Name: Um novo modelo de ferida cutânea de ovino ex vivo de alto rendimento para testar antibióticos emergentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo ex vivo de pele ovina ferida infectada com Staphylococcus aureus para testar a eficácia de novos antimicrobianos em ambiente de ferida representativo.

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Os autores gostariam de agradecer ao EPSRC (EP/R513313/1) pelo financiamento. Os autores também gostariam de agradecer a R.B Elliot e Son Abattoir em Calow, Chesterfield, por fornecer cabeças de cordeiro e por serem tão complacentes nos estágios iniciais do projeto, Kasia Emery por seu apoio durante todo o desenvolvimento deste protocolo, e Fiona Wright do Departamento de Infecção, Imunidade e Doenças Cardiovasculares da Universidade de Sheffield por processar as amostras de histologia e ser tão incrivelmente útil ao longo deste projeto.

Cabeças de cordeiro do matadouro R.B Elliott e Son foram utilizadas como fonte de amostras de pele neste projeto. Todos os cordeiros foram abatidos para consumo como alimento. Em vez de descartar as cabeças, estas foram reaproveitadas para pesquisa. A aprovação ética não foi necessária, pois o tecido era proveniente de resíduos descartados de matadouros.
1. Esterilização
<ol><li>Desinfetar a pinça antes da recolha das cabeças, tomando pinças limpas e realizando esterilização a seco a quente num forno a 200 °C durante 1 h. Autoclave todos os artigos de vidro a 121 °C durante 15 minutos antes da utilização.</li>
	<li>Realizar todo o trabalho descrito dentro de um gabinete de classe 2 de microbiologia. Prepare todos os reagentes de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>2. Coleta de amostras
<ol><li>No matadouro, os cordeiros Swaledale eram abatidos por atordoamento usando eletricidade ou uma pistola de parafuso cativo e exsanguinados. Recolher cabeças de borrego não mais de 4 h após o abate.</li>
</ol>3. Preparação das cabeças
<ol><li>Desinfetar a secção da testa do borrego derramando aproximadamente 100 ml de solução de dióxido de cloro a 200 ppm na área da amostra. Raspe a seção da testa da cabeça usando cortadores elétricos e lave a área com 200 mL de solução de dióxido de cloro de 200 ppm.</li>
	<li>Limpe a área com etanol e rolo azul e cubra a área da amostra com creme de depilação por 35 min. Raspe suavemente o creme de depilação usando uma ferramenta de raspagem e avalie a área da amostra. Se uma quantidade significativa de pelos permanecer, repita o processo de depilação.</li>
	<li>Use mais 200 mL de solução de dióxido de cloro para enxaguar a área e, em seguida, enxaguar com etanol e limpar com um rolo azul.</li>
	<li>Usando um punch de biópsia estéril de 8 mm, corte amostras de pele de 8 mm da área preparada. Remova as amostras usando pinça estéril e um bisturi de 15 lâminas, garantindo que toda a gordura cutânea seja removida.</li>
	<li>Coloque as amostras em um frasco estéril de 0,5 L preenchido com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, transfira-as para tubos estéreis de 50 mL com 50 mL de solução de dióxido de cloro de 200 ppm, inverta duas vezes e deixe esterilizar por 30 min.</li>
	<li>Retire as amostras da solução de dióxido de cloro e lave-as colocando-as num tubo de 50 ml preenchido com 40 ml de PBS estéril. Uma vez lavado, coloque cada amostra de pele individual em um poço separado de uma placa de 24 poços.</li>
	<li>Adicionar 350 μL de meio pré-aquecido, mantendo a amostra na interface ar-líquido. A composição do meio é a seguinte: MK (Meio 199 com sais de Hanks, L-glutamato e 1,75 mg/mL de bicarbonato de sódio) e F12 de Ham, na proporção de 1:1, com adição de FBS (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicilina-estreptomicina (100 U/mL) e anfotericina B (2,5 μg/mL).</li>
