Name: Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a estudar a regeneração do epitélio intestinal após lesão por radiação gama em camundongos. Este protocolo rastreia células-tronco de reserva e dinâmicas de proliferação para compreender a recuperação tecidual.

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Os autores desejam agradecer ao Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pela assistência especializada com a preparação de espécimes de tecido e à Divisão de Recursos de Animais de Laboratório da Stony Brook University pela assistência com cuidados e manuseio de animais. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde DK124342 concedidos a Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 ao Dr. Vincent W. Yang.

Os autores não têm conflitos de interesse.

Este protocolo descreve um modelo robusto e reprodutível de lesão por radiação. Permite a análise precisa das alterações no epitélio intestinal ao longo de 7 dias pós-lesão. É importante ressaltar que os momentos selecionados refletem estágios cruciais da lesão e são caracterizados por alterações distintas no intestino (lesão, apoptose, regeneração e fases de normalização)60. Esse modelo de irradiação foi estabelecido e cuidadosamente avaliado, demonstrando uma manifestação de lesão adequada para ...

O epitélio intestinal humano cobriria aproximadamente a superfície de meia quadra de badminton se colocado completamente plano1. Em vez disso, essa única camada de células que separa os humanos do conteúdo de seus intestinos é compactada em uma série de projeções semelhantes a dedos, vilosidades e reentrâncias, criptas que maximizam a área de superfície dos intestinos. As células do epitélio diferenciam-se ao longo de um eixo cripta-vilosidade. As vilosidades consistem principalmente de enterócitos absorvedores de nutrientes, células caliciformes secretoras de muco e células enteroendócrinas produtoras de hormônios, enquanto as criptas consistem principalmente de células Paneth produtoras de defensina, células-tronco ativas e de reserva e células progenitoras 2,3,4,5. Além disso, a comunicação bidirecional dessas células com as células estromais e imunes do compartimento mesenquimal subjacente e a microbiota do lúmen gera uma complexa rede de interações que mantém a homeostase intestinal e é fundamental para a recuperação após a lesão6,7,8.
O epitélio intestinal é o tecido que mais rapidamente se auto-renova no corpo humano, com taxa de turnover de 2-6 dias 9,10,11. Durante a homeostase, células-tronco ativas na base das criptas intestinais (células colunares da base das criptas), marcadas pela expressão do receptor acoplado à proteína G 5 (LGR5), rico em leucina, rapidamente se dividem e fornecem células progenitoras que se diferenciam em todas as outras linhagens epiteliais intestinais. No entanto, devido à sua alta taxa mitótica, as células-tronco ativas e seus progenitores imediatos são particularmente sensíveis à lesão por radiação gama e sofrem apoptose após irradiação 5,12,13,14. Ao serem perdidas, células-tronco de reserva e não-células-tronco (subpopulação de progenitores e algumas células terminalmente diferenciadas) dentro das criptas intestinais sofrem ativação e reposição do compartimento criptário basal, que pode então reconstituir populações celulares das vilosidades e, assim, regenerar o epitélio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreamento de linhagens, vários grupos de pesquisa têm demonstrado que células-tronco de reserva (quiescentes) são capazes de suportar a regeneração após a perda de células-tronco ativas 13,16,17,18,19,20,21,22. Essas células são caracterizadas pela presença do oncogene da proteína 1 do complexo policomb (Bmi1), do gene da transcriptase reversa da telomerase de camundongo (mTert), da homeobox de Hop (Hopx) e do gene da proteína 1 de repetição rica em leucina (Lrig1). Além disso, tem sido demonstrado que as células não estaminais são capazes de repor criptas intestinais em caso de lesão23,24,25,26,27,28,29,30,31. Em particular, tem sido demonstrado que progenitores de células secretoras e enterócitos sofrem desdiferenciação após lesão, revertem para células-tronco semelhantes e suportam a regeneração do epitélio intestinal. Estudos recentes identificaram células expressando múltiplos marcadores que possuem a capacidade de adquirir características semelhantes ao tronco no momento da lesão (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Surpreendentemente, Yu e col. mostraram que mesmo células Paneth maduras (LYZ+) podem contribuir para a regeneração intestinal37. Além disso, além de causar apoptose das células epiteliais intestinais e interromper a função da barreira epitelial, a irradiação resulta em disbiose da flora intestinal, ativação de células imunes e início de resposta pró-inflamatória, ativação de células mesenquimais e estromais38,39.
A radiação gama é uma ferramenta terapêutica valiosa no tratamento do câncer, especialmente para os tumorescolorretais40. No entanto, a irradiação afeta significativamente a homeostase intestinal, induzindo danos às células, o que leva à apoptose. A exposição à radiação causa múltiplas perturbações que retardam a recuperação do paciente e é marcada por lesão da mucosa e inflamação na fase aguda e diarreia, incontinência, sangramento e dor abdominal a longo prazo. Essa panóplia de manifestações é referida como toxicidade por radiação gastrointestinal. Além disso, a progressão da fibrose transmural e/ou esclerose vascular induzida pela radiação só pode se manifestar anos após o tratamento38,41. Simultaneamente à própria lesão, a radiação induz uma resposta de reparo nas células intestinais que ativa as vias de sinalização responsáveis por iniciar e orquestrar a regeneração42. A doença do intestino delgado induzida pela radiação pode originar-se da radioterapia pélvica ou abdominal fornecida a outros órgãos (como colo do útero, próstata, pâncreas, reto)41,43,44,45,46. A lesão por irradiação intestinal é, portanto, um problema clínico significativo, e um melhor entendimento da fisiopatologia resultante provavelmente fará avançar o desenvolvimento de intervenções para aliviar as complicações gastrointestinais associadas à radioterapia. Existem outras técnicas que permitem investigar a finalidade regenerativa do epitélio intestinal além da