Name: Isolamento das células de linhagem monócito-macrófago dos ossos de ratos por método de adesão secundário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: Aprenda o método de adesão secundária para isolar células de linhagem monócito-macrófago de medula óssea de ratos. Esta técnica permite diferenciar osteoclastos in vitro para estudos de biologia óssea e osteoporose.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da Província de Zhejiang (não conceder. LY19H060001) e o Projeto de Plano de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa de Zhejiang (nº 2022ZB093).

Todos os experimentos deste estudo foram realizados de acordo com as diretrizes de experimento animal do Centro de Pesquisa Animal do Laboratório da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Aprovação Nº: IACUC-20181029-11).
1. Extração celular
<ol><li>Coloque os ratos Sprague-Dawley (ratos SD, 1-10 dias de idade, masculino ou feminino) nas gaiolas de eutanásia preenchidas com CO2 a uma taxa equilibrada de 30%-70% de volume de contêiner/minuto. Depois que os ratos perdem a consciência (20-60 min), eutanize o rato por luxação cervical para garantir uma morte indolor.</li>
	<li>Mergulhe os ratos em 75% de álcool por 10 minutos para desinfecção.</li>
	<li>Remova cuidadosamente todos os membros do rato com tesouras e fórceps, aspire com PBS usando uma pipeta e lave o sangue aderindo aos membros.</li>
	<li>Adicione 5 mL de solução de penicilina/estreptomicina em 500 mL de DMEM e misture bem. Pegue um tubo de centrífuga estéril de 50 mL, adicione 5 mL de FBS e 45 mL de meio DMEM e misture bem para obter um DMEM de 10% FBS contendo 1% de solução de penicilina/estreptomicina. Adicione 2 mL do meio de cultura acima em um tubo de 5 mL.</li>
	<li>Transfira os ossos do membro para o tubo de 5 mL. Use uma tesoura para cortar os ossos do membro no tubo em pequenos pedaços (1-3 mm) e misture o homogeneado para suspender novamente as células de medula óssea no meio da cultura. Fique por 5 minutos até que os fragmentos de tecido se instalem na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 10 mL de 10% FBS DMEM em um prato de cultura de 100 mm, e depois transfira o supernasce para o prato de cultura. Ao aspirar o supernante, evite transferir os detritos teciduais para o prato de cultura.</li>
	<li>Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por aproximadamente 24 h. Após esse período de incubação, a maioria das células-tronco mesenquimais aderirá à parede de pratos da cultura e crescerá lentamente, enquanto a maioria dos BMMs ainda será suspensa no meio da cultura.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular no prato de cultura de 100 mm para um novo frascode 25 cm 2 e continue a cultivar as células a 37 °C e 5% de CO2 por mais 24 h. Os BMMs aderirão à parede de frascos a 24-48 h de cultura. Remova o meio antigo cuidadosamente e substitua-o por meio fresco após os BMMs terem aderido à parede do frasco.</li>
	<li>Subcultura quando as células do frasco atingiram 80%-90% de confluência. NOTA: Todas as células foram cultivadas a 37 °C e 5% de CO2. Durante a cultura, a morfologia celular foi gradualmente unificada. As células eram grandes, de forma irregular, de crescimento radial e presas ao frasco em uma forma de disco, onde múltiplos núcleos podiam ser observados.</li>
</ol>2. Mancha FACS da célula
<ol><li>Digestão de trippsina usando 1-2 mL de trippsina comercial a 37 °C e 5% DE CO2 por 5 min e conte células aderentes secundárias para garantir uma contagem final de células de 100.000/amostra (células de contagem com hemocitômetro Neubauer).</li>
	<li>Divida as células em três grupos (500 μL de PBS contém 100.000 células): (1) o grupo de controle em branco contendo células não manchadas; (2) o grupo controle do isótipo; e (3) o grupo experimental (coloração CD11b/c).</li>
	<li>Incubar anticorpos primários (sem anticorpos para o grupo controle em branco; controle isótipo anti-CD11 para o grupo controle do isótipo, 0,6 μL de anticorpo/amostra, 1 μg/amostra; anti-CD11b/c para o grupo experimental, 1 μL de anticorpo/amostra, 1 μg/amostra) no gelo por 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugar a 300-350 x g por 5 min, descartar o supernaspeuta e resuspensar as células com 500 μL de PBS. Repita o procedimento acima uma vez para garantir que os anticorpos primários desvinculados sejam lavados.</li>
	<li>Incubar o anticorpo secundário correspondente (sem anticorpo para o grupo de controle em branco; IgG anti-coelho de cabra para o controle do isótipo e os grupos experimentais, 0,25 μL anticorpo/amostra, 1:2.000) no gelo no escuro por 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugar a 300-350 x g por 5 min, descartar o supernaspeuta e resuspensar as células com 500 μL de PBS. Repita o procedimento acima uma vez para garantir que os anticorpos desvinculados sejam lavados.</li>
	<li>Detecte as células positivas do CD11b/c por citometria de fluxo (10.000 células/amostra) e analise os dados por software (por exemplo, FlowJo 7.5). NOTA: Para obter o percentual final das células CD11b/c+, utilizou-se a seguinte fórmula: Percentual de células CD11b/ c + no grupo experimental - a porcentagem de células CD11 + no grupo de controle de isótipo.</li>
</ol>3. Manchas wright-giemsa
<ol><li>Sementes as células secundárias aderentes que foram passagemdas três vezes para folhas de escalada decélulas de 35 mm 2 (1 × 106 células/bem) e cultura a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Descarte o meio de cultura e lave três vezes com PBS.</li>
	<li>Adicione a solução de corante Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) à folha de escalada celular por 1 min.</li>
	<li>Misture o corante com água destilada (0,5 mL-0,8 mL) com um cotonete e suporte por 10 minutos.</li>
	<li>Lave a solução de corante com água destilada e depois seque por 1-3 min. Observe sob um microscópio.</li>
</ol>4. Coloração de armadilha
<ol><li>Sementes as células secundárias aderentes que foram passagemdas três vezes para folhas de escalada decélulas de 35 mm 2 (1 × 106 células/bem) e cultura a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.</li>
	<li>Substitua o médio antigo pelo meio de indução de 10% FBS DMEM ou osteoclante complementado por 50 ng/mL receptor de ligante de fator nuclear-κB (RANKL) e 30 ng/mL de fator estimulante de colônia macifágica (M-CSF), e cultura a 37 °C e 5% CO2 por mais 7 dias.</li>
	<li>Manche as células com o kit de coloração TRAP de acordo com o protocolo do fabricante e observe sob um microscópio. NOTA: As células TRAP-positivas foram definidas como osteoclastas, que eram roxas sob um microscópio leve. O número de células TRAP-positive foi medido usando o software ImageJ.</li>
</ol>5. Mancha ocidental
<ol><li>Sementes as células secundárias aderentes que foram passagem três vezes em folhas de escalada decélulas de 35 mm 2 (1 × 106 células/bem) e cultura por 24 h.</li>
	<li>Substitua o médio antigo por um MMEM de 10% fresco ou meio de indução de osteoclato (50 ng/mL de RANKL e 30 ng/mL de M-CSF) e cultura por mais 7 dias a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Extrair proteínas celulares totais com tampão RIPA, separar por 10% de SDS-PAGE e transferir para membranas de flúor de polivinida 18,19.</li>
	<li>Bloqueie com 5% de pó de leite desnatado (25 mL) por 2h e lave três vezes, por 10 minutos cada vez, com TBS-Tween 20 (TBST).</li>
	<li>Incubar anticorpos primários a 4 °C durante a noite (anticorpo/banda diluído anti-β, anti-TRAP e anti-catepsina K; todos os anticorpos primários foram diluídos 1:1.000, 10 mL de anticorpo/banda diluído), e lavaram três vezes com TBST.</li>
	<li>Incubar o anticorpo secundário (anti-coelho de cabra IgG, diluição de 1:2.000, anticorpo/banda diluído de 10 mL) à temperatura ambiente por 2 h, e lavar três vezes com TBST. Visualize as bandas de proteínas usando uma solução em desenvolvimento. NOTA: Os níveis de expressão das proteínas acima foram normalizados para β-actina.</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Os osteoclatos são um dos tipos celulares mais significativos envolvidos na ocorrência e desenvolvimento de doenças ósseas, bem como um dos principais objetos da pesquisa dedoenças ósseas 20. Monócitos/macrófagos podem se diferenciar em osteoclatos. Como os macrófagos mononucleares (células RAW264.7) são muito caros para comprar e são facilmente ativados durante a cultura, é difícil realizar experimentos de diferenciação in vitro usando esta linha celular. Embora vários métodos tenham sid...

