Name: Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda a técnica de microtransplantação de membranas sinápticas em oócitos de Xenopus laevis para registrar respostas de receptores AMPA e GABA. Este método permite estudar receptores cerebrais nativos relacionados a distúrbios neurodegenerativos.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIA/NIH R01AG070255 e R01AG073133 à AL. Agradecemos também ao Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer Irvine da Universidade da Califórnia (UCI-ADRC) por fornecer o tecido humano mostrado neste manuscrito. O UCI-ADRC é financiado pela concessão do NIH/NIA P30 AG066519.

Todas as pesquisas são realizadas em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovadas pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia Irvine (IACUC-1998-1388) e do Ramo Médico da Universidade do Texas (IACUC-1803024). O córtex temporal de um cérebro não-Alzheimer (da mulher, 74 anos, intervalo pós-morte 2,8 h) e um cérebro de D.C.(feminino, 74 anos, intervalo pós-morte 4,5 h) foram fornecidos pelo Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer irvine da Universidade da Califórnia (UCI-ADRC). O consentimento informado para a doação cerebral foi obtido pela UCI-ADRC.
NOTA: O tecido cerebral humano não fixado deve ser tratado como uma fonte de patógenos transmitidos pelo sangue (BBP). Assim, o treinamento bbp é necessário antes do início dos experimentos. Este protocolo é realizado em um laboratório de biossegurança nível 2 (BSL2) sob os requisitos BSL2. As diretrizes e precauções dentro do laboratório incluem: sem alimentos ou bebidas permitidas em laboratório, boas práticas laboratoriais devem ser seguidas, equipamentos de proteção individual (luvas, vestido, sem sapatos de dedo aberto) e a porta deve ser fechada o tempo todo.
1. Preparação de microinjeção de oócito xenopus
<ol><li>Para fazer agulhas de injeção, puxe tubos de borossilicato de 3,5 polegadas usando um puxador de micropipette. Uma vez que as agulhas de microinjeção são puxadas, use um microscópio e uma lâmina de barbear para cortar o suficiente da ponta da agulha para que a microinjeção possa ser realizada (geralmente entre 2-3 mm). NOTA: O comprimento da ponta da agulha para cortar pode variar.</li>
	<li>Prepare a solução da 1x Barth adicionando 200 mL de Solução de Estoque barth (5x) a 800 mL de água destilada. Encha uma placa de cultura de tecido fundo plano de 24 poços com a solução de 18 °C 1x Barth.<ol>
<li>Prepare a solução de ações da Barth 5x da seguinte forma. Em 1 L de água destilada, adicionar 25,71 g de NaCl (cloreto de sódio), 0,372 g de KCl (cloreto de potássio), 0,301 g de CaCl2 (díclodo de cálcio), 0,389 g de Ca(NO3)2(4H2O) (tetrahidrato de nitrato de cálcio), 1,01 g de MgSO4(7H2O) (heptahydrate de sulfato de magnésio), 1,008 g de NaHCO3 (bicarbonato de sódio), e 11,91 g HEPES (4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isole os oócitos xenopus usando os protocolos descritos em18,19 e usando estereoscópio ampliado 2x, selecionando oócitos de aparência saudável, oócitos v-VI estágio. Coloque cerca de 10 oócitos por poço e use um dos poços para abrigar oócitos não injetados para serem usados como células de controle na realização de gravações.</li>
	<li>Recupere uma pequena placa de Petri, 1 cm de altura e 6 cm de diâmetro, e coloque a malha de nylon dentro para que cubra a parte inferior do prato. Em seguida, despeje 15 mL da solução 1x Barth a ser usada para a realização de microinjeções dos oócitos.</li>
	<li>Coloque um nanoinjetor ao longo da linha média da plataforma de microscópio. Gire o ímã para a posição Off e mova lentamente o nanoinjetor para a posição desejada enquanto o suporta cuidadosamente. Quando o nanoinjetor estiver devidamente posicionado, gire o ímã de volta para a posição totalmente On e certifique-se de que ele está seguro.</li>
	<li>Para um tamanho amostral de 50,6 nL, use as seguintes configurações na lateral do nanoinjetor: 1 é D (para baixo), 2 é D, 3 é U (para cima), 4 é D, e 5 é U. Posicione um pedaço de termoplástico auto-vedante, ou tampa do tubo de microcentrífuga, no suporte do microscópio, alinhando-o com a trajetória do nanoinjetor. NOTA: 50 nL está perto da quantidade máxima de material injetado que o citoplasma pode suportar21.</li>
	<li>Encha uma seringa de insulina cerca de metade do seu volume com óleo mineral (cerca de 0,5 mL/cc). Usando esta seringa, encha a agulha de microinjeção com óleo mineral. Certifique-se de que uma gota de óleo visível seja vista na ponta da agulha.</li>
	<li>Exponha o êmbolo nanoinjetor a um mínimo de 1-2 cm. Faça isso segurando o botão VAZIO até que o êmbolo esteja visível no comprimento desejado. Uma vez que o êmbolo esteja exposto, coloque lentamente e cuidadosamente a agulha de vidro de microinjeção preenchida com óleo mineral no êmbolo nanoinjetor, e certifique-se de que ele se encaixa bem através do anel O de resistência negra e pára no anel de resistência branca. Certifique-se de não dobrar o êmbolo nanoinjetor no processo.</li>
	<li>Uma vez que a agulha de vidro de microinjeção esteja segura e no lugar, pressione ESVAZIAR para anular quaisquer bolhas de ar potenciais. Suavemente, com um tecido de papel, limpe o excesso de óleo mineral.</li>
</ol>2. Carregando a amostra
<ol><li>Preparar preparações enriquecidas sinapstosômicas (amostras) da região de interesse do cérebro humano, conforme descrito em 10,11,12,13,14,15, e armazená-los em alíquotas de cerca de 5 μL a -80 °C até o momento da injeção.</li>
	<li>Antes da injeção, transfira a alíquota para gelo molhado e mantenha-a no gelo o tempo todo, exceto por sônica e recuperação. O número e os tipos de amostras serão determinados pelo desenho experimental.</li>
	<li>Sonicar as amostras selecionadas 3x em um banho com gelo molhado flutuante para evitar o aquecimento da amostra. Use ciclos de 5 s cada vez, esperando 1 min em gelo molhado entre os ciclos.</li>
	<li>Coloque 1 μL de amostra no termoplástico. Faça uma internação na superfície, se necessário, antes da colocação da amostra para evitar o movimento da amostra.</li>
	<li>Use os botões do manipulador segurando o nanoinjetor para posicionar a agulha e movê-la em direção à amostra a ser preenchida. Uma vez que a ponta da agulha esteja na amostra, pressione e segure o botão FILL até que a amostra suficiente seja colhida. Cerca de 0,5 μL é necessário para 10 oócitos. Usando os botões, mova a agulha do nanoinjetor de volta para a posição mais alta.</li>