radiação. Modelos murinos transgênicos e químicos para estudar a inflamação e a regeneração a partir de então têm sido desenvolvidos47. O sulfato de sódio dextran (DSS) induz inflamação no intestino e leva ao desenvolvimento de características semelhantes às da doença inflamatória intestinal48. A combinação do tratamento da ESD com o composto pró-carcinogênico azoximetano (AOM) pode resultar no desenvolvimento de câncer associado à colite48,49. A lesão induzida por isquemia e reperfusão é outro método empregado para estudar o potencial regenerativo do epitélio intestinal. Esta técnica requer experiência e conhecimento cirúrgico50. Além disso, as técnicas citadas causam diferentes tipos de lesão do que a radiação e podem levar ao envolvimento de diferentes mecanismos de regeneração. Além disso, esses modelos são demorados, enquanto a técnica de radiação é bastante breve. Recentemente, métodos in vitro utilizando enteróides e colonóides gerados a partir do intestino e cólon têm sido utilizados em combinação com a lesão por radiação para estudar os mecanismos de regeneração intestinal51,52. No entanto, essas técnicas não recapitulam completamente o órgão quemodelam53,54.
O protocolo apresentado inclui a descrição de um modelo murino de lesão por radiação gama em combinação com um modelo genético que, após o tratamento com tamoxifeno, permite o rastreamento de linhagens originárias da população de células-tronco de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Esse modelo utiliza uma irradiação de corpo total de 12 Gy, que induz lesão intestinal significativa o suficiente para ativar células-tronco de reserva, ao mesmo tempo em que permite a investigação subsequente da capacidade regenerativa intestinal dentro de 7 dias após a lesão55.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>309659-16G Reutilizável Agulhas de alimentação para pequenos animais: Reta</td><td>VWR</td><td>20068-630-27G</td><td></td></tr> <tr><td>x agulha de 1/2"</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>305109-28G x 1/2" Seringa de insulina Monoject 1mL</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr> 1188128012-5-Etinil-2<tr><td>&prime;-desoxiuridina (EdU)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc284628A</td><td>10 mg/mL em DMSO estéril: água (1:4 v/v), alíquota e armazenar em -20&deg; C</td></tr><tr><td>Azer Scientific&nbsp; 10% de Formalina Tamponada Neutra</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213-B6.129X1-Gt</td><td></td></tr><tr><td>(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>A Cepa do Laboratório Jackson</td><td>#:006148</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #:010531</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina Fraction V, choque térmico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Frango anti-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 kit de imagem, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10638-Óleo</td><td></td></tr> de <tr><td>milho</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267-Decloaking</td><td></td></tr> <tr><td>Chamber</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012-Dimetilsulfóxido</td><td></td></tr> <tr><td>(DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>proteinase livre de DNase</td> sensível à luz K <td>Invitrogen</td><td>C10618H</td><td>diluída 25x em DPBS</td></tr><tr><td>Donkey anti-frango AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Microscópio de</td> Fluorescência Scientific <td>21-031-CV-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S176</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 90i Luz brilhante e fluoerescente, com objetivas: 10X, 20X</td><td>Meio</td> de Montagem Aquosa Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Cell 40 Exactor</td><td>Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0,759 Gy min-1</td></tr><tr><td>Goat anti-coelho AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina, Gill No. 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 micrótomo rotativo da Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-900-668</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, pentahidratado (bis-benzimida)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Solução</td> de peróxido de hidrogênio <td>diluição H3569 1:1000</td></tr><tr><td>, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td> Kit de detecção de morte celular in situ <td>Fisher Scientific</td><td>18-603-252-In</td><td></td></tr><tr><td>, Fluoresceína (Roche)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de líquidos Super PAP PEN, Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de lítio (pó/ACS certificado), Fisher Chemical</td><td>Seringa Luer-Lok Fisher Scientific</td><td>L119-500</td><td>0.5g/1L dH2O</td></tr><tr><td>estéril, uso único, 10 mL</td><td>VWR</td><td>89215-218-Metanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Produtos Pharmco&nbsp; Álcool etílico, 200 PROOF</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Ácido Acético Grau ACS</td><td>Capitol</td><td>Scientific AAP-281000ACSCSLT-Rabbit</td><td></td></tr> <tr><td>anti-Ki67</td><td>BioCare Medical</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Meio de Montagem</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Scientific Industries-Genie para assar lâminas a 65 graus</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Sódio Dihidratado</td> Kit de Dissecação de Aço Inoxidável <td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus micro lâminas [tamanho: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>30 mg/mL em óleo de milho estéril, de preferência fresco ou armazenamento de curto prazo em -20&deg; C, Suportes de</td></tr><tr><td>24 Lâminas Tissue-Tek sensíveis à luz com alça destacável</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Accu-Edge&nbsp; Lâminas de Perfil Baixo</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Conjunto de coloração manual</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prato de coloração, Verde com tampa</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Prato de coloração Tissue-Tek, Branco com tampa</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>de Processamento Unisette</td><td>VWR</td><td>87002-292-VWR</td><td></td></tr> <tr><td>Micro Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

