Name: Fabricação e Uso de Andaimes Secos de Alginato Macroporoso para Transdução Viral de Células T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a fabricar andaimes secos de alginato macroporoso (Drydux) para transdução viral eficiente em células T ativadas. Este método simplificado oferece uma alternativa mais econômica e conveniente às técnicas convencionais.

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde através dos Números de Concessão R37-CA260223, R21CA246414. Agradecemos ao núcleo de citometria de fluxo da NCSU pelo treinamento e orientação na análise da citometria de fluxo. Os esquemas foram criados com Biorender.com

Todos os procedimentos envolvendo células de primazia humana e vetores retrovirais foram realizados em conformidade com as diretrizes de Segurança Biológica da Universidade Estadual da Carolina do Norte e aprovados pelo Escritório de Saúde e Segurança Ambiental. As células mononucleares do sangue periférico humano foram compradas como casacos de buffy de fontes comerciais. As células humanas primárias devem ser isoladas de frações de pelagem humana e requerem autorização de nível 2 de biossegurança e procedimentos operacionais padrão detalhados e aprovação da instituição onde o trabalho deve ocorrer. Os vetores virais, incluindo os sobrenadantes vetoriais retrovirais utilizados para a transdução preparada conforme descrito anteriormente19, podem ser classificados como Nível de Biossegurança 1 ou Nível de Biossegurança 2, dependendo da proteína codificada e requerem aprovação do comitê de biossegurança institucional relevante.
1. Fazendo os andaimes de alginato macroporoso
<ol><li>Preparar uma solução-mãe de gluconato D de cálcio a 0,4% (peso por volume) adicionando água desionizada filtrada estéril ao gluconato de cálcio D num copo. Mexa em velocidade média até que o gluconato de cálcio tenha se dissolvido (~1,5 h), filtro estéril e armazenar à temperatura ambiente. NOTA: Não é necessário verificar o pH da solução.</li>
	<li>Prepare uma solução de alginato a 2% (peso por volume) num frasco para injetáveis ou copo de tampa de rosca. Adicione cuidadosamente o alginato ultrapuro ao recipiente e adicione água deionizada filtrada estéril ao alginato. Escolha a maior barra de agitação possível que não impeça a mistura e adicione-a ao recipiente. NOTA: Informações sobre o tipo de alginato ultrapuro utilizado para este protocolo podem ser encontradas na Tabela de Materiais e no site da Novamatrix20. Diferentes alginatos não foram explorados para esses andaimes, pois podem levar a mudanças indesejadas na porosidade e biocompatibilidade dos andaimes 9,10,11.</li>
	<li>Mexa a solução a alta velocidade até que o alginato se dissolva (~1 h). Se houver grandes aglomerados nas laterais do vaso, incline o vaso para desalojá-los. Pequenas quantidades de alginato nos lados se dissolverão durante a agitação e não são motivo de preocupação. NOTA: Não é necessário verificar o pH da solução.</li>
	<li>Quando o alginato se dissolver, reduza a velocidade de agitação, adicione lentamente um volume igual de gluconato D de cálcio a 0,4% à solução de alginato para evitar a formação de aglomerados de reticulação e mexa vigorosamente por 15 min.</li>
	<li>Incline o copo ou o frasco para injetáveis para os lados para remover quaisquer aglomerados que possam ter se formado. NOTA: Recomenda-se usar um homogeneizador. A solução final deve ser opticamente clara.</li>
	<li>Pipetar o volume desejado da solução para cada poço de uma placa de 48 poços ou de 24 poços. Use 300 μL/poço para uma placa de 48 poços e 1 mL/poço para uma placa de 24 poços. Lance devagar e mude as pontas com frequência, pois a solução será viscosa e grudará na ponta.</li>
	<li>Cobrir as placas com tampas e congelar durante a noite a -20 °C.</li>
	<li>Prepare a placa para o liofilizador, removendo a tampa e prendendo o topo com lenços umedecidos e elásticos. Colocar as placas em frascos de liofilizador de 750 mL a 2.000 mL e colocar no liofilizador por 72 h.</li>