</ol>3. Injetando os oócitos
NOTA: As membranas sinapstosômicas do córtex de rato padronizado também são injetadas em todos os experimentos em um conjunto de oócitos para medir mudanças na capacidade de fusão entre diferentes lotes de oócitos.
<ol><li>Coloque oócitos selecionados na pequena placa de Petri que tem a malha de nylon e a solução de Barth (cerca de 10 oócitos). Organizar oócitos para que eles não estejam em cima um do outro; isso será útil durante o processo de injeção.</li>
	<li>Usando os botões do manipulador segurando o nanoinjetor, mova a agulha em direção aos oócitos. Uma vez que a agulha esteja submersa na solução do Barth, use o pedal do pé para o nanoinjetor para ter certeza de que a agulha de microinjeção está liberando a amostra. Se a amostra estiver sendo liberada, será visível a partir da visualização do microscópio.</li>
	<li>Uma vez que esteja confiantemente estabelecido que a amostra está sendo liberada, passe para microinjetar o oócito. Se a amostra não estiver sendo liberada, repita o processo de enchimento da agulha.</li>
	<li>Penetre o oócito logo abaixo da superfície com a agulha, não mais fundo, e use o pedal do pé para injetar a amostra. O pedal do pé fará um sinal sonoro quando a amostra for liberada. Espere cerca de 2-3 s. Se a injeção foi bem sucedida, a célula se expandirá. Uma vez que isso aconteça, use os botões no manipulador para sair da célula. NOTA: A fusão de membranas no oócito é um processo polarizado; portanto, o oócito deve ser injetado no lado animal da célula, de preferência acima do equador, com o ângulo da agulha em direção ao lado animal para maximizar a fusão da membrana.</li>
	<li>Mova a placa de Petri para que o próximo oócito esteja alinhado com a agulha e repita o processo até que todos os oócitos no prato tenham sido injetados. Repita este processo até que o número desejado de oócitos tenha sido injetado. Certifique-se de que um poço de oócitos seja deixado sem injeção para ser usado como controle.</li>
	<li>Uma vez injetados todos os oócitos, retraia o nanoinjetor à sua posição original e remove a agulha.</li>
</ol>4. Registro de correntes de íons usando um grampo de tensão de dois eletrodos
<ol><li>Para fazer duas agulhas de grampo de tensão de eletrodo (TEVC), puxe tubos de vidro borossilicato polidos de fogo de 15 cm de comprimento usando o puxador de micropipette. Uma vez que a puxar esteja completa, encha com 3 M KCl usando agulhas capilares longas, ou, alternativamente, submergir e ferver as agulhas em solução de 3 M KCl por 15 minutos sob um vácuo contínuo. A alta temperatura ajuda no enchimento dos eletrodos e na remoção de bolhas de ar.<ol>
<li>Prepare uma solução de preenchimento de eletrodo de 3 M KCl usando KCl na forma cristalina e água desionizada, e seguindo essas etapas cuidadosamente para que o potencial de referência dos eletrodos não seja alterado. Seque o KCl cuidadosamente em um forno por 2-3 h. Utilizando um equilíbrio analítico, pesar cuidadosamente 223,68 g de KCl. Transfira o KCl para uma garrafa de vidro 1 L. Use esta solução para clorato de fios de eletrodo prateado. NOTA: Para puxar eletrodos de vidro, o livro de receitas de pipeta pode ser baixado aqui: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligue todos os equipamentos utilizados para o registro de correntes de íons: sistemas principais, válvulas de solução, luz de microscópio, sistemas de válvulas, grampo de oócito e sistema de vácuo. Ligue o computador de mesa, faça login no WinEDR V3.9.1.1.e certifique-se de que o programa esteja em execução e que os valores de configuração estejam corretos da seguinte forma: gravar em disco, definir a duração da gravação e limpar a opção do simulador.<ol>
<li>Forneça os seguintes valores de configuração iniciais para o amplificador: para seção de eletrodo de tensão (Vm), desligue a compensação negativa da capacidade (-C); para a seção de eletrodos de banho (Im), defina o interruptor seletor de ganhos (variam de 0,1 a 10) em 10, e o interruptor de alternador de três posições que seleciona o multiplicador de ganhos (x0.1, x1.0 e x10), em x1.0. As luzes LED indicarão a seleção multiplicadora de ganhos; para seção de grampo, desligue o seletor do modo de fixação, defina o controle de ganho dc para IN e o controle de ganho de largura de banda completa de loop aberto (faixa 0 a 2000) para cerca de 1200; para comandos, fixado em 40mV e definir os controles de resarndo negativo e multiplicador de escala para estar em x2; para eletrodo atual, use o deslocamento ve para estabelecer uma referência zero antes de empalar o oócito.</li>
		<li>Para gravar, abra o software WinEDR V3.9.1, vá para o menu superior e selecione Arquivo > Abra novo arquivo. Crie sua própria pasta e salve o arquivo.</li>
		<li>Em seguida, no menu principal selecione Gravar > gravar para disco. Quando os dois eletrodos estiverem dentro do oótlito, ligue o ringer no controlador da válvula VC-8 e gire o grampo para Retardar no amplificador OC-725C. Em seguida, volte para o software WinEDR e selecione Gravar no canto superior esquerdo da tela.</li>
		<li>No gráfico de marcação no canto inferior esquerdo, anote seu potencial inicial de membrana e pressione Enter. À medida que o experimento continua, você pode escrever o nome das drogas que estão sendo usadas. Uma vez que o experimento acabou, selecione Parar no canto superior esquerdo da tela. NOTA: Usamos o software WinEDR ou WinWCP para executar o TEVC porque estes são gratuitos e adequados para experimentos, mas qualquer outro software disponível pode ser usado.</li>
	</ol></li>
	<li>Coma todas as soluções de medicamentos necessárias para realizar o experimento (por exemplo, GABA, Kainate) e confirmar que as válvulas de solução estão funcionando corretamente ligando-as e desligando-as e observando o deslocamento das válvulas de beliscão.</li>
	<li>Encha os tubos despejando a solução correspondente no recipiente de seringa conectado ao tubo e rotule o controlador da válvula para se correlacionar com os tubos da solução. Certifique-se de que o fluxo da solução é constante, não há bolhas e que o sistema de vácuo está funcionando corretamente.</li>