regeneração epitelial intestinal em resposta à irradiação ionizante

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

O epitélio intestinal consiste de uma única camada de células, mas contém múltiplos tipos de células terminalmente diferenciadas, que são geradas pela proliferação ativa de células-tronco intestinais localizadas no fundo das criptas intestinais. No entanto, durante eventos de lesão intestinal aguda, essas células-tronco intestinais ativas sofrem morte celular. A irradiação gama é um tratamento de câncer colorretal amplamente utilizado, que, embora terapeuticamente eficaz, tem o efeito colateral de esgotar o pool ativo de células-tronco. De fato, os pacientes frequentemente experimentam síndrome de radiação gastrointestinal durante a radioterapia, em parte devido à depleção ativa de células-tronco. A perda de células-tronco intestinais ativas em criptas intestinais ativa um pool de células-tronco intestinais de reserva tipicamente quiescentes e induz a desdiferenciação de células precursoras secretoras e enterocitárias. Se não fossem essas células, o epitélio intestinal não teria a capacidade de se recuperar da radioterapia e de outros grandes insultos teciduais. Novos avanços em tecnologias de rastreamento de linhagem permitem o rastreamento da ativação, diferenciação e migração de células durante a regeneração e têm sido empregados com sucesso para estudar isso no intestino. Este estudo tem como objetivo descrever um método para a análise de células dentro do epitélio intestinal de camundongos após lesão por radiação.

O uso de irradiação de corpo total (TCE) de 12 Gy em combinação com o rastreamento de linhagem genética murina permite uma análise completa das consequências da lesão por radiação no intestino. Para começar, Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP receberam uma única injeção de tamoxifeno, que induz a expressão aumentada da proteína fluorescente amarela (EYFP) dentro de uma população de células-tronco de reserva Bmi1+ . Dois dias após a injeção de tamoxifeno, os camundongos foram subm...

O trato gastrointestinal é um dos órgãos mais sensíveis à lesão no tratamento radioterápico do câncer. É simultaneamente um sistema orgânico com uma das mais altas capacidades regenerativas após tais insultos. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a capacidade regenerativa do epitélio intestinal.

