Name: Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca2+ em miócitos de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a medir a função contrátil e os transientes de cálcio em miócitos de ratos isolados. Este protocolo permite estudar a disfunção cardíaca e avaliar respostas a agentes terapêuticos em modelos animais.

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Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) grant R01 HL144777 (MVW).

Os estudos realizados em roedores seguiram a Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanitários e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Para este estudo, os miócitos foram isolados de ratos Sprague-Dawley e F344BN de 3-34 meses de idade, pesando ≥ 200 g5. Foram utilizadas as taxas masculinas e femininas.
1. Estimulação miocitária para estudos da função contrátil
<ol><li>Faça meios frescos à base de M199 para cada conjunto de miócitos isolados (Tabela de Materiais). 1 dia antes da marcha, placa 2 x 104 Ca 2+ tolerantes a miócitos em forma de bastonete em22 mm2 lâminas de vidro revestidas de laminina (CSs), conforme descrito anteriormente8.</li>
	<li>Para preparar as câmaras, mergulhe cada câmara em 10% de água sanitária por 1 h. Em seguida, lave as câmaras com água corrente da torneira por 30-45 min, seguida de água destilada substituída a cada 5 min por 30 min, seguida de água deionizada substituída a cada 5 min por 30 min e um enxágue final em água deionizada.</li>
	<li>Secar as câmaras em uma superfície limpa por 20-30 min (Figura suplementar 1A-C). Em seguida, os UV tratam as câmaras em um armário de biossegurança por 5 min em cada direção (total = 20 min). Esta etapa não é necessária para câmaras pré-esterilizadas. CUIDADO: Deixe a área para minimizar a exposição aos raios UV.</li>
	<li>Remova a tampa da câmara, adicione 3 mL de meio à base de M199 (ver Tabela de Materiais) a cada poço (Figura suplementar 1B), substitua a tampa e pré-aqueça a câmara em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO 2 e 20% de O2.</li>
	<li>Esterilizar fórceps em um esterilizador de contas quentes a 250 °C por 20-25 s. Transfira a câmara de estimulação pré-aquecida da incubadora para um gabinete de biossegurança.</li>
	<li>Transfira cada coverslip (CS) contendo miócitos cardíacos para poços individuais na câmara de estimulação usando pinça estéril. Transfira CSs quatro de cada vez, seguido de aquecimento por 10 minutos antes da transferência dos quatro CSs restantes para manter a temperatura do meio.</li>
	<li>Anexar macacos de banana à câmara de estimulação em uma extremidade (Figura suplementar 1C) e ao estimulador na outra extremidade (Figura suplementar 1D).</li>
	<li>Defina a frequência do estimulador para 0,2 Hz e defina a tensão (~ 12 V) para alcançar a contração em ~10%-20% de todos os miócitos cardíacos em forma de bastonete dentro de um poço. Para determinar o número de miócitos em contração, coloque a câmara sob um microscópio invertido com ampliação de 4x a 10x.</li>
	<li>Colocar a câmara de estimulação numa incubadora a 37 °C a 5% de CO2 (Figura suplementar 1E). Troque o meio a cada 12 h usando o meio pré-aquecido em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 20-25 min. Continue a estimulação elétrica por até 3 dias com a mídia trocada a cada 12 h.</li>
</ol>2. Análise da função contrátil de miócitos cardíacos de ratos adultos
<ol><li>Pré-aqueça uma embalagem de gel e um meio em uma incubadora de 37 °C por 30 minutos antes do experimento.</li>
	<li>Ligue os componentes da plataforma de função contrátil listados na Tabela de Materiais e mostrados na Figura Suplementar 2, com especial atenção aos componentes-chave, que incluem uma tabela antivibração (Figura Suplementar 2A-1) com um microscópio invertido com um filtro vermelho profundo (590 nm) (Figura Suplementar 2A-2,3) e uma câmera CCD (Figura Suplementar 2A-4) conectada a um controlador CCD (Figura suplementar 2A-5 e Figura suplementar 2C-5) e integrada com um computador PC (Figura suplementar 2B-14).</li>