	<li>Configure o microscópio e a área da câmara de gravação. Coloque as pontes de ágar (veja abaixo) nos respectivos orifícios circulares atrás da câmara de gravação (distal da área de manuseio), conectando os poços para os eletrodos usados como referência de solo e a câmara de gravação. Adicione a solução de trabalho do Ringer (1x) à câmara de gravação e aos poços de eletrodos de referência de solo.<ol>
<li>As pontes de ágar são tubos de borossilicato em forma de U, de 2-3 cm de comprimento, preenchidos com 3% de ágar na solução de Ringer. Faça tubos em forma de U cortando tubos de 15 cm de comprimento, dobrando-os na chama aberta e, em seguida, enchendo-os com ágar quente de 3% usando uma seringa de insulina. Armazene pontes de ágar cheias na solução de Ringer na geladeira até o uso.</li>
		<li>Faça 20x a solução de estoque da Ringer da seguinte forma: Em 1 L de água destilada, adicione 134,4 g de NaCl, 2.982 g de KCl, 5,29 g de CaCl2 e 23,83 g de HEPES (4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido). Para a solução de trabalho da Ringer 1x, em um frasco volumoso, adicione 200 mL da solução de estoque da Ringer (20x) a 3.800 mL de água destilada.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare eletrodos de prata clorados antes de cada experimento por eletrólise colocando fios de prata na solução de 3 M KCl e conectando o eletrodo de prata ao terminal positivo de uma bateria de 9 V. Depois de cerca de 3 min uma camada marrom sólida de AgCl é depositada no eletrodo. Coloque os fios de eletrodo de prata clorado na carcaça do eletrodo. NOTA: A referência do solo e a gravação de eletrodos clorados são eletrodos de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl).</li>
	<li>Remova as agulhas de borossilicato da solução KCl. Use uma seringa para extrair uma pequena quantidade de solução KCl da extremidade aberta da agulha de eletrodo e substituir a solução KCl por óleo mineral; isso evitará a evaporação da água e mudanças na concentração de KCl dentro da agulha. Deslize a agulha de vidro sobre o fio de eletrodo de prata clorado e aperte-as no lugar.</li>
	<li>Usando os manipuladores direito e esquerdo segurando os eletrodos, guie as agulhas de eletrodo para a câmara de gravação que está cheia de Solução de Ringer.</li>
	<li>Verifique a resistência de cada eletrodo zerando os botões de deslocamento Vm e Ve e, em seguida, pressionando os botões de teste de eletrodo . A resistência deve ser entre 0,5-3 MΩ (lida diretamente como 5-30 mV na tela). Se a resistência estiver fora do alcance, substitua usando novos microeletros.</li>
	<li>Encha a câmara de gravação com a solução fresca de Ringer. Usando uma pipeta de vidro, coloque um oócito não injetado ou microtransplantado no centro da câmara de gravação. Certifique-se de que o oócito esteja claramente visível sob o microscópio, com o lado animal para cima (consulte NOTA na etapa 3.4).</li>
	<li>Guie o eletrodo para a solução do Ringer até que toquem a membrana oócito. Furar suavemente a membrana oócito no lado animal (ver NOTA na etapa 3.4) com ambos os eletrodos e registrar o potencial da membrana de repouso. Ligue o fluxo de solução do Ringer.</li>
	<li>Utilizando o amplificador de grampo oócito, altere o modo para Grampo de Tensão e ajuste a tensão de retenção de -80 mV. A corrente no monitor deve ser negativa, geralmente entre 0 e 0,4 microamperes.</li>
	<li>Crie um novo arquivo para salvar a gravação como Arquivo > Nova > Salve a Gravação no software. Comece a gravar, pressione gravar > gravar para disco. Adicione informações relevantes ao arquivo usando a caixa de marca de diálogo (nome do teste, drogas usadas, etc.).</li>
	<li>Aplique agonistas (por exemplo, GABA, glutamato ou kainate) para estimulação química, abrindo as válvulas e perfundiando-as na câmara de gravação por 15 s. Normalmente, use um ganho de 10x para traçar o número máximo de pontos e reconstruir a resposta. Se as correntes forem muito pequenas, aumente a amplificação ou ganho, para que sejam avaliadas e visíveis. Sempre anote essas mudanças. NOTA: A duração da perfusão depende do paradigma experimental. Se o objetivo principal é medir a amplitude máxima, 15 s serão suficientes para atingir o pico para GABA ou o planalto para kainate.</li>
	<li>Monitore sempre os níveis de solução. A solução do Ringer precisará ser reabastecida com frequência, pois é usada entre todos os usos da solução. Uma vez concluída a gravação, gire o grampo de tensão para a posição OFF e desligue a válvula de solução do Ringer. Remova o oócito. Pare de gravar e salve o arquivo. Repita estes passos para todos os oócitos injetados.</li>
</ol>5. Analisando gravações de TEVC
<ol><li>Guarde uma cópia das gravações em uma unidade USB. A partir daí, abra o arquivo desejado para ser analisado. No arquivo que abre, a gravação pode ser visualizada, marcada e medida. A análise mais comum inclui medição de amplitude máxima, tempo de ativação, dessensibilização e resumo de aplicações repetitivas.</li>
	<li>Meça a resposta máxima do AMPA e a resposta máxima do GABA. Para adquirir essas medidas, primeiro estabeleça um nível zero ou linha de base, encontrando a linha vermelha com o cursor e arrastando-a para a corrente gerada pelo aplicativo Ringer ou linha de base.</li>
	<li>Uma vez estabelecido o nível zero, determine as medidas de resposta usando o mouse para arrastar o cursor de leitura vertical e verde para a parte desejada do rastreador gráfico. Se quiser, exporte os traços a serem analisados em qualquer outro software preferencial NOTA: Se o nível zero não puder ser definido ou houver muito ruído indicado no rastreador, exporte o arquivo WinEDR para um software analítico offline, que permitirá modificações para fornecer uma linha de base de nível e a adição de filtros a fim de reduzir o ruído.</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A análise de complexos proteicos nativos do cérebro humano é necessária para entender processos homeostáticos e patológicos em distúrbios cerebrais e desenvolver estratégias terapêuticas para prevenir ou tratar doenças. Assim, os bancos cerebrais contendo amostras congeladas instantâneas são uma fonte inestimável de uma grande e principalmente inexplorada riqueza de informações fisiológicas29,30. Uma preocupação inicial para o uso do tecido pós-morte é a clara po...

