura celular pré-calcificadas de 96 poços e adicionar 300 μL de solução de fosfato de cálcio (passo 1.4.2) a cada poço. Cubra as placas com tampa e incubar a 37 °C durante 1 dia.</li>
		<li>Vire a placa para derramar a solução e lave a placa três vezes com água desionizada completamente. Seque a placa imediatamente usando um secador de cabelo ou gás CO2 ou N2 comprimido para manter uma superfície uniforme.</li>
		<li>Esterilize a placa revestida por radiação UV em um banco limpo por 1h. Use a placa revestida imediatamente ou sele a placa com parafilme e armazene-a em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolamento de PBMCs do sangue periférico humano
<ol><li>Retire 15 mL de sangue da veia após obter o consentimento por escrito informado do doador de sangue (voto ético: 287/2020B02).</li>
	<li>Diluir 15 mL de sangue fresco com um volume igual de PBS e misturar invertendo o tubo várias vezes ou desenhando a mistura dentro e fora de uma pipeta.</li>
	<li>Prepare um tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL de solução de gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll, Tabela de Materiais) por tubo. Incline o tubo e coloque cuidadosamente 30 mL de amostra de sangue diluído na solução de gradiente de densidade de 15 mL (amostra de sangue diluída: solução de gradiente de densidade, proporção de 1:0,5-1). NOTA: Ao sobrepor a amostra, preste atenção para não misturar a solução gradiente de densidade com a amostra de sangue diluída.</li>
	<li>Centrifugar a 810 x g por 20 min a 20 °C em um rotor de balde balançando sem freio.</li>
	<li>Aspirar a camada superior deixando a camada de célula mononuclear (linfócitos, monócitos e trombocitos) imperturbável na interfase.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente a camada de célula mononuclear para um novo tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Encha o tubo com PBS, misture e centrífuga a 300 x g por 10 min a 20 °C (o freio pode ser usado a partir desta fase).</li>
	<li>Remova cuidadosamente o supernatante completamente. Resuspense a pelota celular em 50 mL de PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 20 °C. Remova cuidadosamente o supernatante completamente.</li>
	<li>Para a remoção de plaquetas, resuspenque a pelota celular em 50 mL de PBS e centrífuga a 200 x g por 10 min a 20 °C. Remova cuidadosamente o supernatante completamente.</li>
	<li>Transfira células resuspended para frascos de cultura celular para expansão de progenitores OC.</li>
</ol>3. Expansão de progenitores oC
<ol><li>Resuspend PBMs em α-MEM completo (10% FBS, 1% Caneta/Estreptococos, 1% anfotericina B) contendo 20 ng/mL M-CSF. PBMCs de sementes a uma densidade de 2,5 x 105 células/cm2. Normalmente, células isoladas de 15-20 mL de sangue fresco podem ser semeadas em um frasco de 75 cm2 (1,5-2 x 107 células).</li>
	<li>Alimente as células com α-MEM completos frescos contendo 20 ng/mL M-CSF todos os dias até que as células anexadas atinjam uma confluência desejada. Os rendimentos típicos são 1,5-2 x 106 células/frascos quando as células são 95% confluentes. Normalmente, o período de expansão dura 6 dias. NOTA: O potencial osteoclastogênico dos precursores pode diminuir com o tempo de cultivo prolongado.</li>
</ol>4. Indução de osteoclastogênese em placas revestidas de CAP
<ol><li>Para facilitar a adesão celular, incubar as placas revestidas de CaP com 50 μL de FBS por 1h em uma incubadora de 37 °C.</li>
	<li>Para separar os precursores de OC, lave o frasco com PBS duas vezes para remover células mortas ou não aderentes. Adicione 4 mL de trippsina (Tabela de Materiais) por frasco de 75 cm2 , por 30 min.<ol>
<li>Adicione 4 mL de α-MEM completos para parar a digestão, desprender cuidadosamente as células usando um raspador de células e transfira as células para um tubo de 50 mL.</li>
		<li>Determine o número total de células usando uma câmara de Neubauer ou similar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pelota as células por centrifugação por 7 min a 350 x g. Resuspenque a pelota em α-MEM completo suficiente contendo 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL para obter uma concentração de 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Solução aspirada FBS a partir da placa revestida de CaP 96-well e pipeta 200 μL de suspensão celular por poço (2 x 105 células/bem).</li>