	<li>Após 72 h, retire a placa do liofilizador e substitua a tampa. Selar a placa e conservar a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, sele a vácuo a placa antes de armazenar a 4 °C. Mantenha seco até que seja necessário. NOTA: Faça uma solução extra de cálcio-alginato devido a erro de volume (alguns aderem às paredes do frasco para injetáveis, pontas de pipeta). Por exemplo, para fazer quatro andaimes em uma placa de 24 poços, são necessários 4 mL de solução combinada (2 mL de alginato + 2 mL de gluconato de cálcio D), mas recomenda-se preparar 2,5 mL de solução de alginato a 2% e 2,5 mL de solução de gluconato D de cálcio a 0,4%.</li>
</ol>2. Transdução
<ol><li>Concentração de sobrenadante viral utilizando filtros de 100 kDa<ol><li>Hidrate o filtro centrífugo por 2 min com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x. Descartar o PBS.</li>
		<li>Concentrar a suspensão viral adicionando 2 mL de suspensão viral (1 × 106 TU/mL) e centrifugando-a através do filtro centrífugo a 1.500 × g por 10 min em um rotor de caçamba oscilante. NOTA: Um a duzentos microlitros de vírus concentrado é necessário por andaime.</li>
		<li>Gire por alguns minutos adicionais se o volume concentrado de suspensão do vírus for maior que 200 μL.</li>
		<li>Repita as etapas 2.1.1-2.1.3 para cada andaime. NOTA: É igualmente aceitável concentrar uma grande unidade populacional de vírus e retirar alíquotas de 100-200 μL da unidade populacional concentrada.</li>
	</ol></li>
	<li>Células ativadas por sementes e vírus juntos.<ol><li>Para cada andaime, preparar uma alíquota suspendendo 1 × 106 células mononucleares ativadas do sangue periférico (PBMCs) em 50 μL de meio de cultura celular completo (250 mL de meio de clique + 250 mL de RPMI 1640 meios + 50 mL de soro fetal bovino + 5 mL de substituto de glutamina + 5 mL de penicilina/estreptomicina). Observação : consulte Arquivo suplementar 1 para obter um protocolo sobre como ativar PBMCs.</li>
		<li>Adicione o sobrenadante viral concentrado (~2 × 106 TU, MOI 2) à suspensão celular. O volume total da suspensão do vírus celular não deve exceder 200 μL para um andaime de 48 poços ou 350 μL para um andaime de 24 poços.</li>
		<li>Adicione a mistura célula-vírus gota a gota na parte superior do andaime seco. Para experimentos de controle negativo, use meios de cultura celular completos no lugar do vírus concentrado. Adicione a suspensão da célula à parte superior do andaime seco.</li>
		<li>Repita as etapas 2.2.1-2.2.3 para cada andaime.</li>
		<li>Incubar os andaimes numa incubadora de cultura celular a 37 °C durante 45-60 min. Remova os andaimes da incubadora; os andaimes absorverão totalmente a solução durante este tempo.</li>
		<li>Para induzir a proliferação, adicionar meios de cultura celular completos suplementados com IL-15 (5 ng/mL) e IL-7 (10 ng/mL) a cada poço; IL-2 também pode ser usado. Adicione 500 μL a cada andaime de 48 poços ou 1 mL a cada andaime de 24 poços.</li>
		<li>Incubar os andaimes a 37 °C durante 72 h. À medida que as células proliferam, a mídia se tornará laranja.</li>
	</ol></li>
	<li>Isole as células dos andaimes para análise.<ol><li>Diluir 0,5 M EDTA a 0,25 M EDTA em 1x PBS.</li>
		<li>Remova o excesso de meio de cada poço e colete em tubos de centrífuga separados de 15 mL.</li>
		<li>Para isolar as células do andaime, adicione 0,25 M EDTA a cada andaime. Adicione 300 μL a andaimes de 48 poços ou 1 mL a andaimes de 24 poços. Deixe a placa descansar ou agitar suavemente por 3-4 min.</li>
		<li>Uma vez que o andaime esteja praticamente dissolvido, pipete para dentro e para fora suavemente dentro do poço. Algumas etapas de pipetagem de entrada e saída podem ser necessárias para dissolver completamente o andaime. Se não se dissolver em 10 min, adicione mais 200 μL de 0,25 M EDTA.</li>
		<li>Uma vez que o andaime se dissolva completamente, transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Repita as etapas 2.3.4 e 2.3.5 para cada andaime.</li>
		<li>Lavar as células duas vezes adicionando 12 mL de PBS a cada tubo de centrífuga e centrifugando a 400 × g por 5 min. Um pellet de célula se formará na parte inferior de cada tubo. Aspirar o sobrenadante e repetir a lavagem. Tenha o cuidado de aspirar totalmente o sobrenadante a cada lavagem, pois é crucial remover todo o EDTA.</li>
		<li>Após a segunda lavagem com PBS, o pellet celular está agora pronto para análise. Siga o protocolo apropriado necessário para a análise.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