Distúrbios neurodegenerativos afetam grande parte da população. Embora suas consequências devastadoras sejam bem conhecidas, a ligação entre as alterações funcionais dos receptores neurotransmissores, que são críticas para a função cerebral, e sua sintomatologia ainda é mal compreendida. A variabilidade inter-individual, a natureza crônica da doença e o início insidioso dos sintomas são apenas algumas das razões que atrasaram a compreensão das muitas doenças cerebrais onde os desequilíbrios químicos estão bem documentados 1,2. Modelos animais geraram informações inestimáveis e expandiram nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à fisiologia e à fisiopatologia em sistemas conservados evolutivos; no entanto, várias diferenças entre roedores e humanos impedem a extrapolação direta da função receptora de modelos animais para o cérebro humano3. Assim, os esforços iniciais para estudar receptores humanos nativos foram desenvolvidos pelo laboratório de Ricardo Miledi utilizando tecido removido cirurgicamente e amostras congeladas. Esses experimentos iniciais utilizaram membranas inteiras que incluem receptores sinápticos neuronais e extra-sinápticos, bem como receptores neurotransmissores não neuronais, e embora forneçam informações importantes sobre estados doentes, há uma preocupação de que a mistura de receptores complica a interpretação dos dados 4,5,6,7. É importante ressaltar que as sinapses são o principal alvo em muitas doenças neurodegenerativas 8,9; portanto, ensaios para testar as propriedades funcionais das sinapses afetadas são fundamentais para obter informações sobre mudanças relevantes para a doença que afetam a comunicação sináptica. Aqui, descreve-se uma modificação do método original: microtransplantação de membranas sinápticas (MSM), que se concentra na caracterização fisiológica de preparações de proteína sináptica enriquecida e foi aplicada com sucesso para estudar sinapttos de ratos e humanos 10,11,12,13,14,15 . Com essa metodologia, é possível transplantar receptores sinápticos que antes trabalhavam no cérebro humano, embutidos em seus próprios lipídios nativos e com sua própria coorte de proteínas associadas. Além disso, como os dados do MSM são quantitativos, é possível usar esses dados para se integrar com grandes conjuntos de dados proteômicos ou sequenciamento10.
É importante notar que muitas análises farmacológicas e biofísicas de receptores sinápticos são feitas em proteínas recombinantes16,17. Embora essa abordagem forneça uma melhor visão das relações estrutura-função dos receptores, não pode fornecer informações sobre complexos receptores multimédicos encontrados nos neurônios e suas mudanças na doença. Portanto, uma combinação de proteínas nativas e recombinantes deve fornecer uma análise mais abrangente dos receptores sinápticos.
Existem muitos métodos para preparar sinapstos 10,11,12,13,14,15 que podem ser ajustados para os requisitos de um laboratório. O protocolo começa com a suposição de que as preparações enriquecidas sinaptosômicas foram isoladas e estão prontas para serem processadas para experimentos de microtransplante. No laboratório, o método Syn-Per é usado seguindo as instruções do fabricante. Isso é feito por causa da alta reprodutibilidade em experimentos eletrofisiológicos10,11. Há também literatura abundante explicando como isolar xenopus oócitos18,19, que também podem ser comprados prontos para injeção20.

