Name: Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprenda um pipeline para investigar estruturas e vias de sinalização de receptores S1P usando cromatografia de exclusão molecular e criomicroscopia eletrônica. Este método auxilia pesquisadores no desenvolvimento de fármacos direcionados.

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Os dados do complexo S1PRs-Gi foram colhidos no Centro Crio-EM da China Ocidental na Universidade de Sichuan e no Cryo-EM Center na Universidade do Sul de Ciência e Tecnologia (SUSTech) e processados no Centro de Computação de Alto Desempenho duyu na Universidade de Sichuan. Este trabalho foi apoiado pela Natural Science Foundation of China (32100965 para L.C., 32100988 a W.Y., 31972916 à Z.S.) e pelo Fundo de Pesquisa pós-doutorado em tempo integral da Universidade de Sichuan (2021SCU12003 a L.C.)

<ol><li>Verstockt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+modulation+and+immune+cell+trafficking+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).</li>
<li>Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+and+its+receptors%3A+structure%2C+signaling%2C+and+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).</li>
<li>Cartier, A., Hla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate%3A+Lipid+signaling+in+pathology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy.</a> Science. 366 (6463), 5551(2019).</li>
<li>Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+sphingosine-1-phosphate+in+cardiovascular+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology.</a> Pharmacological Research. 156, 104793(2020).</li>
<li>Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptor+nomenclature+review%3A+IUPHAR+Review+8%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).</li>
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<li>Pelletier, D., Hafler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fingolimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fingolimod for multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).</li>
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<li>Pyne, N. J., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate and cancer.</a> Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).</li>
<li>Abu-Farha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+metabolism+in+COVID-19+virus+infection+and+as+a+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544(2020).</li>
<li>Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fingolimod%3A+lessons+learned+and+new+opportunities+for+treating+Multiple+Sclerosis+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).</li>
<li>Murakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29+regulates+vascular+contraction+via+S1P3+receptor%3A+investigation+based+on+a+new+S1P3+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist.</a> Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siponimod for multiple sclerosis.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).</li>
<li>Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod%3A+a+review+in+secondary+progressive+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis.</a> CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).</li>
<li>Lamb, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Ozanimod: first approval.</a> Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).</li>
<li>Scott, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod+%28RPC1063%29+is+a+potent+sphingosine-1-phosphate+receptor-1+%28S1P1%29+and+receptor-5+%28S1P5%29+agonist+with+autoimmune+disease-modifying+activity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).</li>
<li>McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SphK-S1P-SIPR+pathway+as+a+potential+therapeutic+approach+for+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189(2020).</li>
<li>O'Sullivan, C., Dev, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+the+S1P1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure and function of the S1P1 receptor.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
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<li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+GPCR-G+protein+complex+in+lipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).</li>
<li>Renaud, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+in+drug+discovery%3A+achievements%2C+limitations+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).</li>
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<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+signaling+complexes+of+lipid+receptors+S1PR1+and+S1PR5+reveal+mechanisms+of+activation+and+drug+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition.</a> Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).</li>
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<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+sphingosine-1-phosphate+receptor+1+activation+and+biased+agonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism.</a> Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).</li>
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<li>Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+approach+to+single-particle+processing+in+RELION%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline approach to single-particle processing in RELION.</a> Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Brilot, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam-induced+motion+of+vitrified+specimen+on+holey+carbon+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film.</a> Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gctf%3A+Real-time+CTF+determination+and+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Gctf: Real-time CTF determination and correction.</a> Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+selection+of+cryo-EM+particles+in+RELION-1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3.</a> Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+mechanisms+of+lipid+GPCRs+by+lysophosphatidic+acid+and+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate.</a> Nature Communications. 13 (1), 731(2022).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+VIP1+receptor-G+protein+complex+revealed+by+a+NanoBiT+tethering+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4121(2020).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassays+of+adenosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+and+guanosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+using+acetylcholinesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase.</a> Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Este protocolo descreve um pipeline primário para determinar as estruturas de S1PRs por crio-EM e medir a potência de ativação dos S1PRs pelo ensaio de inibição cAMP mediado por Gi. Alguns passos são cruciais para o sucesso do experimento.
Para purificar o complexo S1PRs-Gi, a qualidade do vírus e a saúde das células SF9 devem ser mais atentas. A expressão do receptor é drasticamente reduzida em células pobres de Sf9 . A saúde das células SF9 foi avaliada medindo seu...