	<li>Incubar os precursores de OC para o período de tempo desejado ou com os reagentes desejados relevantes para o design experimental. Normalmente, um alto número de OCs grandes e multinucleados pode ser observado após 6 dias e quando os poços de resorção estão se formando. Células de alimentação com meio α-MEM completo fresco contendo 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL a cada três dias.</li>
	<li>Ao final da incubação, lave as células com PBS duas vezes, fixe com 4% de paraformaldeído por 10 minutos e lave com PBS novamente.</li>
	<li>Use os OCs fixos diretamente para coloração de fluorescência ou armazene a 4 °C.</li>
</ol>5. Coloração de fluorescência de OCs e revestimento cap
<ol><li>Incubar as células fixas com tampão de permeabilização (Triton de 0,1% em PBS) por 5 min.</li>
	<li>Coloritos de filamentos com 100 μL de solução de falotóide etiquetada AlexaFluor 546 na PBS por 30 minutos e aspirar a solução de coloração. Adicione 100 μL de solução de coloração Hoechst 33342 (10 μg/mL em PBS) por 10 minutos para coloração de núcleos. DAPI também pode ser usado.</li>
	<li>Colorir revestimento CaP com 100 μL de calceina de 10 μM em PBS por 10 min. Lave três vezes com PBS e tire imagens.</li>
	<li>Após a fluorescência, as mesmas placas podem ser usadas para quantificar a área do poço de resorção pela coloração de Von Kossa. Para isso, lave as placas com água deionizada duas vezes.</li>
</ol>6. Quantificação da área total do poço de resorção
<ol><li>Para colorir o revestimento cap com coloração von Kossa, incubar com 50 μL de 5% AgNO3 em água deionizada por poço sob radiação UV por 1h, até que o revestimento na parte inferior dos poços tenha se tornado marrom.</li>
	<li>Lave a placa três vezes com água deionizada e tire imagens de campo brilhante. Um objetivo com pouca ampliação, como um objetivo de 1,25x, pode ser usado para capturar todo o poço em uma imagem. Isso facilita a análise de imagem subsequente. Métodos alternativos para capturar toda a área do poço podem ser aplicados.</li>
	<li>Abra um arquivo de imagem com ImageJ: Arquivo | | | de imagem Tipo | 8 bits. Verifique a unidade de escala no canto inferior direito da imagem usando linha reta | Analisar | Definir escala. Digite o comprimento no cobertor de "distância conhecida", digite nova unidade de escala na unidade de comprimento e verifique a caixa Global.</li>
	<li>Parâmetros de medição da lista a serem analisados: Analisar | Definir medidas. Na janela Definir medidas, verifique a área e o limite para caixas de limiar.</li>
	<li>Medir a área dos poços: Imagem | Ajuste | O limiar. Na janela Limiar, verifique o plano de fundo escuro e clique em Auto. A área dos poços fica vermelha. Feche a janela Limiar e selecione Analisar | Meça. Salvar o arquivo de resultado: Arquivo | Salve Como.</li>
</ol>7. Quantificação do número e tamanho do OC e área normalizada do poço de resorção
<ol><li>Abra uma imagem de fluorescência de osteoclatos com ImageJ e verifique a unidade de escala (ver passo 6.3).</li>
	<li>Parâmetros de medição da lista a serem analisados: Analisar | Definir medidas. Na janela Definir medidas, verifique a caixa Área .</li>
	<li>Delineie os OCs usando as seleções ROI Manager e Polygon: Analise | Ferramentas | Gerente do ROI. Clique em seleções de Polígono em toolset, delineie um OC (células com anel de actina e ≥ três núcleos) e clique em Adicionar [t] na janela ROI Manager. Repita o delineamento até que todos os OCs estejam incluídos.</li>
	<li>Medir número e tamanho de OCs: Selecione todos os itens no ROI Manager e clique em Medir. Salvar o arquivo de resultado: Arquivo | Salve Como (Figura 3E).</li>
	<li>Meça a área do poço de imagens de fluorescência. Abra a imagem fluorescente do revestimento correlacionada com a imagem na etapa 7.3 e verifique a unidade de escala (ver etapa 6.3).<ol>
<li>Liste parâmetros de medição a serem analisados (ver etapa 6.4). Selecione | de imagem Ajuste | O limiar. Na janela Limiar, desmarque todas as caixas e clique em Auto. A área dos poços fica vermelha. Feche a janela Limiar e selecione Analisar | Meça. Salve o arquivo de resultado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a área normalizada do poço pelo número de OC.</li>
</ol>