Foi relatado que as células de linhagem monocito-macrófago existentes na medula óssea podem se diferenciar em monócitos sanguíneos e macrófagosteciduais 1,2. As células acima, que podem se diferenciar em osteoclastas para equilibrar o crescimento e o desenvolvimento ósseo, são comumente utilizadas como modelo celular para induzir osteos in vivo 3,4. A medula óssea é um tecido especial que contém vários tipos diferentes de células, que incluem, mas não se limitam apenas a células-tronco mesenquimais de medula óssea, células monócito-macrófagos de medula óssea (MMMs), células-tronco hematopoiéticas, células endoteliais e células imunes. De fato, vários estudos anteriores sugeriram que as células aderentes que saíram correndo da cavidade da medula óssea do osso longo poderiam se diferenciar em osteoblastos, osteoclatos, condrócitos ou adipócitos 5,6,7,8. Embora diferentes métodos de isolamento e cultura tenham sido usados para produzir diferentes populações celulares homogêneas, ainda há grandes desafios em isolar e cultivar BMMs de uma variedade de tipos de células diferentes.
Vários métodos foram desenvolvidos para extrair macrófagos mononucleares de medula óssea (BMSCs). No entanto, a maioria desses métodos são complexos 9,10,11. Por exemplo, a centrifugação de gradiente de densidade requer um kit especializado e a operação é demorada e complicada. Este método é adequado para o isolamento de BMMs de amostras de sangue de alto volume, mas não a partir de amostras de medula óssea 9,12,13. Além disso, extrair amostras de tecido usando digestão de colagem é um procedimento complexo e demorado; este método não é recomendado para o isolamento de BMMs a partir de amostras de medula óssea14,15. Além disso, embora a separação do fluxo possa resultar em populações de monócitos/macrófagos altamente purificados, requer tamanhos amostrais muito grandes e requisitos elevados de instrumentos e equipamentos10,16. Além disso, o método de enriquecimento de microesferas é extremamente caro e não é viável em um laboratório geral17.
Portanto, no presente estudo foi proposto um método conveniente, rápido e barato para o isolamento de macrófagos mononucleares da medula óssea. As células de medula óssea aderidas para diferentes pontos de tempo foram utilizadas para isolar os BMMs utilizando um método secundário de adesão. Os BMMs extraídos com o método acima poderiam induzir a formação de osteoclatos in vitro, fornecendo assim um modelo celular simples e conveniente para o estudo futuro da osteoporose in vitro.