	<li>Selar as placas de 24 poços com uma vedação de placa permeável a gás e incubar a 37 °C em uma incubadora de tecido de CO2 a 5% umidificada por até 24 h.</li>
</ol>4. Manutenção de amostras de pele
<ol><li>Após a incubação, retirar o meio de cultura e enxaguar as amostras em 500 μL de PBS estéril. Adicionar meios isentos de antibióticos a cada amostra e incubar a 37 °C numa incubadora de tecido de CO2 a 5% humidificada durante 24 h para remover os antibióticos residuais da amostra.</li>
	<li>Se turbidez ou infecção fúngica se desenvolverem no meio livre de antibióticos após 24 h, descarte a amostra.</li>
</ol>5. Preparação do inóculo
<ol><li>Prepare um tubo de 50 mL com 10 mL de caldo de soja tríptico estéril. Pegue um prato de ágar fresco de S. aureus e use um cotonete para transferir várias colônias para o caldo. Incubar durante 18 h a 37 °C a 150 rpm.</li>
	<li>Centrífuga a 4.000 x g por 3 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de PBS estéril. Repita duas vezes para garantir a lavagem adequada das células.</li>
	<li>Ajustar o inóculo para 0,6 OD600 em PBS estéril. Confirme a carga de inóculo realizando uma contagem manual de placas viáveis.</li>
</ol>6. Infecção de amostras de pele
<ol><li>Prepare uma placa fresca de 24 poços com 400 μL de meio pré-aquecido livre de antibióticos e adicione as inserções de 24 poços usando pinça estéril.</li>
	<li>Remova o meio das amostras de pele, lave com 500 μL de PBS estéril e remova a lavagem. Use pinças estéreis para segurar suavemente a amostra no fundo do poço.</li>
	<li>Use uma biópsia por punção de 4 mm para fazer um retalho central da ferida, perfurando até uma profundidade aproximada de 1-2 mm. Em seguida, use um bisturi de 15 lâminas e pinças de tecido allis dentadas estéreis para remover a camada superior do retalho da ferida. A variabilidade nas dimensões da ferida pode afetar o desfecho da infecção e as unidades formadoras de colônias (UFC) do desfecho.</li>
	<li>Uma vez que todas as amostras tenham sido feridas, transfira-as para as inserções de 24 poços usando pinça estéril. Pipetar 15 μL do inóculo bacteriano para o leito da ferida. Em seguida, incubar por 24 h a 37 °C em uma incubadora de tecido de CO2 a 5% umidificada.</li>
	<li>Se forem necessários períodos de incubação mais longos, remova o meio e substitua-o por um meio fresco a cada 24 horas e incube nas mesmas condições.</li>
</ol>7. Determinação da carga bacteriana
<ol><li>Remova a mídia do fundo dos poços. Com pinça estéril, transfira cada amostra para um tubo separado de 50 mL preenchido com 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Use um homogeneizador de ponta fina para homogeneizar a superfície da amostra. Tome cuidado para garantir que o leito da ferida esteja em contato direto com a ponta do homogeneizador.</li>
	<li>Homogeneizar cada amostra por 35 s em médio/alto. O homogeneizador desprende as bactérias da superfície do leito da ferida para permitir a enumeração da carga bacteriana.</li>
	<li>Uma vez que todas as amostras são processadas, vórtice cada amostra, por sua vez, antes da pipetagem. Isso é para garantir que o homogeneizado bacteriano seja misturado.</li>
	<li>Pipetar 20 μL de homogeneizado vórtice para o poço correspondente de uma placa de 96 poços contendo 180 μL de PBS estéril.</li>
	<li>Diluir serialmente cada homogeneizado da amostra para 1 x 10−7 e pipetar 10 μL do homogeneizado diluído para uma placa tríptica de ágar soja em triplicat.</li>
	<li>Incubar a placa de ágar durante 18 h a 37 °C. Em seguida, conte o número de colônias para determinar a UFC para cada amostra.</li>
</ol>