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<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143(2020).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica usando OCs derivados e expandidos in vitro a partir de PBMCs. As placas de cultura celular revestidas de CaP usadas podem ser facilmente preparadas e visualizadas usando materiais disponíveis em laboratório. Além dos PBMCs não variados adotados neste protocolo, os OCs gerados a partir de células monócíticas murinas21 e células macrófagos de medula óssea17 também foram cultivado...

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Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Os osteoclalts (OCs) são macrófagos específicos do tecido derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), desempenhando um papel fundamental na remodelagem óssea juntamente com os osteoblastos1. Distúrbios ósseos induzidos por hormônios sexuais, imunológicos e malignos que destroem osso sisticamente ou localmente são devido ao excesso de atividade osteoclástica, incluindo osteoporose relacionada à menopausa2, artrite reumatoide3, doença periodontal4, doença óssea de mieloma5 e metástaseóssea osteolítica 6. Em contraste, defeitos na formação e função de OC também podem causar osteopetrose7. Os HSCs sofrem diferenciação em progenitores oC sob fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). Na presença tanto do M-CSF quanto do ativador receptor de ligante NF-κB (RANKL, símbolo genético TNFSF11), os progenitores OC se diferenciam ainda mais em OCs mononucleares e, posteriormente, fundem-se para se tornarem OCs multinucleados 8,9,10. Ambas as citocinas M-CSF e RANKL são indispensáveis e suficientes para a indução de marcadores osteoclásticos como receptor de calcitonina (TC), ativador receptor do fator nuclear κ B (RANK), bomba de prótons V-ATPase, subunidade alfa do canal 7 cloreto (CIC-7), integrin β3, fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP, símbolo genético ACP5), catarsina de cissinosa lysomal protease K (CTSK) e matriz metallopeptidase 9 (MMP9). Os OCs ativados formam uma zona de vedação na superfície óssea através da formação de um anel de actina com uma borda de babados11,12. Dentro da zona de vedação, os OCs mediam a resorção através de prótons secretando através da bomba de prótons V-ATPase12,13, MMP914 e CTSK15, levando à formação de lacunas.
Para experimentos in vitro, progenitores oC podem ser obtidos pela expansão de macrófagos de medula óssea do fêmur e tíbia16,17, bem como pelo isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) a partir de amostras de sangue e casacos buffy 18,19,20, ou pela diferenciação das células monocíticas murinas imortalizadas RAW 264,7 21,22.
No presente protocolo, descrevemos um ensaio de ressorção osteoclástica em placas de cultura celular revestidas de CaP usando OCs derivados de PBMCs primários. O método de placas de cultura celular revestida de CaP utilizado aqui são adotados e refinados a partir do método descrito anteriormente por Patntirapong et al.17 e Maria et al.21. Para obter precursores de OC, os PBMCs são isolados por centrifugação gradiente de densidade e expandidos como descrito anteriormente20.

<table><tbody><tr><td>AgNO3</td><td>SERVA Electroforese GmbH</td><td>35110</td><td>Nitrato</td></tr><tr><td>de prata a-MEM</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>MEM alfa, GlutaMAX, sem nucleosídeos</td></tr><tr><td>anfotericina B</td><td>Biochrom</td><td>03-028-1B</td><td>Solução de anfotericina B</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21097-50G</td><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td></tr><tr><td>Calceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td>Calceína</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>soro bovino fetal</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>Ficoll Paque Plus</td></tr><tr><td>Tampão de fixação</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td>Paraformaldeído</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merk</td><td>1.09057.1000</td><td>Ácido clorídrico</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Promokine</td><td>PK-CA707-40046</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>Humano Recombinante M-CSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td>Cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2943,0250</td><td>di- hidrogenofosfato de sódio anidro</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td>S7653-250G</td><td>cloreto de sódio</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk</td><td>K15322429</td><td>Bicarbonato de Sódio</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (1X), DBPS sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Mistura de penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>Faloidina-Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546 Faloidina</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PeproTech</td><td>310-01</td><td>Ligante sRANK humano recombinante (derivado de E.coli)</td></tr> <tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>Tris (hidroximetil) aminometano</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Alquil fenil polietilenoglicol</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td>Enzimas de dissociação celular recombinante</td></tr></tbody></table>

um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Os osteoclasstos maduros são células multinucleadas que podem degradar o osso através da secreção de ácidos e enzimas. Eles desempenham um papel crucial em várias doenças (por exemplo, osteoporose e câncer ósseo) e, portanto, são objetos importantes de pesquisa. In vitro, sua atividade pode ser analisada pela formação de poços de resorção. Neste protocolo, descrevemos um método simples de ensaio de poços usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio (CaP), que podem ser facilmente visualizadas e quantificadas. Precursores osteoclastas derivados de células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) foram cultivados nas placas revestidas na presença de estímulos osteoclastogênicos. Após 9 dias de incubação, os osteoclastas foram fixadas e manchadas para imagens de fluorescência, enquanto o revestimento cap foi contra-manchado por calcein. Para quantificar a área resorbedada, o revestimento cap em placas foi manchado com 5% AgNO3 e visualizado por imagens de campo brilhante. A área do poço de resorção foi quantificada por meio do ImageJ.