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

A irradiação gama é um tratamento amplamente utilizado para o câncer colorretal. E embora seja terapeuticamente eficaz, tem efeitos negativos sobre o trato gastrointestinal. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a ativação, diferenciação e migração de células durante a regeneração após lesão por radiação.Este protocolo descreve um modelo robusto e reprodutível de lesão por radiação. É importante ressaltar que este modelo permite rastrear o destino das células intestinais após a lesão e, assim, fornece uma melhor compreensão da capacidade regenerativa de uma subpopulação celular específica. Esta técnica pode empregar modelos animais distintos de rastreamento de linhagem para estudar o comportamento em tempo real e a interação de várias subpopulações de células pós-lesão.Pequenas modificações neste protocolo devem permitir a investigação das relações entre a microbiota e diferentes populações epiteliais, estromais e de células imunes após a lesão por radiação. Para começar, ressuspenda o pó de tamoxifeno em óleo de milho estéril a uma concentração de 30 microgramas por microlitro. Sonicate por três minutos em ciclos de liga-desliga de 30 segundos com 60% de amplitude.Misture por rotação no escuro durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, prepare EdU adicionando DMSO estéril ao pó de EdU. Adicione 1/5 do volume total e adicione lentamente o volume restante de água ultrapura estéril.Quando completamente dissolvido, alíquota e armazenar a 20 graus Celsius. Preparar reagentes para coleta e fixação de tecidos, como etanol 70% em água, DPBS resfriado a quatro graus Celsius, tampão fixador de Bouin e formalina tamponada a 10%. Em seguida, prepare os equipamentos necessários, como um kit de dissecção de camundongos, placas de Petri, uma agulha de gavagem de calibre 16 acoplada a uma seringa de 10 mililitros e histológicas.Dois dias antes da exposição à irradiação gama, preparar os animais experimentais para a injeção de tamoxifeno. Pesar cada animal e calcular a dosagem necessária. Desinfetar a região abdominal com etanol 70%.Em seguida, administrar uma dose única de tamoxifeno por via intraperitoneal usando uma agulha de calibre 27 acoplada a uma seringa de um mililitro para induzir a recombinação mediada por Cre. Observar os animais nas próximas 48 horas para excluir toxicidade potencial do tamoxifeno. Após 48 horas, transferir os animais para a sala de irradiação.Desinfetar a câmara de amostras no irradiador gama com solução de etanol a 70%. Coloque a esteira absorvente e os animais dentro da câmara de amostras. Coloque a tampa e feche a câmara.Programar o irradiador gama para expor os animais à irradiação corporal total de 12 cinzas. Em seguida, vire a tecla para a posição inicial e pressione start para iniciar a exposição. Deixe a sala para o tempo de exposição ativa.Após o tempo predefinido, a máquina irá parar automaticamente e começará a apitar. Desligue a máquina girando a chave na posição de parada. Abra a câmara de amostra e retire a tampa.Transferir os animais para a gaiola e desinfetar a câmara de amostra com etanol 70%. Transfira os animais de volta para o alojamento convencional e observe sua condição pós-tratamento. Monitore o peso dos animais todos os dias.Três horas antes da eutanásia planejada, desinfete a área abdominal e injete os camundongos intraperitonealmente com 100 microlitros de solução estoque de EdU usando uma seringa de insulina de calibre 28. Após a eutanásia do animal, coletar os intestinos proximais em diferentes momentos pós-irradiação. Disseque a parte proximal do intestino delgado e remova os tecidos anexados.Lave o tecido com DPBS fria usando uma agulha de alimentação reta de calibre 16 conectada a uma seringa de 10 mililitros e fixe o tecido com o tampão fixador de Bouin. Corte os intestinos abertos longitudinalmente e enrole os intestinos proximais usando a técnica Swiss-roll. Colocar os tecidos em um histológico em um recipiente com formalina tamponada a 10% e incubá-lo por 24 a 48 horas à temperatura ambiente.Após a incubação, transferir as histológicas para etanol 70% e incorporar o tecido em parafina. Após a incorporação, colocar os histológicos no gelo por pelo menos uma hora. Em seguida, corte seções horizontais de cinco mícrons de espessura usando um micrótomo.Transfira as seções de tecido para um banho-maria aquecido a 45 graus Celsius e coloque as seções em lâminas carregadas. Deixe as corrediças em um rack durante a noite em temperatura ambiente para secar. Imagens de hematoxilina e eosina de espécimes do intestino delgado mostraram um epitélio intestinal homeostático em zero hora, seguido pela perda de células dentro dos compartimentos das criptas durante a fase apoptótica.Seguiu-se a fase regenerativa em que células altamente proliferativas povoaram as criptas, levando à fase de normalização no sétimo dia. O rastreamento de linhagens por EYFP mostrou que, durante a homeostase, as células originárias de células-tronco de reserva positivas para Bmi1 foram restritas às posições de mais quatro a mais seis dentro das criptas. As colorações de EdU e Ki-67 mostraram homeostase intestinal normal em camundongos sham irradiados, estendendo-se de células-tronco ativas através da zona de amplificação de trânsito.Durante a fase apoptótica, o número de células positivas para EYFP diminuiu, acompanhado por uma perda de células proliferativas causada por danos por radiação. Na fase regenerativa, observou-se ativação de células-tronco de reserva e rápida proliferação de células positivas para Bmi1. A proliferação e migração posteriores restauraram a integridade do epitélio intestinal.A coloração TUNEL mostrou que as células apoptóticas estão ausentes durante a homeostase. Um aumento na coloração TUNEL foi observado tardiamente na fase apoptótica. Durante a fase regenerativa, a coloração TUNEL diminuiu constantemente dentro das criptas regeneradoras e quase esteve ausente quando as criptas normalizaram.Esta técnica pode ser combinada com sequenciamento de RNA, sequenciamento de RNA de célula única, classificação de células ativadas por fluorescência ou análise proteômica para obter conhecimento mais aprofundado sobre o papel de linhagens celulares específicas durante a regeneração intestinal após lesão. Os pesquisadores podem investigar as interações entre a microbiota e as populações de células epiteliais, estromais e imunes na regeneração intestinal para expandir a compreensão da capacidade regenerativa do epitélio intestinal.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação a laser alvo de células renais dos néfrons nos...