	<li>Montar a tubulação na bomba peristáltica (Figura suplementar 2A-8; Figura suplementar 2A-8), transfira o pacote de gel pré-aquecido para o suporte do tubo (Figura suplementar 2A-9) e ligue o vácuo (Figura suplementar 2A-11) e a alimentação para o estimulador celular (Figura suplementar 2B-13).</li>
	<li>Colocar um tubo de 50 mL com meio no suporte do tubo isolado (Figura suplementar 2A-9) e iniciar a perfusão a ~0,5 mL/min através do tubo da bomba peristáltica (Figura suplementar 2E-8).</li>
	<li>Adicione uma pequena quantidade de meio pré-aquecido a um pequeno barco de pesagem (~ 2 mL). Transfira um CS contendo miócitos da câmara de estimulação para o barco de pesagem. Devolver a câmara de estimulação a 37 °C na incubadora de CO2 a 5%.</li>
	<li>Remova o CS do barco de pesagem e limpe suavemente a parte inferior. Transfira o CS para uma câmara CS recém-lubrificada (Figura suplementar 2A, F-10; seta preta) e adicione suavemente uma gota de mídia (~200 μL) ao CS.</li>
	<li>Coloque um suporte de eletrodo de platina sobre o CS (Figura suplementar 2F; seta cinza) e coloque um novo CS por cima usando pinças. Coloque uma montagem superior (Figura 2F suplementar; seta branca) sobre o sanduíche CS e, em seguida, instale dois ou quatro parafusos de cabeça de panela #0 para terminar de montar a câmara.</li>
	<li>Uma vez que o meio esteja presente em toda a tubulação da bomba, prenda a tubulação ao pré-aquecedor e, em seguida, conecte o pré-aquecedor à câmara CS montada na etapa 2.7. Comece a perfusão a 0,5 mL/min e coloque um lenço de papel abaixo da câmara para se certificar de que não há vazamentos.</li>
	<li>Coloque a câmara CS no adaptador de palco. O meio perfundido é coletado na extremidade oposta da câmara com tubos conectados a um sistema de vácuo. Ligue o sistema de aquecimento (Figura suplementar 2A, D-7) e equilibre a câmara, a objetiva e o pré-aquecedor por ~5-10 min para atingir uma temperatura constante do meio de 37 °C. Visualize miócitos com a objetiva de imersão em água de 40x no microscópio durante esse tempo de equilíbrio.</li>
	<li>Ative o estimulador de estimulação (Figura suplementar 2B-13) ajustando a tensão para 1,5x a configuração necessária para que 80% das células em forma de bastonete se contraiam, o que normalmente é de 35-40 V. Defina a frequência de estimulação para 0,2 Hz para otimizar a função contrátil e a sobrevivência dos miócitos.</li>
	<li>Colete traços contráteis de encurtamento e realongamento de miócitos continuamente perfundidos e cadenciados. Para coletar medições de encurtamento, use uma câmera CCD (Figura suplementar 2A-4) conectada a um controlador CCD (Figura suplementar 2B-5,C) e um computador dedicado com uma placa controladora de E/S (Figura suplementar 2B-14; consulte Tabela de materiais). A plataforma mede o encurtamento do sarcômero em miócitos de ratos, embora resultados semelhantes sejam obtidos a partir de medições de miócitos coletadas das bordas longitudinais dos miócitos (ver Ecklerle et al.14).</li>
	<li>Para coletar rastreamentos de encurtamento de sarcômero, abra o software no computador, selecione OK e Arquivo > Novo. Prepare um modelo de tela selecionando Rastreamentos > Editar Limites de Usuário > Comprimento do Sarcomere e, em seguida, definindo valores máximos e mínimos, que normalmente estão entre 2,0 μm e 1,5 μm. Calibrar a câmera CCD com uma gráticula de 0,01 mm antes de fazer medições nos miócitos (Figura 1D).</li>
	<li>Para registrar rastreamentos de comprimento de sarcômero, selecione Arquivo > Novo. Identifique um miócito em contração e posicione-o ao longo do eixo longitudinal da câmera de modo que o padrão de estriação seja vertical (Figura 1B).</li>
	<li>Use o mouse do computador para colocar a caixa da região de interesse (ROI) (caixa rosa) sobre o miócito (Figura 1C). Selecione Coletar e Iniciar para registrar a função contrátil. Recorde de encurtamento por 60 s de cada miócito em baixas frequências de estimulação (≤0,5 Hz).</li>