Sphingosine-1-fosfato (S1P), um produto metabólico de sphingolipids na membrana celular, é uma molécula de sinalização linfosfídica onipresente que envolve várias atividades biológicas, incluindo tráfico de linfócitos, desenvolvimento vascular, integridade endotelial e frequência cardíaca 1,2,3. O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através de cinco subtipos receptores S1P (S1PRs 1-5); Os S1PRs são encontrados em uma variedade de tecidos e exibem preferências únicas para proteínas G a jusante 4,5. O S1PR1 é principalmente acoplado à proteína Gi, que posteriormente inibe a produção de cAMP; S1PR2 e S1PR3 são acoplados com Gi, Gq e G12/13, e S1PR4 e S1PR5 transdutos através de Gi e G12/136.
A sinalização S1P-S1PR é um alvo terapêutico crítico para múltiplas doenças, incluindo doenças autoimunes7, inflamação8, câncer9 e até COVID-1910. Em 2010, o fingolimod (FTY720) foi licenciado como um medicamento de primeira classe direcionado aos S1PRs para tratar a esclerose múltipla da recaída (MS)11. No entanto, é capaz de vincular a todos os S1PRs, exceto S1PR2, enquanto a ligação inespecífica ao S1PR3 resulta em edema do córtex cerebral, constrição vascular e brônquica e vazamento epitelialpulmonar 12. Como estratégia alternativa para aumentar a seletividade terapêutica, foram produzidos ligantes específicos do subtipo para o receptor. O Siponimod (BAF312) foi aprovado em 2019 para o tratamento de recaída de MS13; ele visa efetivamente S1PR1 e S1PR5, enquanto não tem afinidade com OPR3, apresentando menos efeitos colaterais na prática clínica14. Em 2020, a Food and Drug Administration dos EUA autorizou o ozanimod para a terapia deESM 15. Foi relatado que o ozanimod possui uma seletividade 25 vezes maior para S1PR1 do que para S1PR516. Notavelmente, no contexto da atual pandemia COVID-19, descobriu-se que drogas agonistas direcionadas às S1PRs podem ser utilizadas para tratar o COVID-19 usando técnicas de terapia imunomodulatória17. Em comparação com fingolimod, o ozanimod tem mostrado superioridade na redução dos sintomas em pacientes COVID-19 e agora está sendo submetido a testes clínicos10. Compreender a base estrutural e a função dos S1PRs estabelece uma base significativa para o desenvolvimento de uma droga que tem como alvo seletivamente as S1PRs18.
Muitas técnicas são usadas para investigar as informações estruturais de biomacromléculas, incluindo cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia eletrônica (EM). A partir de março de 2022, existem mais de 180.000 estruturas depositadas no Protein Databank (PDB), e a maioria delas foi resolvida pela cristalografia de raios-X. No entanto, com a primeira estrutura de resolução quase atômica da TPRV1 (resolução 3.4 Å) relatada por Yifan Cheng e David Julius em 201319, a microscopia crio-elétron (crio-EM) tornou-se uma técnica mainstream para estruturas proteicas, e o número total de estruturas em PDB foi superior a 10.000. As áreas de avanço crítica são o desenvolvimento de novas câmeras para imagens conhecidas como câmeras diretas de detecção de elétrons e novos algoritmos de processamento de imagens. A Crio-EM revolucionou a biologia da estrutura e a descoberta de drogas baseada em estruturas na última década20. Como entender como os complexos macromoleculares cumprem seus complicados papéis na célula viva é um tema central nas ciências biológicas, o crio-EM tem o potencial de revelar conformações de complexos moleculares dinâmicos, particularmente para proteínas transmembranas21. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior superfamília de proteínas transmembranas e as metas de mais de 30% dos fármacos atualmente comercializados22. O desenvolvimento da crio-EM contribuiu para uma explosão de estruturas de alta resolução de complexos proteicos GPCR-G, permitindo a determinação estrutural para alvos "intratáveis" que ainda não estão acessíveis à análise cristalográfica de raios-X no designde medicamentos 23. Assim, o aplicativo crio-EM oferece a chance de determinar a estrutura tridimensional dos GPCRs em condições quase nativas perto da resolução atômica24. Os avanços no crio-EM tornam possível visualizar fundamentos mecanicistas da estimulação ou inibição do GPCR, e se beneficiar ainda mais na descoberta dos novos locais de vinculação para a criação de medicamentos direcionados ao GPCR25.
Contando com os tremendos avanços da tecnologia crio-EM, identificamos estruturas de complexos de sinalização Agonizantes S1PR1-, S1PR3 e S1PR5-Gi recentemente26,27. Em humanos, os S1PRs são encontrados em vários tecidos e exibem preferências únicas para proteínas G a jusante 4,5. O S1PR1 é principalmente associado à proteína Gi, que posteriormente inibe a produção de monofosfato de adenosina 3′,5′cíclica (cAMP). S1PR3 e S1PR5 também são capazes de acoplamento com Gi 6,28. Uma vez que a ativação do receptor acoplado gi diminui a produção de cAMP29, um ensaio de cAMP de inibição gi foi introduzido para medir os efeitos de inibição de cAMP para capturar alterações funcionais 26,27. Usando uma versão mutante de Photinus pyralis luciferase em que uma umidade de proteína de ligação cAMP foi inserida, este ensaio cAMP oferece um método simples e confiável para monitorar a atividade gpcr através de alterações na concentração cAMP intracelular30. É um ensaio funcional sensível e não radioativo e pode ser aplicado para monitorar a sinalização a jusante em tempo real de uma ampla gama de GPCRs para fins de descoberta de drogas31.
Aqui, é fornecido um resumo dos métodos críticos na resolução dos modos de ativação e reconhecimento de drogas dos S1PRs, incluindo principalmente manipulações crio-EM e um ensaio cAMP de inibição gi. Este artigo tem como objetivo fornecer orientação experimental abrangente para novas explorações nas estruturas e funções dos GPCRs.