O revestimento de fosfato de cálcio na parte inferior das placas de cultura celular foi realizado em duas etapas de revestimento que compreendem uma pré-calcificação de 3 dias e uma etapa de calcificação de 1 dia. Como mostrado na Figura 1, o fosfato de cálcio distribuído uniformemente foi obtido na parte inferior das placas de 96 poços. O revestimento aderiu muito bem ao fundo após as etapas de lavagem realizadas.
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Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.

Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Nosso protocolo descreve um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica. O uso de placas de cultura celular revestida de fosfato de cálcio pode ser facilmente preparado e visualizado usando materiais disponíveis em laboratório. Em contraste com as fatias opacas de osso ou dentina, o revestimento de fosfato de cálcio permite a visualização de poços de ressorção e células ao mesmo tempo.Neste protocolo, usamos PBMCs para diferenciação osteoclasta. No entanto, também pode ser aplicado a outros tipos de células, como monócitos derivados da medula óssea ou células Raw 264.7. Primeiro pegue uma placa de cultura de células de fundo plano 96 e pipeta 300 microliters de solução de fosfato de cálcio previamente preparada em cada poço.Em seguida, cubra a placa com a tampa e incubar a placa a 37 graus Celsius por três dias. Após três dias, aspire a solução de pré-calcificação a partir das placas de cultura celular pré-calcificadas de 96 poços e adicione 300 microliters de solução de fosfato de cálcio a cada poço. Cubra as placas com uma tampa e incubar a 37 graus Celsius por um dia.Em seguida, inverta a placa para derramar a solução e lave bem a placa três vezes com água desionizada. Seque imediatamente a placa usando um secador de cabelo ou dióxido de carbono comprimido ou gás nitrogênio para manter uma superfície uniforme. Agora, irradie a placa revestida em um banco limpo com raios ultravioletas por uma hora.Use a placa revestida imediatamente ou sele a placa com Parafilm e armazene-a em temperatura ambiente. Diluir 15 mililitros de sangue fresco com um volume igual de PBS e misturá-los invertendo ou pipetando várias vezes. Em seguida, pegue 15 mililitros de solução gradiente de densidade em um tubo cônico de 50 mililitros, incline o tubo e coloque cuidadosamente 30 mililitros de amostra de sangue diluído nos 15 mililitros da solução de gradiente de densidade.Mais tarde, centrifufique o tubo em um rotor de balde balançando sem quebrar a 810 vezes G por 20 minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, aspire a camada superior deixando a camada de célula mononuclear intacta na interface. Transfira cuidadosamente a camada da célula mononuclear para um novo tubo cônico de 50 mililitros.Encha o tubo com PBS, misture e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos a 20 graus Celsius. Suspenda os PBMS em um ALFA-MEM completo contendo 20 nanogramas por fator estimulante da colônia de macrófagos mililitros, e sementes 2,5 vezes 10 às quintas células por centímetro quadrado PBMCs em um frasco. Incubar as placas revestidas de fosfato de cálcio com 50 microliters de soro bovino fetal a 37 graus Celsius por uma hora.Em seguida, lave o frasco duas vezes com PBS para separar os precursores osteoclantes de células mortas ou não aderentes, em seguida, adicione quatro mililitros de trippsina por frasco de 75 centímetros quadrados. Após 30 minutos, pare a digestão adicionando quatro mililitros de alfa-MEM completo, em seguida, desprende cuidadosamente as células usando um raspador de células. Transfira as células para um tubo de 50 mililitros e conte o número total de células usando uma câmara de contagem.Centrifugar o tubo a 350 vezes G durante sete minutos para pelotar as células e reutilizar a pelota e mem alfa completo contendo M-CSF e RANKL para obter uma vezes 10 para as seis células por mililitro. Aspire o soro bovino fetal da placa revestida de fosfato de cálcio, e pipeta 200 microliters de suspensão celular por poço. Após a incubação, lave as células duas vezes com PBS.Fixar as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos e lavar novamente com PBS. Para coloração, adicione o tampão de permeabilização às células fixas e incuba-as por cinco minutos. Para manchar os filamentos de actina, incubar as células com 100 microliters de Alexa Fluor 546 rotulada solução de faloideina na PBS por 30 minutos, em seguida, aspirar a solução de coloração e manchar os núcleos usando 100 microliters de Hoechst por 10 minutos.Colorir o revestimento de fosfato de cálcio com 100 microliters de 10 micromolars de calceína e PBS por 10 minutos. Depois de lavar três vezes com PBS, capture imagens. Para Von Kossa, a coloração do revestimento de fosfato de cálcio adiciona 50 microliters de 5% de nitrato de prata e água desionizada a cada poço, e incuba a placa sob radiação ultravioleta por uma hora até que o revestimento na parte inferior dos poços fique marrom.O revestimento de fosfato de cálcio na parte inferior das 96 placas pareciam ser uniformes e bem aderidos. Após nove dias de cultura em M-CSF e RANKL nas placas revestidas de fosfato de cálcio, precursores de osteoclato formaram poços de resorção e grandes osteoclartos. Os osteoclastas multinucleados localizados nos poços expressaram altos níveis de TRAP.Os osteoclastos maduros mostraram a presença de três ou mais núcleos e o anel de actina distinto. O revestimento de fosfato de cálcio verde mostrou a presença de poços de resorção preto. As imagens de fluorescência da área do poço foram medidas utilizando-se a ferramenta de limiar de imagem J.O número e o tamanho dos osteoclatos foram calculados utilizando-se o gerente do ROI e a ferramenta de seleção de polígonos dos precursores da imagem J.Osteoclasts cultivadas na ausência de RANKL não conseguiam formar poços de resorção, porém M-CSF e RANKL facilitaram a formação de poços osteoclastogênicos.E a área do poço foi quantificada usando imagem J.Imediatamente secando a placa revestida com fluxo de ar ajuda a fazer um revestimento uniforme de fosfato de cálcio. Caso contrário, é propenso a formar um revestimento mais grosso no meio do poço.