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Um método eficaz para enxerto de tecido de tamanho definido e consistente entre planaria é descrito. Também incluído é uma descrição de como a técnica de imobilização utilizado para transplante pode ser adaptado, em conjugação com escudos de chumbo, para a irradiação parcial de animais vivos.

Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

Apresentamos um protocolo para investigar o crosstalk entre Caco-2 X-ray-irradiados e células mononucleares do sangue periférico (PBMC). O protocolo começa com a instalação e Caco-2 irradiação da cultura co com PBMC; posteriormente, resistência elétrica trans-epitelial é medida regularmente durante 48 h e ocidental do borrão realizados em PBMC e Caco-2.

Um método de co-cultura para investigar o Crosstalk entre raio-x irradiados PBMC e células Caco-2

Aqui, nós apresentamos um protocolo para estabelecer pontos finais importantes e os marcadores proliferative da lesão intestinal pequena e da hiperproliferação compensatória usando um modelo da mucosite quimioterapia-induzida. Nós demonstramos a deteção de pilhas proliferating usando um marcador específico do ciclo de pilha e usando o peso intestinal pequeno, a profundidade da cripta, e a altura do vilosidades como valores-limite.

Pontos de extremidade importantes e marcadores proliferativos para avaliar lesão intestinal pequena e adaptação usando um modelo de mouse de mucosite induzida por quimioterapia

Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Usar culturas queratinócitos tridimensionais para visualizar a morfologia e os marcadores funcionais de glândulas salivares pode fornecer introspecções novas nos mecanismos de dano de tecido depois da radiação. Descrito aqui é um protocolo para secção, cultura, irradiar, mancha, e imagem 50 – 90 μm de espessura secções salivares antes e após a exposição à radiação ionizante.

Tratamento de radiação de culturas organotypic de glândulas salivares submandibulares e parótidas modelos chave in vivo características

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

Apresentamos aqui um método para obter imagens do intestino após ferimento induzido por laser. Ao expor o intestino do camundongo a um laser multifóton, a perda de uma única ou múltiplas criptas é induzida localmente. Ao obter imagens repetidas da área danificada ao longo de meses, a dinâmica em tempo real da recuperação intestinal é capturada.

Ablação a Laser e Microscopia Intravital no Estudo do Remodelamento Intestinal

Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

A imagem por imunofluorescência é limitada pela capacidade de observar processos biológicos complexos e dependentes do tempo em apenas um único instantâneo no tempo. Este estudo descreve uma abordagem de imagem ao vivo conduzida em cortes de glândula submandibular de camundongos com corte preciso. Esta abordagem permite a observação em tempo real das interações célula-célula durante a homeostase e os processos de regeneração e reparo.

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

Aprenda a estudar a regeneração do epitélio intestinal após lesão por radiação gama em camundongos. Este protocolo rastreia células-tronco de reserva e dinâmicas de proliferação para compreender a recuperação tecidual.

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

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