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<li>Olkowska, E., Gržinić, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909(2022).</li>
<li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

O desenvolvimento de antimicrobianos é um empreendimento importante, mas caro, que é estimado em cerca de US $ 1 bilhão e leva cerca de 15 anos para ser concluído. Mais de 90% da descoberta de medicamentos antimicrobianos e estudos pré-clínicos de eficácia de medicamentos antimicrobianos são realizados por pesquisadores acadêmicos e pequenas e médias empresas com tipicamente menos de 50 funcionários22. Essas equipes são muito limitadas financeiramente, o que torna calamitosa a falha das moléculas ...

As infecções de pele são uma questão global importante, com grandes custos econômicos para os profissionais de saúde em todo o mundo. O desenvolvimento de multirresistência e formação de biofilme por patógenos desempenha um papel fundamental na prevalência de feridas não cicatrizantes 1,2,3,4. Como resultado disso, as infecções de pele e tecidos moles são um dos motivos mais comuns para a hospitalização prolongada e posterior readmissão5. Atrasos na cicatrização de feridas são caros tanto para o paciente quanto para os profissionais de saúde, com algumas estimativas sugerindo que cerca de 6,5 milhões de pacientes são afetados anualmente nos EUA. No Reino Unido, infecções de pele e complicações associadas resultam em aproximadamente 75.000 mortes anuais 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) é um formidável patógeno de feridas frequentemente isolado de feridas de pacientes 2,7. A taxa de emergência de multirresistência aumentou drasticamente na década de 2000. Durante esse período, cerca de 60% das infecções bacterianas agudas da pele e da estrutura da pele foram positivas para S. aureusresistente à meticilina 1. O crescente número de cepas multirresistentes entre os estafilococos, e de fato outros patógenos, nas últimas 2 décadas indica uma necessidade urgente de rápido desenvolvimento de antibióticos com novos modos de ação que possam superar a resistência.
No entanto, desde o início dos anos 2000, os programas de descoberta de antibióticos têm sido dominados por tempos de desenvolvimento mais longos e baixas taxas de sucesso, com apenas 17% dos novos antibióticos que entram em ensaios clínicos nos EUA alcançando aprovação no mercado8. Isso sugere uma disparidade entre os resultados dos testes in vitro de antibióticos emergentes e seus resultados clínicos. Pode-se argumentar que essa disparidade se deve em grande parte a diferenças na fisiologia bacteriana durante infecções in vivo e durante métodos microbiológicos convencionais ao testar a eficácia de antibióticos nos estágios pré-clínicos in vitro . Portanto, novos métodos laboratoriais que são mais representativos da fisiologia bacteriana durante a infecção são necessários para melhorar as taxas de sucesso em programas de descoberta de antibióticos.
Os métodos atuais para o estudo de infecções de pele incluem estudos em animais vivos (por exemplo, camundongos), modelos de pele ex vivo (por exemplo, suínos) e modelos de pele 3D projetados por tecidos (por exemplo, humanos)9,10,11,12. Estudos em animais vivos são estritamente regulamentados e têm rendimento relativamente baixo. Em modelos animais, ferimentos e infecções causam sofrimento significativo aos animais e levantam preocupações éticas. Os modelos de pele humana, ex vivo ou de engenharia de tecidos, requerem aprovação ética, conformidade com a legislação local e global (Lei de Tecidos Humanos, Declaração de Helsinque) e há dificuldade em adquirir tecidos, com algumas solicitações levando anos para serem atendidas13,14. Ambos os tipos de modelos são trabalhosos e exigem conhecimentos significativos para garantir o sucesso experimental. Alguns modelos atuais de infecção cutânea ex vivo requerem discos pré-inoculados e aditivos para o leito da ferida para permitir a infecção; embora esses modelos sejam incrivelmente úteis, há limitações no processo de infecção, pois os aditivos limitam a utilização do leito da ferida como fonte de nutrientes10,15,16,17. O modelo descrito neste estudo não utiliza aditivos para o leito da ferida, o que garante que a patologia da infecção e a contagem de células viáveis sejam resultado da utilização direta do leito da ferida como única fonte de nutrientes.
Dada a necessidade de novos métodos laboratoriais, foi desenvolvido um novo modelo ovino ex vivo de alto rendimento de infecções de pele para uso na avaliação da eficácia de antibióticos emergentes. Os estudos de infecção cutânea enfrentam muitos desafios - altos custos, preocupações éticas e modelos que não mostram um quadro completo20,21. Modelos ex vivo e modelos explante 3D permitem uma melhor visualização do processo da doença e do impacto que os tratamentos podem ter a partir de um modelo clinicamente mais relevante. Aqui, a configuração de um novo modelo de pele ovina é descrita, que é simples, reprodutível e clinicamente relevante e tem alto rendimento. A pele ovina foi escolhida porque as ovelhas são um dos grandes mamíferos comumente usados para modelar respostas a infecções in vivo. Além disso, eles estão prontamente disponíveis nos matadouros, garantindo um suprimento constante de pele para pesquisa, e suas carcaças não são escaldadas, garantindo uma boa qualidade do tecido. Este estudo utilizou S. aureus como patógeno exemplar; no entanto, o modelo funciona bem com outros microrganismos.