<table><tbody><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; Filtro M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 42213-PS</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de corte de 100 kDa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88533</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>Cat# 43016</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Corning</td><td>Cat# 3917</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 9087-70-1</td><td></td></tr><tr><td>Apirase</td><td>NEB</td><td>Cat# M0398S</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção de baculovírus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10362100</td><td>Para a preparação de P0 baculovírus</td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B6506</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1 ATCC</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C6512</td><td></td></tr><tr><td>CryoSPARC</td><td>Punjani, A., et al.,2017</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; competente E.coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# EC0112</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina-Potássio Sal</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# 50227</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# S311-500</td><td></td></tr><tr><td>ESF921 meio de cultura de células</td><td>Sistemas de Expressão</td><td>Cat#&nbsp; 96-001</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>F12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Box</td><td>Cat# SAG-01U-02</td><td></td></tr><tr><td>Bandeira resina</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# A4596</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>APExBIO</td><td>Cat# B1421</td><td></td></tr><tr><td>Gctf</td><td>Zhang, 2016</td><td>&nbsp; https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td></tr> <tr><td>GDN</td><td>Anatrace</td><td>Cat# GDN101</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de filtração</td><td>em gel GE healthcare</td><td>Cat# 28990944</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 3.11</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Solarbio</td><td>Cat# L1312</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP kit de ensaio</td><td>Promega</td><td>Cat# E1291</td><td>Gi-inibição cAMP kit de ensaio</td></tr><tr><td>GloSensor plasmídeo</td><td>Promega</td><td>Cat# E2301</td><td>Sensor plasmídeo</td></tr><tr><td>Grace' s medium</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 11595030</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8 Graphpad</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88284</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# H4034</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME Reagente</td><td>Polyplus Transfecção</td><td>Cat# 114-15</td><td>reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Janamicina</td><td>Solarbio</td><td>Cat# K1030</td><td></td></tr><tr><td>LB médio</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 12780052</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L2884</td><td></td></tr><tr><td>LMNG</td><td>Anatrace</td><td>Cat# NG310</td><td></td></tr><tr><td>MotionCor2</td>(<td>Zheng et al., 2017)</td><td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td><td></td></tr><tr><td>NanoCab</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 1121822</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-G&alpha; i</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBacdual-G&beta; 1&gama; 2</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# K210003</td><td>Para a preparação de plasmídeos e P0 baculovírus</td></tr><tr><td>Q5 kit de mutagênese dirigida ao local</td><td>NEB</td><td>Cat# E0554S</td><td>Para a preparação de plasmídeos</td></tr><tr><td>Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>Cat# 251448</td><td></td></tr><tr><td>RELION-3.1</td><td>(Zivanov et al., 2018)</td><td></td><td></td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</tr><tr><td>S1PRs cDNA</td><td>addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>scFv16</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 703976</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Sistemas de Expressão</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siponimod</td><td>Selleck</td><td>Cat# S7179</td><td></td></tr><tr><td>colato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1254</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 leitor de microplacas</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic T4L DNA (sequência)</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgtgt<br/& Gt; atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtgagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 77720</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Solarbio</td><td>Cat# T8180</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lisofosfolipídios (LPLs) são lipídios bioativos que incluem sphingosine 1-fosfato (S1P), ácido linfosfídico, etc. O S1P, um produto metabólico de sphingolipids na membrana celular, é um dos LPLs mais bem caracterizados que regula uma variedade de respostas fisiológicas celulares através de vias de sinalização mediadas por receptores de sphingosina 1-fosfato (S1PRs). Isso implicava que o sistema de sinalização S1P-S1PRs é um alvo terapêutico potencial notável para distúrbios, incluindo esclerose múltipla (EM), doenças autoimunes, câncer, inflamação e até COVID-19. Os S1PRs, um pequeno subconjunto da família de receptores acoplado de proteínaS A (GPCR), são compostos por cinco subtipos: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 e S1PR5. A falta de informações estruturais detalhadas, no entanto, impede a descoberta de drogas visando S1PRs. Aqui, aplicamos o método de microscopia crio-elétron para resolver a estrutura do complexo S1P-S1PRs, e elucidamos o mecanismo de ativação, reconhecimento seletivo de drogas e acoplamento de proteína G usando ensaios funcionais baseados em células. Outros receptores linfosfolipídos (LPLRs) e GPCRs também podem ser estudados usando essa estratégia.