P.A. e Y.B. são inventores de patentes relacionadas ao uso de biomateriais para geração de terapias com células CAR-T. Y.B. recebe uma bolsa de pesquisa patrocinada pela indústria relacionada à tecnologia terapêutica de células CAR-T (não relacionada a este trabalho). Todos os outros autores declaram que não têm interesses concorrentes.

A terapia celular CAR-T continua a ganhar interesse tanto para pesquisas quanto para aplicações comerciais. Apesar do sucesso que a terapia com células CAR-T teve no tratamento de cânceres no sangue, o alto custo do procedimento limita seu uso. O protocolo aqui apresentado introduz um novo método para a transferência de genes virais de células T sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. A produção de andaimes de alginato macroporoso secos para mediar a transdução é relativamente simples e é...

A imunoterapia emergiu como um paradigma revolucionário de tratamento do câncer devido à sua capacidade de atingir especificamente tumores, limitar a citotoxicidade fora do alvo e prevenir a recaída. Particularmente, a terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ganhou popularidade devido ao seu sucesso no tratamento de linfomas e leucemias. A FDA aprovou a primeira terapia com células CAR-T em 2017 e, desde então, aprovou mais quatro terapias com células CAR-T 1,2,3,4,5. Os CARs têm um domínio de reconhecimento de antígeno geralmente consistindo de um fragmento variável de cadeia única de um anticorpo monoclonal que é específico para um antígeno associado ao tumor 3,4. Quando um CAR interage com seu antígeno associado ao tumor, as células CAR-T são ativadas, levando a uma resposta antitumoral envolvendo liberação de citocinas, degranulação citolítica, expressão do fator de transcrição e proliferação de células T. Para produzir células CAR-T, o sangue é coletado do paciente para obter suas células T. Os CARs são geneticamente adicionados às células T do paciente usando um vírus. As células CAR-T são cultivadas in vitro e infundidas de volta no paciente 2,3,4,6. A geração bem-sucedida de células CAR-T é determinada pela eficiência de transdução, que descreve o número de células T que são geneticamente modificadas em células CAR-T.
Atualmente, o padrão-ouro para a geração de células CAR-T é a espinoculação de células T ativadas e vírus em placas revestidas de retronectina 7,8. A transdução começa quando as partículas virais se envolvem com a superfície das células T. A retronectina promove a colocalização de vírus e células, aumentando a eficiência de ligação entre as partículas virais e as células, aumentando a transdução 7,8. A retronectina não funciona bem por si só e precisa ser acompanhada de espinoculação, o que aumenta a transferência gênica, concentrando as partículas virais e aumentando a permeabilidade superficial da célula T, permitindo uma infecção viral mais fácil8. Apesar do sucesso da espinoculação em placas revestidas de retronectina, é um processo complexo que requer múltiplos ciclos de rotação e reagentes caros. Portanto, métodos alternativos para a transferência de genes virais que são mais rápidos e mais baratos são altamente desejáveis.
O alginato é um polissacarídeo aniônico natural amplamente utilizado na indústria biomédica devido ao seu baixo custo, bom perfil de segurança e capacidade de formar hidrogéis após a mistura com cátions divalentes 9,10,11,12. O alginato é um polímero compatível com GMP e é geralmente reconhecido como seguro (GRAS) pela FDA13. A reticulação do alginato com cátions cria hidrogéis estáveis frequentemente utilizados na cicatrização de feridas, na entrega de pequenas drogas químicas e proteínas e no transporte celular 9,10,11,12,14,15,16. Devido às suas excelentes propriedades gelificantes, o alginato é o material preferido para criar andaimes porosos por liofilização10,17. Essas características do alginato o tornam um candidato atraente para a produção de um andaime que pode mediar a transferência de genes virais de células ativadas.
Descreve-se aqui um protocolo para a confecção de andaimes de alginato macroporoso secos, conhecidos como andaimes de Drydux, que transduziram estaticamente células T por transferência de genes virais17,18. O processo de fabricação desses andaimes é mostrado na Figura 1. Esses andaimes eliminam a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. Os andaimes de alginato macroporoso estimulam a interação de partículas virais e células T para permitir a transferência eficiente de genes em uma única etapa, sem afetar a funcionalidade e a viabilidade das células T modificadas17. Quando seguidos corretamente, esses andaimes de alginato macroporoso têm uma eficiência de transdução de pelo menos 80%, simplificando e encurtando o processo de transdução viral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema e linha do tempo do protocolo. (A) Linha do tempo para fazer os andaimes secos de alginato macroporoso. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite. Os andaimes congelados são liofilizados por 72 h para criar os andaimes Drydux. (B) Cronograma para transdução viral de células ativadas. As células ativadas e o vírus (MOI 2) são semeados no topo do andaime e incubados em meio completo suplementado com IL-7 e IL-15. Os andaimes absorvem a mistura e promovem a transferência de genes virais. O EDTA é usado para dissolver os andaimes e isolar as células transduzidas. Após a lavagem duas vezes com PBS, o pellet celular pode ser usado para análise. Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato; PBMCs = células mononucleares do sangue periférico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>UltraPure, pH 8.0</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Sem cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>3% Ácido Acético com Azul de Metileno</td><td>Stemcell Technologies Inc</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Células Mononucleares Sanguíneas Perifreais Ativadas</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Cálcio-D-Gluconato Alfa</td><td>Aesar fresco ou congelado</td><td>A11649</td><td></td></tr><tr><td>CD28.2 Anticorpo</td><td>BD</td><td>555725</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>CD3 Anticorpo</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-387</td><td>100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Click's Media</td><td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>DI Water</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Cytvia</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Media</td><td>Cytvia</td><td>SH3009601</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Células mononucleares do sangue periférico</td> <td>-</td><td></td> <td>PRONOVA</td></tr><tr><td>UP MVG</td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>fresco</td></tr> ou congelado <tr><td>IL-15 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>5 ng / mL</td></tr><tr><td>IL-7 humana recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>10 ng / mL</td></tr><tr><td>Retrovírus</td> <td>-</td><td></td> <td>1 x 106 TU / Ml</td></tr></tbody></table>