<table><tbody><tr><td>Placa Companheira de 24 Poços</td><td>SLS&nbsp;</td><td></td><td></td>353504</tr><tr><td>Punção de Biópsia de 4 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7484</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>Punção de Biópsia de 8 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7488</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Anfotericina B, estéril</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de Cortar Cabelo Sem Fio Estilo Colour Pro</td><td>Wahl</td><td>9639-2117X</td> Máquina <td>de Cortar</td></tr><tr><td>Cabelo Incubadora de Forno Duplo</td><td>SLS</td><td>OVe1020</td><td>Forno Esterilizante</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico&nbsp;</td><td>SLS</td><td>E5036-200UG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Honeywell</td><td>458600-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N4888</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino&nbsp;</td><td>Pinça Labtech International</td><td>CA-115/500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15307805</td><td></td></tr><tr><td>Creme de Depilação</td><td>Veet</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>15373212&nbsp;</td><td>Incubadora para cultura de tecidos</td></tr>Homogeneizador de <tr><td>Centrífuga</td> <td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>VWR</td><td>521-2242</td></tr><tr><td>220, Homogeneizador</td><td>de 15575809</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>220, cones de mistura de plástico</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15585819</tr><tr><td>Inserir Membrana individual de 24 poços 0,4um</td><td>VWR International</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, recombinante Humano</td><td>SLS</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (MK media)</td><td>Sigma</td><td>M0393</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, cultura de células Costar 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>10687551</td><td></td></tr><tr><td>Multitron</td><td>Infors</td><td>Não aplicável</td><td>Incubadora bacteriana</td></tr><tr><td>Tablets PBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>SLS&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Selos de placa</td><td>Fisher Scientific</td><td>ESI-B-100</td><td></td></tr><tr><td>Safe 2020</td><td>Fisher Scientific</td><td>1284804</td><td>Classe II cabine de segurança de microbiologia</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi número 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>O305</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Swann Morton</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Tecido Allis Dentada</td><td>Rocialle</td><td>RSPU500-322</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Soja Tríptica</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>14432-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Soja Tríptico</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>41298-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Vimoba Tablets</td><td>Quip Labs</td><td>VMTAB75BX</td><td></td></tr></tbody></table>

um novo modelo de ferida cutânea de ovino ex vivo de alto rendimento para testar antibióticos emergentes