<table><tbody><tr><td><forte>Para microinjeção< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5 "capilares de vidro</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G / X</td><td></td></tr><tr><td>24 poços, placa de cultura de tecidos de fundo plano</td><td>Thermofisher</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>extrator de micropipeta tipo flamejante / marrom</td> Prato de injeção <td>Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Thermofisher</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Thermofisher</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Rede industrial de</td><td>malha de nylon</td><td>WN0800</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermofisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Thermofisher</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>Banho de limpeza ultrassônica</td><td>Thermofisher</td><td>FS20D</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis sapos</td><td>Xenopus 1</td><td>4217</td><td></td></tr><tr><td>Para dois eletrodos Braçadeira de tensão</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm de comprimento capilares de vidro borossilicato polido a fogo</td><td>Sutter</td><td>B200-116-15</td><td></td></tr><tr><td>Qualquer computador PC ou laptop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro Bessel Passa-baixa</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>Estação de trabalho de braçadeira de tensão de dois eletrodos</td><td>Warner Instruments</td><td>TEV-700</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink 8.2 Controlador de Perfusão</td><td>Automate Scientific</td><td>SKU:01-18</td><td></td></tr><tr><td>WInEDR Software livre</td><td>Universidade de Strathclyde Glasgow</td><td>https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td></tr><tr><td>Série X DAQ multifuncional</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6341</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium dichloride</td><td>Thermofisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Cálcio nitrato tetrahidratado</td><td>Thermofisher</td><td>C109</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico)</td><td>Thermofisher</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Ácido caínico</td><td>Tocris</td><td>0222</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Thermofisher</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Thermofisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Thermofisher</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Thermofisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-0.1 &micro; m Filtro MC,</td> <td>Amicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microtransplantação de membranas sinápticas para reativar receptores sínpticos humanos para estudos funcionais