fabricação e uso de andaimes secos de alginato macroporoso para transdução viral de células t

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

A engenharia genética de células T para terapia com células CAR-T chegou à vanguarda do tratamento do câncer nos últimos anos. As células CAR-T são produzidas pela transferência de genes virais para as células T. O atual padrão-ouro de transferência de genes virais envolve a espinoculação de placas revestidas de retronectina, o que é caro e demorado. Há uma necessidade significativa de métodos eficientes e econômicos para gerar células CAR-T. Descrito aqui é um método para a fabricação de andaimes de alginato macroporosos secos e baratos, conhecidos como andaimes Drydux, que promovem eficientemente a transdução viral de células T ativadas. Os andaimes são projetados para serem usados no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas de retronectina semeadas com vírus e simplificam o processo de transdução de células. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite para criar os andaimes. Os andaimes congelados são liofilizados em um liofilizador por 72 h para completar a formação dos andaimes macroporosos secos. Os andaimes mediam a transferência de genes virais quando o vírus e as células T ativadas são semeados juntos no topo do andaime para produzir células geneticamente modificadas. Os andaimes produzem >85% de transdução primária de células T, o que é comparável à eficiência de transdução da espinoculação em placas revestidas de retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de alginato macroporoso secos servem como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.

Esses andaimes de alginato macroporoso são fáceis de fazer e devem sair do liofilizador como discos porosos, macios e brancos. Embora não estudada neste experimento, a solução de alginato de cálcio pode ser fundida em diferentes moldes para criar andaimes de formas variadas, dependendo das necessidades do usuário 9,10. Os andaimes são eletrostáticos e podem aderir à tampa da placa do poço ou a um dedo enluvado. A Figura 2 demonstra c...

Aqui está um protocolo para a criação de andaimes de alginato macroporoso secos que medeiam a transferência eficiente de genes virais para uso em engenharia genética de células T, incluindo células T para terapia com células CAR-T. Os andaimes demonstraram transduzir células T primárias ativadas com transdução de >85%.