<table><tbody><tr><td>Fatias trepadeiras de células 35 mm2</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-catepsina K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Controle de isotipo anti-CD11</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 &mu; g/teste,1.675 mg/Ml</td></tr><tr><td>Anti-CD11b/c</td><td>Absin</td><td>abs124232</td><td>&nbsp; 1&mu; g/teste, 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-TRAP</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actina</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp; AF5003</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Fatias de escalada de células</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td>de cultura de células corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células</td><td>corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td>para IF, 1:2.000</td></tr><tr><td>cabra anti-coelho IgG</td><td>Abcam ab6721</td><td>para WB, 1:2.000</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro tech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro tech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD rato</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd</td><td></td><td>1-10 dias de idade</td></tr><tr><td>Kit de preparação de gel SDS-PAGE</td> Kit de coloração <td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>TRAP/ALP</td><td>Wako</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>Solução Wright-Giemsa</td><td>Keygen Biotech</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento das células de linhagem monócito-macrófago dos ossos de ratos por método de adesão secundário

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

Com uma diminuição da densidade mineral óssea, os ossos são mais propensos a fraturar, afetando negativamente a qualidade de vida do paciente. O crescimento e o desenvolvimento dos ossos são regulados principalmente por osteoblastos e osteoclartos. Tem sido amplamente aceito que os osteoclatos são derivados de células monócito-macrófagos de medula óssea (MMC). BMMs e outras células-tronco hematopoiéticas estão localizados na cavidade da medula óssea. Portanto, isolar BMs estáveis de diferentes populações de células heterogêneas é um grande desafio. Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária. Foram coletadas células aderentes cultivadas por 24-48 h na cultura primária. A análise citométrica de fluxo mostrou que aproximadamente 37,94% das células eram CD11b/c+ (antígeno da superfície monocito-macrófago). A coloração de fosfattase de ácido resistente ao tartarato (TRAP) e a análise da mancha ocidental demonstraram que os BMMs poderiam se diferenciar em osteoclartos in vitro. Os achados acima sugeriram que as células de adesão secundárias poderiam ser consideradas como um modelo celular adequado para a pesquisa de diferenciação de osteoclatos.

A população de células aderentes secundárias era estável e uniforme. Com a proliferação contínua das células, a maioria das células tornou-se maior, com forma irregular e cresceu em um disco aderente radial (Figura 2C,D). A citometria de fluxo mostrou que a porcentagem de células expressando CD11b/c, um marcador molecular na superfície das células de linhagem monocito-macrófago, foi de aproximadamente 37,94% (Figura 2A,B<...

Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária.