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

O desenvolvimento de antimicrobianos é um processo caro com taxas de sucesso cada vez mais baixas, o que torna menos atraente o investimento adicional em pesquisa de descoberta de antimicrobianos. A descoberta de medicamentos antimicrobianos e a subsequente comercialização podem se tornar mais lucrativas se uma abordagem de falhar rápido e falhar barato puder ser implementada dentro dos estágios de otimização de leads, onde os pesquisadores têm maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos. Neste artigo, descreve-se a configuração de um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectado com Staphylococcus aureus, que é simples, econômico, de alto rendimento e reprodutível. A fisiologia bacteriana no modelo imita que durante a infecção como proliferação bacteriana é dependente da capacidade do patógeno de danificar o tecido. O estabelecimento da infecção da ferida é verificado por um aumento na contagem bacteriana viável em comparação com o inóculo. Este modelo pode ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes no estágio de otimização de chumbo. Pode-se argumentar que a disponibilidade desse modelo fornecerá aos pesquisadores que desenvolvem antimicrobianos um modelo de falha rápida e falha barata, o que ajudará a aumentar as taxas de sucesso em testes subsequentes com animais. O modelo também facilitará a redução e o refinamento do uso de animais para pesquisa e, em última análise, permitirá uma tradução mais rápida e econômica de novos antimicrobianos para infecções de pele e tecidos moles para a clínica.

A identificação de uma via para esterilizar a pele antes da configuração do modelo de infecção da ferida foi um desafio. O desafio estava em esterilizar a pele sem danificar as diferentes camadas da pele, que podem então ter consequências não intencionais no resultado da infecção. Para identificar um regime de esterilização adequado, diferentes tratamentos foram tentados por diferentes períodos de tempo, conforme descrito na Tabela 1. A contaminação foi registrada como o desenvolvimento de turbidez após ...

O protocolo descreve um método passo-a-passo para configurar um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectada com Staphylococcus aureus. Este modelo de alto rendimento simula melhor infecções in vivo em comparação com técnicas convencionais de microbiologia e apresenta aos pesquisadores uma plataforma fisiologicamente relevante para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes.

Um novo modelo de ferida cutânea de ovino ex vivo de alto rendimento para testar antibióticos emergentes