	<li>Registre o encurtamento do sarcômero de 5-10 células por CS. Realize medições em 1 célula/CS se os estudos incluírem tratamento com agonistas/antagonistas. Prepare um meio pré-aquecido separado e uma peça de tubo de perfusão diferente e dedicada carregada em uma bomba peristáltica multicanal e siga as etapas 2.9.-2.14. para medir o impacto da administração de drogas ou neuro-hormônios na função contrátil dos miócitos.</li>
	<li>Para medir o encurtamento em uma faixa de frequências, acelere os miócitos em cada frequência para obter o encurtamento em estado estacionário antes do registro5. Para esses estudos, dobre a taxa de perfusão e comece a gravar 15-20 s após a estimulação em uma nova frequência para obter respostas contráteis consistentes no estado estacionário para frequências na faixa de 0,2 Hz e 2 Hz. Normalmente, registre não mais do que 2 miócitos / CS para encurtamento em toda a faixa dada de frequências de estimulação.</li>
	<li>Registre pelo menos 7 contrações/célula para obter dados confiáveis de média de sinal ao analisar as gravações (consulte a etapa 3).</li>
</ol>3. Análise dos dados da função contrátil em miócitos isolados
<ol><li>Para começar, selecione Arquivo, escolha um rastreamento gravado e selecione Abrir. Selecione Tab 1 (lado esquerdo) do rastreamento base e defina o painel amarelo na parte superior do rastreamento como Sarc-Length. Selecione Rastreamentos e o modelo de tela preparado na etapa 2.12.</li>
	<li>Para preparar um modelo de análise, selecione Operações, Opções de Análise Transiente Monotônica, Marca de Evento TTL na caixa Definição de t0, bem como as seguintes opções no menu: Linha de base (comprimento do sarcômero em repouso), Velocidade de partida em relação a t0 (dep v), Pico (altura do pico e %altura do pico/linha de base ou bl%pico h), Velocidade de retorno relativa ao tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) usando t0 e Time to Baseline 50% (TTR50%) usando tPeak. Salve essas opções de análise selecionando Modelos > Salvar modelo de análise com um identificador. Carregue esse modelo de análise antes de analisar cada rastreamento.</li>
	<li>Para iniciar a análise de dados, selecione Marcas > Porta > Adicionar > Transitória Converter da Marca de Evento > Intervalo de Análise. Agora defina o intervalo de tempo de -0,01 s a 1,20 s para miócitos com ritmo de 0,2 Hz (Figura 2A, marcas vermelhas na porção inferior do traço bruto). Selecione um intervalo de tempo mais curto para miócitos estimulados em frequências mais altas.</li>
	<li>Produza um rastreamento com média de sinal selecionando Operações > Eventos Médios. Uma gravação com média de sinal aparece abaixo do rastreamento de base original.</li>
	<li>Selecione a guia 1 do rastreamento com média de sinal (lado esquerdo da tela) e selecione Marcas no menu superior, seguido de Adicionar transitório. Selecione Operações no menu superior e Análise Transiente Monotônica para exibir os valores médios de sinal para comprimento de sarcômero de linha de base, altura de pico, bl%pico h, dep v, ret v, TTP 50% e TTR50% no painel de exibição com média de sinal.</li>
	<li>Transfira cada análise transitória de sarcômero para uma planilha para a análise composta de miócitos múltiplos selecionando Exportar > Análise Transiente Monotônica > Corrente da Área de Transferência. Cole esses dados na planilha para cada rastreamento.</li>
	<li>Para copiar o rastreamento com média de sinal, selecione Exportar > Opções da Área de Transferência > Área >de Transferência Atual e defina as casas decimais como 5, selecione Delimitador de Tabulações e clique em OK e OK. Cole os traços médios de sinal para cada registro de miócitos em uma segunda planilha.</li>
</ol>4. Registo de transientes de Ca2+ em miócitos cardíacos adultos de ratos
<ol><li>Antes de medir os transientes de Ca 2+, ligue os componentes da plataforma descritos na etapa 2.2., juntamente com componentes adicionais de imagem de fluorescência (consulte componentes adicionais para análise de imagem de Ca2+ na Tabela de Materiais; Figura suplementar 2A-5,6; 2B-12).</li>
