Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

Distúrbios neurodegenerativos e de saúde mental resultam de mudanças na comunicação sináptica. Eventos multifatoriais mudam receptores sinápticos de maneiras que não entendemos completamente. A microtransplantação de membranas sinápticas fornece uma visão dessas alterações.

A principal vantagem dessa técnica é a possibilidade de registrar a atividade de receptores cerebrais nativos trabalhando no cérebro humano e, portanto, representar as doenças que estamos estudando. Receptores sinápticos são os principais alvos da medicina que regula a atividade elétrica do cérebro, mas entendendo como esses receptores mudam, melhores terapias restaurando sua funcionalidade podem ser desenvolvidas. Este método tem sido aplicado com sucesso a diferentes espécies, desde insetos, peixes, mamíferos, mas também pode ser aplicado a receptores de membrana fora do cérebro, por exemplo, músculos e tumores.

As possibilidades são amplas. Cortar agulhas de injeção é complicado. Muito pequeno pode prevenir a injeção de proteína, e dois grandes podem matar a célula.

Ajuda a usar uma medida consistente, como a borda de uma lâmina de barbear. Comece por sonicar as amostras selecionadas preparadas da região cerebral humana de interesse três vezes em um banho com gelo molhado flutuante. Use cinco ciclos de segundo cada vez e espere por um minuto no gelo molhado entre os ciclos.

Coloque um microliter da amostra sobre o termoplástico e faça um recuo na superfície, se necessário, antes da colocação da amostra para evitar o movimento da amostra. Use os botões do manipulador segurando o nanoinjetor para posicionar a agulha e mova-a em direção à amostra a ser preenchida. Uma vez que a ponta da agulha esteja na amostra, pressione e segure o botão de preenchimento até que a amostra suficiente seja colhida.

Cerca de 0,5 amostra de microliter é necessária para 10 oócitos. Use os botões para mover a agulha do nanoinjetor de volta para a posição mais alta. Penetre o oócito logo abaixo da superfície com uma agulha, não mais profunda, e use o pedal do pé para injetar a amostra.

Espere cerca de dois a três segundos. Após a injeção bem sucedida, a célula se expandirá. Use os botões no manipulador para sair da célula.

Mova a placa de Petri para que o próximo oócito esteja alinhado com a agulha. Repita o processo até que o número desejado de oócitos no prato tenha sido injetado, em seguida, retraia o nanoinjetor à sua posição original e remova a agulha. Certifique-se de que um poço de oócitos seja deixado sem injeção para ser usado como controle.

Ligue todos os equipamentos usados para a gravação das correntes de íons, depois ligue o computador desktop e faça login na versão WinEDR 3.9.1. Certifique-se de que o programa está em execução e o registro está definido como Disc. Depois disso, defina a duração da gravação e limpe a opção Simulador.

Para a seção de eletrodos de tensão, desligue a compensação da capacidade negativa. Defina o interruptor seletor de ganhos para 10 para a seção de eletrodo de banho e, em seguida, ajuste o interruptor de alternação de três posições, que seleciona o multiplicador de ganhos, para x1. As luzes LED indicarão a seleção multiplicadora de ganhos.

Desligue o seletor do modo de fixação, coloque o controle de ganho dc e ajuste o controle de ganho para cerca de metade do loop aberto de largura de banda completa. Defina comandos para 40 milvolts, os controles de resarção para negativo e o multiplicador de escala para x2. Para o eletrodo atual, use o deslocamento VE para estabelecer uma referência zero, antes de empalar o oócito.

Em seguida, abra o software WinEDR versão 3.9.1, vá para o menu superior e selecione Arquivo, seguido pelo Novo. Crie sua própria pasta e salve o arquivo. No menu principal, selecione Gravar, seguido de Gravar para Disco.

Coloque as pontes de ágar nos respectivos orifícios circulares atrás da câmara de gravação, conectando os poços para os eletrodos usados como referência de terra na câmara de gravação. Adicione a solução de trabalho do Ringer 1x à válvula de perfusão correspondente. Abra a válvula até que a câmara de gravação esteja cheia de Solução ringer.

Usando os manipuladores direito e esquerdo segurando os eletrodos, guie as agulhas de eletrodo para a câmara de gravação que está cheia de Solução de Ringer. Verifique a resistência de cada eletrodo zerando os botões de deslocamento VM e VE e, em seguida, pressionando os botões de teste de eletrodo. A resistência deve ser entre 0,5 a 3 megaohm.