Fabricação e Uso de Andaimes Secos de Alginato Macroporoso para Transdução Viral de Células T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Descrito neste vídeo é um protocolo para a criação e uso de andaimes de alginato macroporoso seco conhecidos como Drydux que promovem eficientemente a transdução de células T ativadas. O Drydux foi projetado para ser usado no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas com RetroNectin, semeadas com vírus e simplifica o processo de transdução de células. O Drydux tem uma eficiência de transdução comparável à espinoculação em placas revestidas com RetroNectin, e serve como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.Primeiro, prepare uma solução a 0,4% de cálcio-D-gluconato. Adicione água DI filtrada estéril ao gliconato de cálcio D em um copo. Mexa na velocidade média até que o gliconato de cálcio D tenha se dissolvido, o que leva aproximadamente 1 hora e meia.Uma vez dissolvido, filtro estéril a solução de cálcio-D-gluconato. Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma solução de 2% de alginato.Isso pode ser feito usando um frasco para injetáveis de tampa de rosca ou um béquer. Ambos serão mostrados aqui. Adicione cuidadosamente o alginato ultrapuro ao vaso.Adicione a quantidade apropriada de água DI ao alginato. Escolha a maior barra de agitação possível que não impeça a mistura e adicione-a ao recipiente. Mexa a solução no alto até que o alginato se dissolva, o que leva aproximadamente uma hora.Se houver grandes aglomerados de alginato no lado do vaso, incline o vaso para os lados para desalojá-los. Pequenos aglomerados se dissolverão ao longo da hora e não são motivo de preocupação. Uma vez que a solução de 2% alginato se dissolve, reduza a velocidade de agitação.Adicione lentamente um volume igual da solução de cálcio-D-gluconato à solução de alginato. Adicioná-lo lentamente ajudará a evitar a formação de aglomerados de reticulação. Quando a solução de gluconato de cálcio tiver sido adicionada, aumente a velocidade de agitação e mexa vigorosamente por 15 minutos.Incline o vaso para os lados para remover quaisquer aglomerados que possam ter se formado. Depois de mexer vigorosamente por 15 minutos, certifique-se de que não há aglomerados na solução. Pipetar a solução para uma placa de 48 ou 24 poços.Para uma placa de 48 poços, pipete 300 microlitros em cada poço. Certifique-se de lançar lentamente e mudar as pontas com frequência, pois a solução será viscosa e pode grudar na ponta. Para uma placa de 24 poços, pipete um mililitro em cada poço.Novamente, lance lentamente e mude as pontas da pipeta com frequência. Cubra as placas do poço com uma tampa e congele a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Prepare as placas para o liofilizador, removendo as tampas e prendendo o topo com lenços umedecidos e elásticos.Coloque as placas no tubo liofilizador e coloque o liofilizador por 72 horas. Após 72 horas, retire a placa do liofilizador. Os andaimes estão agora prontos para serem usados para transdução.Se não usar os andaimes imediatamente, sele a placa com parafilme e armazene a quatro graus Celsius até que seja necessário. Para armazenamento a longo prazo, recomenda-se selar a placa a vácuo, além de selar com Parafilme. Concentrar o sobrenadante viral centrifugando dois mililitros de solução viral através de um filtro centrífugo a 1, 500 g durante 10 minutos.São necessários 100 a 200 microlitros de vírus concentrado por andaime. Gire por alguns minutos adicionais se o volume concentrado de solução de vírus for superior a 200 microlitros. Para cada andaime, faça uma alíquota de 1 milhão de células T ativadas suspensas em 50 microlitros de meios completos de cultura celular.Adicione o vírus concentrado à suspensão celular. O volume total da suspensão do vírus celular não deve exceder 200 microlitros para um andaime de 48 poços, ou 350 microlitros para um andaime de 24 poços. Adicione a mistura de vírus celular gota a gota na parte superior do andaime seco.Para experimentos de controle negativo, use meios de cultura celular completos no lugar do vírus concentrado. Adicione esta suspensão celular à parte superior do andaime seco. Incubar os andaimes na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.Remova os andaimes da incubadora. Os andaimes devem absorver totalmente a solução durante este tempo. Para induzir a proliferação, adicione meios de cultura celular completos suplementados com IL-7 e IL-15 a cada poço.IL-2 também pode ser usado. Para um andaime de 24 poços, adicione um mililitro. Para um andaime de 48 poços, adicione 500 microlitros.Incubar a 37 graus Celsius por 72 horas. As células proliferarão ao longo das 72 horas, o que pode tornar a mídia laranja. Remova o excesso de mídia de cada poço.Para isolar as células do andaime, adicione uma solução de EDTA 0,25 molar a cada andaime. Adicione um mililitro para andaimes de 24 poços ou 300 microlitros para andaimes de 48 poços. Deixe o prato descansar ou agite suavemente por três a quatro minutos.Uma vez dissolvido na maior parte, a pipeta entra e sai suavemente dentro do poço. Algumas etapas de pipetagem de entrada e saída podem ser necessárias para dissolver completamente o andaime. Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Lave as células duas vezes com PBS. Adicione 12 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga. Centrifugar a 400 g durante cinco minutos.Uma pelota de célula se formará na parte inferior do tubo. Aspirar a solução sobrenadante e repetir a lavagem. Tenha cuidado para remover completamente o sobrenadante a cada lavagem, pois é crucial se livrar de todo o EDTA.Após a lavagem com PBS uma segunda vez, o pellet celular está pronto para análise. A citometria de fluxo foi utilizada para determinar a eficiência de transdução de cada grupo. Células não transduzidas foram utilizadas como controle negativo e não apresentaram transdução.Células semeadas em andaimes sem retrovírus GFP também não apresentaram transdução. O grupo Drydux, que ativou células semeadas nos andaimes de alginato macroporoso seco, apresentou 85% de transdução, pouco menor que o grupo Retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de Drydux efetivamente transduziram células por transferência de genes retrovirais sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de RetroNectin.Os andaimes Drydux exibem alta eficiência de transdução comparável ao RetroNectin, fornecendo um método alternativo para a transdução de células T. Devido ao baixo custo de fabricação dos andaimes Drydux, esse processo tem o potencial de reduzir significativamente o custo das terapias com células T CAR.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra o procedimento de fabricação de microtransportadores derivados de matriz extracelular por eletropulverização. Esses microtransportadores simulam o microambiente específico do tecido nativo e são estáveis em modelos de cultura de células in vitro 3D de longo prazo.