	<li>Preparar a solução-mãe de Fura-2AM contendo 1 mM de Fura-2AM mais probenecida 0,5 M em dimetilsulfóxido (DMSO). A probenecida minimiza o vazamento de Fura-2AM15.</li>
	<li>Diluir a solução-mãe a 5 μM de Fura-2AM e 2,5 mM de probenecida em 2,5 ml de meio (ver Tabela de Materiais) num poço de uma placa de 6 potes. Adicione apenas 2,5 mL de meio (sem Fura-2AM) a três poços adicionais na placa, cubra a placa com papel alumínio e pré-aqueça o meio a 37 °C.</li>
	<li>Transfira um CS contendo miócitos da câmara de estimulação para o poço contendo Fura-2AM, cubra e devolva a placa à incubadora de 37 °C com 5% de CO2 por 4 min. Montar a tubulação na bomba de perfusão e perfundir com o meio durante o período de carregamento da Fura-2AM, conforme descrito na etapa 2.4.</li>
	<li>Desligue ou minimize as luzes da sala para reduzir o fotobranqueamento por fluorescência e otimizar o sinal de fluorescência. Remova a placa de 6 poços da incubadora e, em seguida, lave o CS por 10 s em cada um dos três poços contendo apenas o meio. Transfira o CS para um pequeno barco de pesagem contendo meios pré-aquecidos (sem adição de Fura-2AM).</li>
	<li>Monte o CS na câmara CS recém-lubrificada depois de limpar suavemente a parte inferior do CS. Adicione suavemente uma gota de mídia ao CS e, em seguida, monte a montagem do eletrodo sobre o CS, seguido por um segundo CS e a montagem superior. Use parafusos de cabeça de panela #0 para terminar de montar a câmara celular, conforme descrito nas etapas 2.6.-2.7.</li>
	<li>Conecte a tubulação da bomba cheia de mídia ao pré-aquecedor, conecte o pré-aquecedor à câmara CS e coloque em um adaptador de palco, conforme descrito na etapa 2.8. Recolher o meio com o sistema de tubos de vácuo e ligar o sistema de aquecimento (Figura suplementar 2A,D-7) para equilibrar a câmara a 37°C, conforme descrito nos passos 2.8.-2.9.</li>
	<li>Ative o estimulador de estimulação (Figura suplementar 2B-13) ajustado para 35-40 V e 0,2 Hz, conforme descrito na etapa 2.10.</li>
	<li>Antes de gravar um transiente Ca2+ , ligue uma pequena lanterna ou um booklight montado perto do teclado do computador para ajudar a ver o teclado. Além disso, registre o fundo de fluorescência em uma área sem miócitos cardíacos. Para iniciar, selecione Arquivo > Iniciar > Novo, conforme descrito na etapa 2.12.</li>
	<li>Selecione um ROI e defina uma guia (ou barra de rastreamento, lado esquerdo) para o numerador bruto e uma segunda guia para o denominador bruto, definido no centro superior de cada guia. Registre o plano de fundo por 10-20 s. Clique com o botão direito do mouse e arraste sobre um painel da barra de rastreamento para obter os valores brutos do numerador e do denominador com média de sinal. Insira esses valores selecionando as Constantes de > de Operações e insira os valores brutos.</li>
	<li>Prepare um novo modelo de tela para coletar transientes de encurtamento e Ca2 +. Para o comprimento do sarcômero, selecione a guia 1 e use o mesmo processo descrito na etapa 2.13. Para imagens Ca2 +, selecione Tab 2 > Ratio (centro superior da guia) > Rastreamentos > Editar Limites de Usuário para definir os níveis mínimo e máximo para a proporção, que normalmente são definidos entre 1 e 5. Use o mesmo processo para definir os intervalos de numerador e denominador para as guias 3 e 4 (lado esquerdo).</li>
	<li>Posicione uma caixa de ROI sobre uma imagem de miócitos, conforme descrito na etapa 2.14. Selecione Arquivo > Nova > Coletar. Agora selecione Iniciar para coletar dados Ca2+ de encurtamento e ratiometric. Registre ≥7 contrações/célula para análise da média de sinal.</li>
	<li>Repita a gravação de rastreamento em segundo plano descrita na etapa 4.10. após o registro de 2-4 miócitos. Normalmente, registre 4-5 miócitos / CS ou menos miócitos se houver alterações significativas na leitura de fundo.</li>
</ol>5. Análise dos dados de transientes de Ca2+ em miócitos isolados.