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Esse modelo permitirá que os pesquisadores nos estágios pré-clínicos críticos determinem com mais precisão a eficácia antimicrobiana de novas formulações e dê aos pesquisadores maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos. Este modelo permite resultados reprodutíveis rápidos em um ambiente de ferida representativo. Reduz a necessidade de animais criados especificamente e facilita a tradução mais rápida de antimicrobianos tópicos para infecções de feridas para a clínica.Os principais desafios são a contaminação e a destreza. Uma técnica asséptica rigorosa e paciência com o processamento de tecidos são essenciais; a remoção precisa e proposital do retalho é necessária para o sucesso deste método. Comece com a desinfecção do fórceps, expondo-os à esterilização por calor seco a 200 graus Celsius por uma hora.Autoclave todos os artigos de vidro a 121 graus Celsius por 15 minutos antes do uso. Desinfete a secção da testa da lâmpada derramando aproximadamente 100 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM na área da amostra. Raspe a seção da testa usando cortadores elétricos, seguido de uma lavagem com 200 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM.Limpe a área usando etanol e um rolo azul e cubra a área da amostra com creme de depilação. Após 35 minutos, raspe suavemente o creme de depilação usando uma ferramenta de raspagem e avalie a área da amostra. Repita o processo de depilação se uma quantidade significativa de pelos permanecer.Enxaguar a área de amostra limpa com 200 mililitros de solução de dióxido de cloro seguida de etanol e um rolo azul. Use um soco de biópsia estéril de oito milímetros para cortar uma amostra de pele de oito milímetros da área preparada. Em seguida, remova a amostra usando pinça estéril e bisturi de lâmina número 15, garantindo que toda a gordura cutânea seja removida.Coloque as amostras em um frasco estéril de 0,5 litro cheio de PBS estéril. Em seguida, transfira-os para tubos estéreis de 50 mililitros cheios de 50 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM. Inverta o tubo duas vezes e deixe-o esterilizar por 30 minutos.Transfira as amostras para um tubo de 50 mililitros preenchido com 40 mililitros de PBS estéril. Após a lavagem do PBS, coloque cada amostra de pele em um poço separado de uma placa de 24 poços. Adicione 350 microlitros do meio pré-aquecido em um poço, mantendo a amostra na interface ar-líquido.Sele as placas de 24 poços com uma vedação de placa permeável a gás antes de colocar a placa para incubação em uma incubadora de tecido umidificado a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, retirar o meio de cultura e enxaguar as amostras em 500 microlitros de PBS estéril. Remova os antibióticos residuais da amostra, tratando-os com meios livres de antibióticos a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas.Se a turbidez ou infecção fúngica se desenvolver no meio livre de antibióticos, descarte a amostra. Em seguida, prepare um tubo de 50 mililitros com 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril. Em seguida, transfira várias colônias de Staphylococcus aureus de uma placa de ágar fresco de S.aureus para o caldo e incube o tubo a 37 graus Celsius e 150 RPM por 18 horas.Depois de centrifugar os tubos a 4.000 G por três minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de PBS estéril. Repita a lavagem PBS duas vezes antes de ajustar o inóculo para a densidade óptica de 0,6 a comprimentos de onda de 600 nanômetros usando PBS estéril. Confirme a carga de inóculo por uma contagem manual de placas viáveis.Para infectar a amostra de pele, prepare uma placa fresca de 24 poços com 400 microlitros de meio livre de antibióticos pré-aquecidos e adicione as inserções de 24 poços usando pinça estéril. Remova a mídia das amostras de pele. Lave-os com 500 microlitros de PBS estéril e remova a lavagem.Use pinças estéreis para segurar suavemente a amostra no fundo do poço. Use uma biópsia de punção de quatro milímetros para perfurar a amostra de pele a uma profundidade aproximada de um a dois milímetros e fazer um retalho central da ferida. Em seguida, use um bisturi de lâmina número 15 e pinças de tecido Allis de dentes estéreis para remover a camada superior do retalho da ferida.Uma vez que todas as amostras tenham sido feridas, transfira-as para as 24 inserções de poço usando pinça estéril. Pipetar 15 microlitros do inóculo bacteriano para o leito da ferida antes de incubar por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de tecido umidificada. Para períodos de incubação mais longos, remova o meio, substitua-o por um meio fresco a cada 24 horas e incube as placas nas mesmas condições.Para determinar a carga bacteriana, remova o meio do fundo dos poços. E usando pinça estéril, transfira cada amostra para um tubo separado de 50 mililitros preenchido com um mililitro de PBS estéril. Em seguida, retire as bactérias da superfície do leito da ferida homogeneizando a superfície da amostra com um homogeneizador de ponta fina.Certifique-se de que o leito da ferida esteja em contato direto com a ponta do homogeneizador. Uma vez que todas as amostras são processadas, vórtice cada amostra antes de transferir 20 microlitros de homogeneizado para o poço correspondente de uma placa de 96 poços contendo 180 microlitros de PBS estéril. Diluir serialmente cada homogeneizado da amostra para 1 vezes 10 para o negativo 7, e pipetar 10 microlitros do homogeneizado diluído para uma placa de ágar de soja tríptica em triplicado.Incubar a placa de ágar de soja tríptica a 37 graus Celsius e, após 18 horas, contar o número de colônias para determinar as unidades formadoras de colônias ou UFC para cada amostra. Um regime apropriado de esterilização da pele foi identificado usando diferentes tratamentos por diferentes períodos de tempo. A integridade tecidual foi monitorada por histologia, seguida de coloração com hematoxilina e eosina imediatamente após o tratamento.Um tratamento de 30 minutos com dióxido de cloro foi o tratamento mais eficaz, com esterilização reprodutível do tecido cutâneo, preservando a integridade tecidual. Um filme branco no leito da ferida foi evidente no tecido 48 horas após a infecção. Embora o modelo de arranhões tenha abrigado um maior número médio de UFCs após 24 horas, a técnica de retirada do retalho produziu resultados mais consistentes.Após 48 horas, aproximadamente 100 vezes mais UFCs bacterianas foram recuperadas do tecido ferido em comparação com o inóculo, indicando uma infecção bem-sucedida. Seções histológicas coradas de Gram do tecido infectado indicaram a presença de células de S.aureus no leito da ferida, que estava ausente nas seções de tecido não infectado. Após este procedimento, pode-se realizar imuno-histoquímica para estudar a resposta tecidual, coloração de grama modificada para visualizar a localização bacteriana e contagens de placas viáveis após a exposição antimicrobiana para testar a eficácia antimicrobiana.Para os pesquisadores que desenvolvem novos antimicrobianos, esse modelo proporcionará maior controle da otimização do chumbo, reduzirá a dependência de testes em animais caros e rigidamente regulamentados e permitirá a rápida tradução de antimicrobianos para a clínica.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: de Vries, C. R., et.al. Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica da ferida por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a inoculação tardia de Pseudomonas aeruginosa luminescente em um camundongo com duas feridas dorsais de espessura total cobertas por um curativo transparente. Isso facilita a formação de biofilmes e o estabelecimento de infecções crônicas. O monitoramento regular da bioluminescência permite quantificar a carga bacteriana e acompanhar...