Isolamento das células de linhagem monócito-macrófago dos ossos de ratos por método de adesão secundário

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

Neste protocolo, as células monócito-macrófago da medula óssea são extraídas pelo método de adesão secundária. As células monófato-macrófagos da medula óssea podem se diferenciar com sucesso em osteoclastas, o que fornece um modelo celular estável para o estudo de osteoclatos in vitro. Este método é adequado para pequenas amostras de medula óssea e pode extrair células monócito-macrófagos de medula óssea de medula óssea de forma simples e rápida sem exigir equipamentos de laboratório de alta tecnologia.O aumento dos osteoclatos pode ser a potencial patogênese da osteoporose. As células monófato-macrófagos da medula óssea têm certo valor de pesquisa como células precursoras do osteoclast. Para começar, mergulhe os ratos eutanizados em 75% de álcool por 10 minutos para desinfecção.Depois de remover cuidadosamente todos os membros do rato com tesouras e fórceps, aspire com PBS usando uma pipeta e lave o sangue aderindo aos membros. Em seguida, em dois mililitros do DMEM 10%FBS em um tubo de cinco mililitros. Depois de transferir os ossos do membro para o tubo de cinco mililitros, use uma tesoura para cortar os ossos do membro no tubo em pequenos pedaços e misturar o homogenate para resuspensar as células de medula óssea no meio da cultura.Fique por cinco minutos até que os fragmentos de tecido se instalem na parte inferior do tubo. Em seguida, adicione 10 mililitros de 10%FBS DMEM em um prato de cultura de 100 milímetros, e, em seguida, transfira o supernascedor para o prato de cultura. Incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por aproximadamente 24 horas.Após esse período de incubação, a maioria das células-tronco mesenquimais aderirão à parede de pratos da cultura e crescerão lentamente, enquanto a maioria das células monocito-macrófago da medula óssea ainda será suspensa no meio da cultura. Transfira a suspensão celular no prato de cultura de 100 milímetros para um novo frasco quadrado de 25 centímetros e continue a cultivar as células a 37 graus Celsius em dióxido de carbono de 5% por mais 24 horas. Depois de remover o meio antigo cuidadosamente, substitua-se por meio fresco após as células monócito-macrófago da medula óssea terem aderido à parede do frasco.A citometria de fluxo mostrou que a porcentagem de células expressando CD11b e c, um marcador molecular na superfície das células de linhagem monocito-macrófago foi de aproximadamente 37,94%Com a contínua proliferação celular, a maioria das células se tornou maior dentro da forma irregular e cresceu em um disco aderente radial. Os resultados da mancha TRAP mostraram que, em comparação com o grupo controle, o número de grânulos vermelhos roxos intracelulares foi significativamente aumentado em células induzidas com ativador receptor de fator nuclear kappa B ligante e fator estimulante da colônia de macrófagos. A análise da mancha ocidental demonstrou que os níveis de expressão das proteínas específicas do osteoclato TRAP e cathepsina K foram significativamente aumentados nas células tratadas em comparação com o grupo controle.O mais importante neste procedimento é o tempo de coletar células aderentes secundárias em 24 a 48 horas de cultura primária, as células monocito-macrófago da medula óssea começam a aderir completamente. As células monócito-macrófagos da medula óssea isoladas por este método podem ser induzidas em osteoclasta in vitro, fornecendo um modelo celular estável para o estudo da osteoporose.

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Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Os osteoclastos são polykaryons tecido-específicos do macrófago derivados da linhagem do monocyte-macrófago de pilhas de haste hematopoietic. Este protocolo descreve como isolar pilhas da medula de modo que as grandes quantidades de osteoclastos sejam obtidas ao reduzir o risco de acidentes encontrados em métodos tradicionais.

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Este artigo apresenta um método que combina a adesão total da medula óssea e a classificação da citometria de fluxo para isolar, cultivar, classificar e identificar células-tronco mesenquimais de medula óssea a partir de mandíbulas de ratos.

Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos

Apresentado aqui é um protocolo para anexar peptídeo CD47 (pepCD47) a stents metálicos usando química polifosfosfonato. A funcionalidade dos stents metálicos utilizando pepCD47 impede o apego e ativação de células inflamatórias, melhorando assim sua biocompatibilidade.

Mitigação do apego de células transmitidas sanguíneas a implantes metálicos através da imobilização de peptídeos derivados do CD47

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Esta pesquisa descreve duas técnicas para isolar abundantes armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) da medula óssea de ratos. Um método combina um kit comercial de isolamento de neutrófilos com centrifugação por gradiente de densidade, enquanto o outro emprega apenas centrifugação por gradiente de densidade. Ambas as abordagens produzem NETs funcionais superando as dos neutrófilos do sangue periférico.

Abordagem única para isolar neutrófilos de medula óssea de rato com capacidade comparável

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

Aprenda o método de adesão secundária para isolar células de linhagem monócito-macrófago de medula óssea de ratos. Esta técnica permite diferenciar osteoclastos in vitro para estudos de biologia óssea e osteoporose.

Isolamento das células de linhagem monócito-macrófago dos ossos de ratos por método de adesão secundário

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