Se a resistência estiver fora do alcance, substitua-a usando novos microeletros. Em seguida, encha a câmara de gravação com a solução de Ringer fresca. Use uma pipeta de vidro para colocar um oócito não injetado ou micro transplantado no centro da câmara de gravação.

Certifique-se de que o oócito é claramente visível sob o microscópio com o lado animal para cima. Guie o eletrodo para a Solução do Ringer até que toquem na membrana oócito. Fure suavemente a membrana oócito no lado animal com os dois eletrodos, e registe o potencial da membrana de repouso.

Ligue o fluxo de solução do Ringer. Usando o Amplificador de grampo oócito, altere o modo para fixação de tensão lentamente, e ajuste a tensão de retenção para 80 milvolts. A corrente no monitor deve ser negativa, geralmente entre 0 e 0,4 microamperes.

Vá para File, New e, em seguida, salve a gravação no software para criar um novo arquivo e salve a gravação. Pressione a Gravação seguida de Gravação para Disco para iniciar a gravação. Adicione informações relevantes ao arquivo usando o diálogo Mark Chart.

Aplique agonistas para estimulação química abrindo as válvulas e perfundiando-as na câmara de gravação por 15 segundos. Uma vez concluída a gravação, gire o grampo de tensão para a posição de desligar e desligue a válvula de solução do Ringer. Remova o oócito e descarte seguir a política institucional para amostras de cérebro humano, em seguida, pare a gravação e salve o arquivo.

Guarde uma cópia das gravações em uma unidade USB. A partir daí, abra o arquivo desejado para ser analisado. Para medir a resposta máxima DO AMPA e a resposta máxima do GABA A, primeiro, estabeleça um nível 0 ou linha de base, encontrando a linha vermelha e arraste-a para a corrente gerada pelo aplicativo Ringer ou linha de base.

Uma vez estabelecido o nível 0, determine as medidas de resposta arrastando o cursor vertical verde para a parte desejada do rastreador gráfico. Foram registradas correntes de íons dos oócitos injetados com as membranas dos receptores sinápticos humanos. Os receptores AMPA foram ativados com 100 receptores de kainate micromolar, e receptores GABA A com um GABA milimolalar.

Co-injeção das membranas filtradas do órgão elétrico do torpedo, rico em receptores de acetilcolina, e codificação cDNA para o receptor da linha GABA um no polo animal produziram principalmente dois grupos de oócitos, com base em suas respostas. Um grupo de oócitos teve grandes respostas à acetilcolina, mas nenhuma resposta a um micromolar GABA. Os oócitos em outro grupo tiveram respostas nulas ou baixas à acetilcolina, mas grandes respostas ao GABA.

A imagem gráfica mostra a média mais menos erro padrão da média de pico de corrente no grupo um e no grupo dois. Um oócito no grupo dois tinha grandes respostas gaba e acetilcolina, sugerindo a ruptura do núcleo. Consequentemente, a distribuição das respostas foi distorcida a valores baixos, conforme observado pela diferença entre a média e a mediana da distribuição da corrente de membrana.

Uma das causas dos oócitos de baixa resposta é que as membranas estão sendo injetadas e presas no núcleo do oócito. Respostas gaba e kainate de oócitos injetados nos polos animais ou vegetais com membranas não filtradas obtidas de um cérebro não-AD, e um cérebro de DA são mostrados aqui. Oócitos injetados perto do polo animal sem mirar o núcleo deram respostas maiores do que os oócitos injetados no polo vegetal, permitindo assim o estudo de amostras de tecido com um número muito baixo de receptores.

Ao tentar este procedimento, monitore sempre o nível ringer. É sempre durante as gravações importantes que você vai acabar, e então ele vai usar o seu resultado, e morte do oócito, e perda de dados muito valiosos. Após este procedimento, podemos realizar cargas ocidentais para validar a presença dos receptores sinápticos, ou proteínas de interesse.

Permite medir a excitação global para inibir as relações sinápticas em diferentes regiões cerebrais, e diferentes distúrbios cerebrais, permitindo fazer um teste direto na previsão teórica sobre as causas da doença.