Antes de congelar a amostra do complexo S1PRs-Gi, a amostra purificada precisa ser separada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e analisada com cromatografia de filtração de gel. A Figura 2 mostra o complexo S1PR3-Gi como exemplo. A fração máxima do complexo proteico GPCR-G homogêneo foi geralmente localizada a ~10,5 mL da cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 2A). A análise de página SDS do complexo S1PR3-Gi (Figura 2B</st...

O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através da subfamília de receptores S1P (S1PRs). Aqui, um pipeline é descrito para expor sobre as estruturas e função das S1PRs.

Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Abordamos os humores de ativação e recálculo de medicamentos do S1PRS por tripulação, manipulações em EM e estado inhab A M P A e base menos significativa para o desenvolvimento de uma droga que visa solidamente os avanços do S1PRS para tornar possível virulizar subpinções magnísticas de estimulação ou habitação gp ZR e outros benefícios na descoberta dos locais de ligação normal para a criação de medicamentos direcionados à T BCR. A qualidade da amostra é a base para tudo no experimento EM correto. Os fatores essenciais para uma preparação simples incluem vários estados de produtos da venda da linha SF e uma concentração N g Demonstrando que o procedimento será Heli Wang um estudante de pós-graduação do meu nível.Para a purificação de proteínas carregue esta cena do dedo um receptor de fosfato ou solução complexa de proteína S one P R S G para uma cromatografia de exclusão de tamanho ou coluna de filtragem de gel S E C pré-equilibrada com tampão S E C a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto a quatro graus Celsius. Para usar as frações coletadas para microscopia crio-elétron concentre-as usando um concentrador de corte de 100 kilodalton a 1.300 XG a quatro graus Celsius. Durante o processamento de dados para classificação 2D na classificação preliminar de partículas, escolha a função de classificação 2D no software Rely On e clique em procurar à direita do arquivo estrela de imagens de entrada na opção IO.Então escolha as partículas.estrela. Em seguida, na opção de otimização, defina o número de classes para 100 e o diâmetro da máscara de A para 140. Na opção de computação, defina o número de partículas agrupadas para 10 e entre no diretório de uma unidade local rápida e rápida na partícula de cópia para arranhar o campo do diretório.Para um processamento mais rápido, selecione sim para aceleração de GPU usada. Para seleção de subconjuntos de bons resultados 2D como modelos, vá para a opção IO da função de seleção de subconjunto e clique em procurar à direita de classes selecionadas do model.star. Em seguida, escolha run_it025_model.estrela como entrada e clique em executar na janela pop-up verificar imagens de classificação e reverter tipo. Em seguida, clique no visor. Depois de escolher bons resultados 2D representativos como referência para referência da função de escolha automática, clique com o botão direito do mouse e selecione salvar classes selecionadas.Para usar o modelo para a segunda rodada de auto-colheita, vá para a opção IO de função de escolha automática. Clique em procurar à direita de micrografos de entrada para escolher automaticamente e escolha micrografias.star. Em seguida, clique em procurar à direita de referências 2D e escolha class_averages.star.Além disso, selecione não para ou use leplossian em gaussiano. Em seguida, realize a extração de partículas usando o sufixo de sublinhar o sufixo de sublinhar auto pick.star. Realize a classificação 2D usando partículas.estrela, seguido por seleção subconjunto usando corrida sublinhar zero 20 five_optimizer. estrela Para extração de partículas, depois de clicar em procurar à direita do arquivo estrela de micrografo na opção IO, escolha micrografias. estrela e selecionar sim para ou re extrair partículas refinadas.Depois de clicar em procurar à direita do arquivo estelar de partículas refinadas, selecione partículas. estrela para gerar um modelo 3D inicial e um mapa de referência, clique em procurar o modelo inicial 3D à direita do arquivo estrela de imagens de entrada na opção IO e escolha as partículas anteriores.star. Em seguida, na opção de otimização, defina o número de classes para uma e o diâmetro da máscara de A para 140.Para classificação 3D e geração de um mapa 3D preliminar, após a seleção de partículas. estrela como demonstrado