Fabricação de Bioscaffold por Eletropulverização: Uma Técnica para Gerar Scaffolds Microcarreadores Derivados de Matriz Extracelular de Tecido Descelularizado

O objetivo deste protocolo é fabricar células T de grau clínico específicas para patógenos usando um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração automatizado de bancada que incorpora um sistema fechado de captura de citocinas e não requer equipe dedicada ou uso de uma instalação GMP. As células T específicas do citomegalovírus pp65 geradas podem ser administradas diretamente aos pacientes.

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar vasos sanguíneos formação em vivo e em tempo real em 3D andaimes por microscopia do multiphoton. Angiogênese em andaimes geneticamente modificados foi estudado em modelo murino raspagem de osso crítico defeito. Mais novos vasos sanguíneos foram detectados no grupo de tratamento do que em controles.

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Este protocolo descreve uma plataforma para a fabricação de anéis de tecido Self montado em tamanhos variáveis, usando um molde de plástico personalizado 3D-impresso. PDMS negativos são curados em molde 3D-impresso; Então a agarose é convertido nos negativos PDMS curados. As células são semeadas em poços de agarose resultante onde eles agregam em anéis de tecido.

Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Aqui, apresentamos um protocolo para reproducibly e rapidamente gerar biologicamente inspirados, biodegradável articifical apresentadoras de células (aAPC) com tamanho ajustável, forma e apresentação de proteína de superfície de célula T expansão ex vivo ou in vivo .

Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

Apresentado aqui é um simples de usar, Core/Shell, tridimensional bioprinting set-up para uma etapa de fabricação de andaimes ocas, adequado para a engenharia de tecidos vasculares e outras estruturas tubulares.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

Hastes de microgel com grupos reativos complementares são produzidas via microfluídica com a capacidade de se interligar em solução aquosa. Os microgéis anisométricos encravam e se interligam em construções estáveis com poros maiores em comparação com sistemas baseados em esféricos. Microgéis modificados com GRGDS-PC formam construções 3D macroporosas que podem ser usadas para cultura celular.

Andaimes 3D macroporosos interligados de hastes de microgel

Aprenda a fabricar andaimes secos de alginato macroporoso (Drydux) para transdução viral eficiente em células T ativadas. Este método simplificado oferece uma alternativa mais econômica e conveniente às técnicas convencionais.

Fabricação e Uso de Andaimes Secos de Alginato Macroporoso para Transdução Viral de Células T

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