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Receptores ionotrópicos excitatórios e inibitórios são os principais portões de fluxos de íons que determinam a atividade de sinapses durante a comunicação neurológica fisiológica. Portanto, alterações em sua abundância, função e relações com outros elementos sinápticos têm sido observadas como uma grande correlação de alterações na função cerebral e comprometimento cognitivo em doenças neurodegenerativas e transtornos mentais. Entender como a função dos receptores sinápticos excitatórios e inibitórios é alterada pela doença é de fundamental importância para o desenvolvimento de terapias eficazes. Para obter informações relevantes sobre doenças, é importante registrar a atividade elétrica de receptores neurotransmissores que permanecem funcionais no cérebro humano doente. Até agora esta é a abordagem mais próxima para avaliar alterações patológicas na função dos receptores. Neste trabalho, é apresentada uma metodologia para realizar a microtransplantação de membranas sinápticas, que consiste em reativar membranas sinápticas a partir de tecido cerebral humano congelado que contém receptores humanos, por sua injeção e fusão posterior na membrana de oócitos Xenopus laevis . O protocolo também fornece a estratégia metodológica para obter respostas consistentes e confiáveis dos receptores α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA) e γ-aminobutírico (GABA), bem como novos métodos detalhados que são usados para normalização e análise rigorosa de dados.