anteriormente, clique em navegar para a direita do mapa de referência e escolha o modelo de sublinhação inicial dot mrc. Em seguida, na opção de otimização, defina o número de classes para quatro a seis e o diâmetro da máscara de A para 140.Para a geração de máscaras, depois de selecionar um bom mapa 3D como entrada na opção IO, defina o limiar inicial de binarização para 0,05, e o mapa binário estendido para estes muitos pixels para três. Em seguida, vá para a opção máscara e definir. Adicione borda macia a estes muitos pixels a oito.Para o próximo processamento, abra o software Trino Spark, crie um novo espaço de trabalho e clique em job builder para o primeiro trabalho. Para importar a pilha de partículas, entre no caminho de partículas no campo meta caminho de partículas e no caminho dos filmes no campo do caminho de dados de partículas. Em seguida, importe volumes 3D inserindo o caminho do melhor volume 3D gerado antes no caminho de dados de volume e selecionando máscara para o tipo de volume que está sendo importado.Para refinamento não uniforme, arraste as partículas de sublinhamento importadas anteriormente geradas como a entrada de partículas de partículas de refinamento não uniforme. O volume de sublinhado importado, ressalta um como a entrada de refinamentos não uniformes volume de volume e máscara de sublinhado importado sublinha um como a entrada de máscara de refinamentos não uniformes. Máscara. Em seguida, clique em Q para iniciar o processamento e repita o procedimento para obter uma boa resolução.Mapa 3D S1PRGI. Após a construção plasmida e preparação para transfecção transitória, adicione dois microgramas de DNA preparado em 200 microliters de tampão reagente transfeccionado. Misture por vórtice por 10 segundos e girando a mistura brevemente antes de usar.Adicione quatro microliters de reagente de transfecção e misture-o por vórtice e fiação como demonstrado anteriormente. Depois de incubar o tubo à temperatura ambiente por 15 minutos, solte lentamente 200 microliters da mistura de transfecção em cada poço de uma placa de seis poços contendo chok uma células e agite suavemente a placa ou misture completamente. Após quatro a seis horas de incubação, substitua o meio de transfecção pelo meio de crescimento celular composto por F 12 médio e 10% fbs antes de devolver a placa à incubadora.24 a 48 horas após a colheita pós-transeção das células, suspender as células em três mililitros de um tampão SA com sal de potássio d luciferiano. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, adicione 90 microliters da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços misturada suavemente e incubada à temperatura ambiente por 40 minutos. Para determinação do sinal de fluorescência, primeiro, prepare 10 soluções de estoque mililitro de siponimod em D M S O.Em seguida, faça uma diluição serial no tampão H B S S S contendo 25 forscalina micromolar e estimule as células com 10 microlitres de várias concentrações desta solução agonista por 30 minutos.Em seguida, conte o sinal de luminescência em um leitor de microplaca selecionando luminescência para método de detecção. Ponto final para tipo de leitura e fibra de luminescência para tipo de óptica no software associado. Além disso, definir a óptica ganhar para 255.Em seguida, importe os valores do sinal de fluorescência obtidos em um programa de planilha e processe os dados usando a função de resposta de dose de dose de curva de regressão não linear. O complexo S1PRS GI poderia ser purificado com sucesso por cromatografia de exclusão de tamanho, que foi verificada pela página da SDS. Além disso, o protocolo de microscopia eletrônica seguido neste estudo foi eficaz na diferenciação entre partículas S1PRSGI com classes 2D claras e bem definidas e partículas de má qualidade.Além disso, um mapa de microscopia eletrônica de S1PR3 GI com uma boa resolução poderia ser gerado pela correlação da casca furrier através de refinamento não uniforme. Após análise estrutural, ensaios funcionais para S one P R três foram feitos por transfecção de C H O K uma célula com plasmídeos receptor e sensor, que revelou que o plasmídeo receptor para a razão plasmida sensor de um a três produz resultados ótimos. No entanto, os resultados foram menos realistas em 2 93 células Nesse processamento, a escolha de algoritmos na seção de partículas e a seção de classificação 2D e 3D é importante para a resolução dos complexos proteicos MPS G especialmente para modelagem dos vazamentos e ecfs.