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Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra a técnica de coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato para detectar a presença de grânulos contendo TRAP dentro dos osteoclastos. A técnica forma depósitos de grânulos de corante de cor magenta no citoplasma dos osteoclastos, tornando-os visíveis ao microscópio invertido.

Coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato: uma técnica in vitro para detectar osteoclastos cultivados contendo enzimas TRAP

Neste vídeo, descrevemos um ensaio de reabsorção osteoclástica in vitro em placas de cultura de células revestidas com fosfato de cálcio cultivadas com osteoclastos derivados de células mononucleares de sangue periférico humano. Os osteoclastos formam um anel de actina característico na matriz revestida de fosfato de cálcio da placa de cultura de células e degradam a matriz dentro da região do anel de actina para liberar íons de cálcio e fosfato, resultando na formação de poços de reabsorção...

Ensaio de reabsorção: uma técnica in vitro para quantificar a atividade de reabsorção de cálcio de osteoclastos maduros usando placas de cultura revestidas com fosfato de cálcio

Neste vídeo, descrevemos um método para a detecção de depósitos de cálcio secretados por osteoblastos usando um corante aniônico, Vermelho de Alizarina S. Os osteoblastos cultivados são primeiro corados e, em seguida, o corante é recuperado para quantificação colorimétrica dos depósitos de cálcio ou do grau de mineralização dos osteoblastos.

Ensaio de mineralização in vitro: um método colorimétrico para quantificar depósitos de cálcio osteoblástico em substituto de enxerto ósseo por coloração e extração de vermelho de alizarina S

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

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Este manuscrito descreve um protocolo para isolar e cultura osteoclastos em vitro da medula óssea de rato e estudar o papel do alvo da rapamicina 1 complexo na formação do osteoclast mamíferos/mecanicista.

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Urânio é conhecido por afetar o metabolismo ósseo. Aqui, apresentamos um protocolo que visa investigar o efeito da exposição de urânio natural sobre a viabilidade, a diferenciação e a função dos osteoclastos, as células responsável pela reabsorção óssea.

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Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

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O número de novos biomateriais, projetado para a reparação de lesões ósseas grande está expandindo continuamente com o objectivo de reforçar a consolidação óssea e superar as complicações associadas com o transplante de osso. Aqui, apresentamos uma estratégia multidisciplinar para testes de pré-clínica biocompatibilidade de biomateriais para reparo ósseo.

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Aprenda um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro usando placas de cultura revestidas com fosfato de cálcio e PBMCs. Este método melhora a visualização e facilita pesquisas em biologia óssea.

Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

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