Poucas horas após a injeção, as membranas sinápticas, carregando seus receptores neurotransmissores e canais de íons, começam a se fundir com a membrana plasmática oócica. A Figura 1 mostra gravações de receptores AMPA e GABAA microtransplantados em oócitos xenopus. Para a maior parte da análise, as respostas de dois ou três oócitos por amostra foram medidas, utilizando dois ou três lotes de oócitos de diferentes sapos, para um total de seis a nove oócitos por amostra. Is...

O protocolo demonstra que, realizando microtransplante de membranas sinápticas em oócitos Xenopus laevis , é possível registrar respostas consistentes e confiáveis de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropônico e receptores de ácido γ-aminobutírico.

Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Distúrbios neurodegenerativos e de saúde mental resultam de mudanças na comunicação sináptica. Eventos multifatoriais mudam receptores sinápticos de maneiras que não entendemos completamente. A microtransplantação de membranas sinápticas fornece uma visão dessas alterações.A principal vantagem dessa técnica é a possibilidade de registrar a atividade de receptores cerebrais nativos trabalhando no cérebro humano e, portanto, representar as doenças que estamos estudando. Receptores sinápticos são os principais alvos da medicina que regula a atividade elétrica do cérebro, mas entendendo como esses receptores mudam, melhores terapias restaurando sua funcionalidade podem ser desenvolvidas. Este método tem sido aplicado com sucesso a diferentes espécies, desde insetos, peixes, mamíferos, mas também pode ser aplicado a receptores de membrana fora do cérebro, por exemplo, músculos e tumores.As possibilidades são amplas. Cortar agulhas de injeção é complicado. Muito pequeno pode prevenir a injeção de proteína, e dois grandes podem matar a célula.Ajuda a usar uma medida consistente, como a borda de uma lâmina de barbear. Comece por sonicar as amostras selecionadas preparadas da região cerebral humana de interesse três vezes em um banho com gelo molhado flutuante. Use cinco ciclos de segundo cada vez e espere por um minuto no gelo molhado entre os ciclos.Coloque um microliter da amostra sobre o termoplástico e faça um recuo na superfície, se necessário, antes da colocação da amostra para evitar o movimento da amostra. Use os botões do manipulador segurando o nanoinjetor para posicionar a agulha e mova-a em direção à amostra a ser preenchida. Uma vez que a ponta da agulha esteja na amostra, pressione e segure o botão de preenchimento até que a amostra suficiente seja colhida.Cerca de 0,5 amostra de microliter é necessária para 10 oócitos. Use os botões para mover a agulha do nanoinjetor de volta para a posição mais alta. Penetre o oócito logo abaixo da superfície com uma agulha, não mais profunda, e use o pedal do pé para injetar a amostra.Espere cerca de dois a três segundos. Após a injeção bem sucedida, a célula se expandirá. Use os botões no manipulador para sair da célula.Mova a placa de Petri para que o próximo oócito esteja alinhado com a agulha. Repita o processo até que o número desejado de oócitos no prato tenha sido injetado, em seguida, retraia o nanoinjetor à sua posição original e remova a agulha. Certifique-se de que um poço de oócitos seja deixado sem injeção para ser usado como controle.Ligue todos os equipamentos usados para a gravação das correntes de íons, depois ligue o computador desktop e faça login na versão WinEDR 3.9.1. Certifique-se de que o programa está em execução e o registro está definido como Disc. Depois disso, defina a duração da gravação e limpe a opção Simulador.Para a seção de eletrodos de tensão, desligue a compensação da capacidade negativa. Defina o interruptor seletor de ganhos para 10 para a seção de eletrodo de banho e, em seguida, ajuste o interruptor de alternação de três posições, que seleciona o multiplicador de ganhos, para x1. As luzes LED indicarão a seleção multiplicadora de ganhos.Desligue o seletor do modo de fixação, coloque o controle de ganho dc e ajuste o controle de ganho para cerca de metade do loop aberto de largura de banda completa. Defina comandos para 40 milvolts, os controles de resarção para negativo e o multiplicador de escala para x2. Para o eletrodo atual, use o deslocamento VE para estabelecer uma referência zero, antes de empalar o oócito.Em seguida, abra o software WinEDR versão 3.9.1, vá para o menu superior e selecione Arquivo, seguido pelo Novo. Crie sua própria pasta e salve o arquivo. No menu principal, selecione Gravar, seguido de Gravar para Disco.Coloque as pontes de ágar nos respectivos orifícios circulares atrás da câmara de gravação, conectando os poços para os eletrodos usados como referência de terra na câmara de gravação. Adicione a solução de trabalho do Ringer 1x à válvula de perfusão correspondente. Abra a válvula até que a câmara de gravação esteja cheia de Solução ringer.Usando os manipuladores direito e esquerdo segurando os eletrodos, guie as agulhas de eletrodo para a câmara de gravação que está cheia de Solução de Ringer. Verifique a resistência de cada eletrodo zerando os botões de deslocamento VM e VE e, em seguida, pressionando os botões de teste de eletrodo. A resistência deve ser entre 0,5 a 3 megaohm.Se a resistência estiver fora do alcance, substitua-a usando novos microeletros. Em seguida, encha a câmara de gravação com a solução de Ringer fresca. Use uma pipeta de vidro para colocar um oócito não injetado ou micro transplantado no centro da câmara de gravação.Certifique-se de que o oócito é claramente visível sob o microscópio com o lado animal para cima. Guie o eletrodo para a Solução do Ringer até que toquem na membrana oócito. Fure suavemente a membrana oócito no lado animal com os dois eletrodos, e registe o potencial da membrana de repouso.Ligue o fluxo de solução do Ringer. Usando o Amplificador de grampo oócito, altere o modo para fixação de tensão lentamente, e ajuste a tensão de retenção para 80 milvolts. A corrente no monitor deve ser negativa, geralmente entre 0 e 0,4 microamperes.Vá para File, New e, em seguida, salve a gravação no software para criar um novo arquivo e salve a gravação. Pressione a Gravação seguida de Gravação para Disco para iniciar a gravação. Adicione informações relevantes ao arquivo usando o diálogo Mark Chart.Aplique agonistas para estimulação química abrindo as válvulas e perfundiando-as na câmara de gravação por 15 segundos. Uma vez concluída a gravação, gire o grampo de tensão para a posição de desligar e desligue a válvula de solução do Ringer. Remova o oócito e descarte seguir a política institucional para amostras de cérebro humano, em seguida, pare a gravação e salve o arquivo.Guarde uma cópia das gravações em uma unidade USB. A partir daí, abra o arquivo desejado para ser analisado. Para medir a resposta máxima DO AMPA e a resposta máxima do GABA A, primeiro, estabeleça um nível 0 ou linha de base, encontrando a linha vermelha e arraste-a para a corrente gerada pelo aplicativo Ringer ou linha de base.Uma vez estabelecido o nível 0, determine as medidas de resposta arrastando o cursor vertical verde para a parte desejada do rastreador gráfico. Foram registradas correntes de íons dos oócitos injetados com as membranas dos receptores sinápticos humanos. Os receptores AMPA foram ativados com 100 receptores de kainate micromolar, e receptores GABA A com um GABA milimolalar.Co-injeção das membranas filtradas do órgão elétrico do torpedo, rico em receptores de acetilcolina, e codificação cDNA para o receptor da linha GABA um no polo animal produziram principalmente dois grupos de oócitos, com base em suas respostas. Um grupo de oócitos teve grandes respostas à acetilcolina, mas nenhuma resposta a um micromolar GABA. Os oócitos em outro grupo tiveram respostas nulas ou baixas à acetilcolina, mas grandes respostas ao GABA.A imagem gráfica mostra a média mais menos erro padrão da média de pico de corrente no grupo um e no grupo dois. Um oócito no grupo dois tinha grandes respostas gaba e acetilcolina, sugerindo a ruptura do núcleo. Consequentemente, a distribuição das respostas foi distorcida a valores baixos, conforme observado pela diferença entre a média e a mediana da distribuição da corrente de membrana.Uma das causas dos oócitos de baixa resposta é que as membranas estão sendo injetadas e presas no núcleo do oócito. Respostas gaba e kainate de oócitos injetados nos polos animais ou vegetais com membranas não filtradas obtidas de um cérebro não-AD, e um cérebro de DA são mostrados aqui. Oócitos injetados perto do polo animal sem mirar o núcleo deram respostas maiores do que os oócitos injetados no polo vegetal, permitindo assim o estudo de amostras de tecido com um número muito baixo de receptores.Ao tentar este procedimento, monitore sempre o nível ringer. É sempre durante as gravações importantes que você vai acabar, e então ele vai usar o seu resultado, e morte do oócito, e perda de dados muito valiosos. Após este procedimento, podemos realizar cargas ocidentais para validar a presença dos receptores sinápticos, ou proteínas de interesse.Permite medir a excitação global para inibir as relações sinápticas em diferentes regiões cerebrais, e diferentes distúrbios cerebrais, permitindo fazer um teste direto na previsão teórica sobre as causas da doença.