a-pipeline-to-investigate-structures-signaling-pathways-sphingosine-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca 2 +, esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.

Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

PI (4,5) P 2 regula várias funções celulares, mas a sua organização em nanoescala na membrana plasmática da célula é mal compreendida. Por rotulagem PI (4,5) P 2 com uma sonda fluorescente de duas cores fundido com o domínio de homologia plecstrina, descrevemos uma nova abordagem para estudar o PI (4,5) P 2 em distribuição espacial da membrana plasmática em escala nanométrica .

Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar e qualificar cada espécie de esfingomielina usando múltiplas reação monitoramento e modo de MS/MS/MS, respectivamente.

Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Os esfingolípidos são metabólitos bioativos com papéis bem estabelecidos na doença humana. Caracterizar alterações em tecidos com espectrometria de massa pode revelar papéis na etiologia da doença ou identificar alvos terapêuticos. No entanto, o composto OCT usado para criopreservação em biorrepositórios interfere na espectrometria de massa. Delineamos métodos para analisar esfingolipídios em tecidos humanos incorporados em OCT com LC-ESI-MS/MS.

Preparação de tecidos humanos incorporados em composto de temperatura de corte ideal para análise de espectrometria de massa

Este protocolo utiliza o inchaço de agarose como uma técnica poderosa e generalizável para incorporar proteínas de membrana integral (IMPs) em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (GUVs), como descrito aqui para a reconstituição da proteína humana receptora de serotonina 1A (5-HT1AR), uma das classes de receptores farmacofarologicamente importantes acoplados à proteína G.

Construção de membranas lipídicas modelo incorporando receptores acoplados de proteína G (GPCRs)

Apresentamos um método econômico para avaliar a permeabilidade da membrana lipossomal com sensibilidade e resolução superiores às técnicas convencionais. Usando uma nova reação de substituição de ligante encapsulada, esta técnica detecta alterações induzidas pela fosfolipase A2 nas membranas do modelo. Facilmente integrada com análises padrão, essa abordagem acessível melhora a resolução para estudar a biofísica da membrana e as interações de toxinas.

Um ensaio de permeabilidade de membrana lipossomal para investigar os efeitos dos grupos fosfato de fosfatidilinositol na ação membranotrópica do veneno PLA2

Apresentamos diretrizes para o desenvolvimento de 'transdutores químicos' sintéticos que podem induzir a comunicação entre proteínas naturalmente não relacionadas. Além disso, são apresentados protocolos detalhados para sintetizar e testar um 'transdutor' específico que permite que um fator de crescimento ative uma enzima desintoxicante e, consequentemente, regule a clivagem de um pró-fármaco anticâncer.

Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

A ligação de trifosfato de guanosina (GTP) é um dos primeiros eventos na ativação do receptor acoplado com proteína G (GPCR). Este protocolo descreve como caracterizar farmacologicamente as interacções específicas de GPCR-ligando, monitorizando a ligação do análogo de GTP radio-marcado, [ 35 S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), em Resposta a um ligando de interesse.

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

Aprenda um pipeline para investigar estruturas e vias de sinalização de receptores S1P usando cromatografia de exclusão molecular e criomicroscopia eletrônica. Este método auxilia pesquisadores no desenvolvimento de fármacos direcionados.

Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

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