Desenvolvimento de um modelo de camundongo para infecção crônica de feridas cutâneas por Pseudomonas aeruginosa 

Este vídeo descreve um protocolo para configurar um modelo ex vivo para ceratite bacteriana usando um botão corneoescleral dissecado do olho suíno. As bactérias inoculadas atravessam as incisões epiteliais da córnea para invadir o estroma subjacente e estabelecer uma infecção nos tecidos da córnea que imita a infecção in vivo.

Modelo de Córnea Ex vivo de Ceratite Bacteriana em Suínos: Uma Técnica para Estabelecer Infecção Bacteriana em Células Epiteliais da Córnea

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar um modelo murino de infecção de ferida cutânea. Ao infectar camundongos - modificados para expressar uma proteína fluorescente em neutrófilos - com um Staphylococcus aureus bioluminescente geneticamente modificado - uma bactéria patogênica. A carga bacteriana no local da infecção e a dinâmica de recrutamento de neutrófilos podem ser estudadas usando imagens de animais inteiros.

Um modelo de infecção de feridas na pele murina para estudar a resposta imune contra um patógeno bacteriano

O vídeo demonstra a geração de um modelo de pele ovina ex vivo infectado com Staphylococcus aureus. Isso envolve tratar a seção de biópsia da pele da testa de um cordeiro com antibióticos, estabelecer um leito da ferida, posicioná-lo em uma membrana permeável em uma placa multipoços com meio livre de antibióticos e estabelecer infecção bacteriana na ferida cutânea.

Gerando um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectada com um patógeno bacteriano

Aqui descrevemos um modelo murino diabético romance utilizando camundongos sem pelos para monitoramento em tempo real, não-invasivo, de infecções de ferida biofilme bioluminescentes Pseudomonas aeruginosa. Esse método pode ser adaptado para avaliar a infecção de outras espécies bacterianas e microrganismos geneticamente modificados, incluindo várias espécies biofilmes e testar a eficácia das estratégias de antibiofilm.

Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

Aqui, dois modelos de cicatrização de feridas murinasão são descritos, um projetado para avaliar as respostas de cicatrização celular e citocina e o outro para quantificar a taxa de fechamento da ferida. Esses métodos podem ser usados com modelos de doenças complexas, como o diabetes, para determinar mecanismos de vários aspectos da má cicatrização de feridas.

Avaliação da Cicatrização aguda de Feridas utilizando o Implante de Esponja de Álcool Subcutâneo Subcutâneo Dorsal e Modelos de Ferida de Cauda Excisional.

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