microtransplantation-synaptic-membranes-to-reactivate-human-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Sinapses glutamatérgicas pode mudar de um modo ativo de um modo silencioso. Nós demonstramos que o status de atividade pré-sináptica da cultura dissociada dos neurônios dos roedores é visualizado através de um formulário fixable do FM1-43 corante para visualizar sinapses ativas e imunocoloração com vGluT-1 anticorpos para visualizar todas as sinapses de glutamato.

Sinapses pré-sináptico Silencioso Estudou com Microscopia de Luz

Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Este protocolo descreve um método novo para investigar uma forma de neuroestimulação química do wholemount rato as retinas em vitro com o neurotransmissor glutamato. Neuroestimulação química é uma alternativa promissora para a neuroestimulação elétrica convencional de neurônios da retina no tratamento de cegueira irreversível, causada por doenças degenerativas fotoreceptor.

Metodologia para neuromodulação Biomimetic químico de Retinas de ratos com o neurotransmissor glutamato em Vitro

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

O protocolo aqui apresentado permite o transplante de microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) no cérebro através de uma rota transnasal em camundongos imunocompetentes. O método de preparação e transplante transnasal das células e a administração da mistura de citocinas para a manutenção do iPSMG é mostrado.

Transplante de Microglia Pluripotente Pluripotente Induzido Humano em Microglia De camundongos imunocompetentes através da Rota Transnasal Não Invasiva

O transplante de neurônios GABAérgicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas gerados pela programação neuronal pode ser uma abordagem de tratamento potencial para distúrbios do neurodesenvolvimento. Este protocolo descreve a geração e o transplante de precursores neuronais GABAérgicos derivados de células-tronco humanas no cérebro de camundongos neonatais, permitindo a investigação a longo prazo de neurônios enxertados e a avaliação de seu potencial terapêutico.

Transplante de neurônios gabaérgicos derivados de células-tronco humanas no hipocampo de camundongo pós-natal precoce para mitigar distúrbios do neurodesenvolvimento

Aqui, descrevemos um protocolo de engenharia de células-tronco quimicamente reprogramadas para obter modulação neuronal precisa, diferenciando essas células em células precursoras dopaminérgicas, transplantando-as em modelos de camundongos da doença de Parkinson e avaliando resultados comportamentais e eletrofisiológicos para confirmar a integração bem-sucedida e a eficácia funcional das células transplantadas.

Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

Aprenda a técnica de microtransplantação de membranas sinápticas em oócitos de Xenopus laevis para registrar respostas de receptores AMPA e GABA. Este método permite estudar receptores cerebrais nativos relacionados a distúrbios neurodegenerativos.

Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

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