Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

A fixação de portas para acasalar em seringas com tubulação é crítica porque, quando é feita corretamente, não há vazamentos, não há bolhas na célula de fluxo e os experimentos podem ser feitos repetidamente usando a mesma célula de fluxo durante um período de um ano com uso cuidadoso. Aqui, dois métodos simples serão apresentados para anexar os conectores às células de fluxo. Estes são fáceis, são reprodutíveis e permitem que o investigador adapte facilmente a célula de fluxo às suas necessidades sem muitos problemas.

O uso dessas células de fluxo foi feito com experimentos de molécula única em mente. Em particular, o que chamamos de bioquímica visual, mas eles podem ser usados em qualquer estudo onde a microfluídica é necessária e em situações em que o fluxo de fluido laminal deve ser usado. Então, para evitar erros, em vez de usar células de fluxo valiosas para estabelecer as técnicas, sugiro praticar em uma lâmina de vidro ou uma folha de cobertura primeiro.

Isso permitirá que se tenha uma ideia do vidro ou dos materiais PDMS para saber como manuseá-los e quanta força aplicar ao inserir tubos ou unir os conectores. Isso exigirá o sacrifício de alguns conectores, mas eles são muito mais baratos do que as células de fluxo. Comece colocando a célula de fluxo em uma superfície plana e limpa.

Segure a tubulação de PTFE a três milímetros da extremidade livre com pinça e empurre a tubulação para a porta. Repita este procedimento para cada uma das portas restantes. Ligue as portas de entrada à bomba da seringa e a saída a um frasco de resíduos.

Encha cada seringa de vidro com um mililitro de espectrofotométrico, metanol de grau e fixe-os a uma válvula de comutação. Certifique-se de que a válvula tenha a saída direcionada para o desperdício e limpe cada linha com 50 microlitros de metanol. Mude a posição de saída para a célula de fluxo e bombeie 800 microlitros de metanol através da célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 microlitros por hora para molhar as superfícies e eliminar bolhas.

No dia seguinte, repita este processo usando 800 microlitros de água ultrapura. A célula de fluxo agora está pronta para uso. Se os conectores de tubulação press-fit forem usados, remova cuidadosamente a fita adesiva de um lado do conector e coloque-a sobre o orifício na lâmina do microscópio.

Pressione para baixo por alguns segundos. Repita o processo para os conectores restantes. Em seguida, coloque a célula de fluxo em uma superfície plana limpa.

Segure a tubulação de PTFE a três milímetros da extremidade livre e empurre a tubulação para o orifício na porta. Repita este procedimento para cada uma das portas restantes. Fixe a tubulação das entradas às válvulas de comutação.

Coloque o acessório em uma superfície limpa e plana ou em um coletor personalizado para manter a célula de fluxo e os conectores no lugar enquanto a ligação ocorre. Coloque a célula de fluxo na seção embutida do coletor e, em seguida, coloque uma pequena quantidade de cola de vidro na parte inferior do conjunto e insira o selo. Posicione a porta nano sobre um dos orifícios de entrada na lâmina do microscópio.

Empurre suavemente para baixo e segure no lugar sem movimento lateral. Repita o processo para as portas restantes. Deixe secar ou prender no lugar no coletor.

Remova cuidadosamente a célula de fluxo do coletor e certifique-se de que os conjuntos se alinhem bem com as portas de entrada na célula de fluxo. Coloque uma célula de fluxo no estágio do microscópio e prenda a tubulação usando os conectores apertados pelos dedos. Encha cada seringa de vidro com um mililitro de metanol espectrofotométrico.

Ligue cada seringa a uma válvula de comutação. Certifique-se de que a válvula tenha a saída direcionada para o desperdício e limpe cada linha com 50 microlitros de metanol. Mude a posição de saída para a célula de fluxo e bombeie 800 microlitros de metanol através da célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 microlitros por hora.

No dia seguinte, repita este processo usando 800 microlitros de água ultrapura. A medição da potência de saída é mostrada aqui. A potência de saída do laser é medida antes de instalar a cabeça do laser no layout óptico.

Uma vez que o alinhamento do purgador é feito, a potência do feixe é medida após a objetiva de 100 x para cada purgador. As imagens demonstram o aprisionamento óptico estável de contas fluorescentes de um micrômetro. Aqui F é uma armadilha fixa, e M é uma armadilha móvel.

Com a armadilha móvel no modo de digitalização movendo-se através de um círculo pequeno ou grande a 30 hertz. O fluxo de fluido dentro da célula de fluxo é laminar. O esquema mostra a célula de fluxo do topo para demonstrar que a difusão entre canais é a principal fonte de mistura entre os fluxos de fluido adjacentes.

As setas azuis indicam a direção do fluxo e os fluxos individuais são coloridos, brancos, cinza claro e branco. As regiões de alargamento da difusão transversal entre os canais são indicadas em vermelho. A inserção mostra uma imagem de fluorescência dos fluxos de fluido adjacentes a 10 vezes a ampliação com complexos de esferas de DNA marcados fluorescentes no fluxo inferior e buffers apenas no fluxo superior.

As manchas brancas no fluxo superior são disparadas a partir do ruído da câmera CCD. O perfil de fluxo e as células de fluxo laminar são parabólicos. A célula de fluxo é vista de lado e a direção do fluxo é indicada acima de cada célula.

A velocidade linear do grânulo é afetada pela velocidade da bomba e pela concentração de sacarose. A força oposta em um grânulo é afetada pela viscosidade da solução. O diâmetro do grânulo influencia a força sobre os grânulos sob fluxo.

Ao tentar este procedimento, certifique-se de que a área em que você está trabalhando está limpa e que você limpou as superfícies de vidro com metanol de grau espectrométrico ou acetona. Nesta fase, você deve ter uma célula de fluxo que é feita para a sua bomba de seringa e agora você está pronto para apresentar suas soluções e iniciar experimentos de pinça óptica. O uso de células de fluxo, que podem ser usadas por longos períodos de tempo, permitiu que os pesquisadores investigassem uma variedade de reações de molécula única, onde as forças são medidas, as reações são visualizadas por fluorescência ou uma combinação de ambas.