<ol><li>Abra o arquivo desejado para análise e selecione Modelos > Modelo de tela para encurtamento mais transientes Ca2 +. Em seguida, selecione as guias 1 e 2 (à esquerda) para mostrar o comprimento do sarcômero e a proporção Ca2 +, respectivamente. Selecione Constantes de > de Operações e insira os valores do numerador e do denominador do rastreamento de plano de fundo Ca2 +.</li>
	<li>Prepare modelos de análise para encurtamento mais dadostransitórios Ca 2+. Selecione a guia 1 (lado esquerdo) e use o mesmo processo descrito na etapa 3.2. para definir o modelo de análise de comprimento do sarcômero.</li>
	<li>Selecione a guia 2 (lado esquerdo) e selecione Operações, Opções de Análise Transiente Monotônica, Marca de evento TTL na caixa Definição de t0 e as seguintes opções no menu: Linha de base (razão basal), Velocidade de saída em relação a t0 (dep v), Pico (altura do pico e %altura do pico/linha de base ou bl%pico h), Velocidade de decaimento em relação ao tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) usando t0 e Time to Baseline 50% (TTR50%) usando tPeak. Salve essas opções de análise selecionando Modelos e Salvar Modelo de Análise usando um novo nome de identificador. Carregue esse modelo de análise antes de analisar cada rastreamento.</li>
	<li>Use o mesmo processo descrito nas etapas 3.3.-3.6. para calcular a média do sinal e, em seguida, analisar o comprimento do sarcômero, seguido pelos mesmos passos para os transientes Ca2 +. Defina marcas separadas para o comprimento do sarcômero e para o traço da razão transitória Ca2 +.</li>
</ol>

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<li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li>
<li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortening+and+%5BCa2%2B%5D+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

O protocolo de estimulação crônica descrito na etapa 1 estende o tempo útil para estudar miócitos isolados e avaliar o impacto de tratamentos mais longos. Em nosso laboratório, resultados consistentes foram obtidos até 4 dias após o isolamento ao medir a função contrátil usando o comprimento do sarcômero em miócitos cronicamente cadenciados. No entanto, a função contrátil dos miócitos se deteriora rapidamente ao usar meios com mais de 1 semana para acelerar os miócitos.
Para estudos de função ...

A análise da função da bomba cardíaca geralmente requer uma série de abordagens para obter uma visão adequada, especialmente para modelos animais de insuficiência cardíaca (IC). A ecocardiografia ou as medidas hemodinâmicas fornecem informações sobre a disfunção cardíaca in vivo 1, enquanto abordagens in vitro são frequentemente empregadas para identificar se a disfunção surge de alterações no miofilamento e/ou no transiente Ca2+ responsável pela excitação do acoplamento, ou o potencial de ação, com função contrátil (por exemplo, acoplamento excitação-contração [E-C]). As abordagens in vitro também oferecem uma oportunidade para rastrear a resposta funcional a neurohormônios, alterações genéticas induzidas por vetores, bem como potenciais agentes terapêuticos2 antes de buscar estratégias de tratamento in vivo dispendiosas e/ou trabalhosas.
Várias abordagens estão disponíveis para investigar a função contrátil in vitro, incluindo medidas de força em trabéculas3 intactas ou miócitos permeabilizados4, bem como encurtamento descarregado e transientes de Ca2+ em miócitos intactos na presença e ausência de IC 5,6. Cada uma dessas abordagens tem como foco a função contrátil dos miócitos cardíacos, que é diretamente responsável pela função da bomba cardíaca 2,7. No entanto, a análise da contração e do acoplamento E-C é mais frequentemente realizada medindo o encurtamento do comprimento muscular e os transientes de Ca 2+ em miócitos adultos isolados e tolerantes a Ca2+. O laboratório utiliza um protocolo detalhado publicado para isolar miócitos de corações de ratos para esta etapa8.
Tanto o transiente de Ca2+ quanto os miofilamentos contribuem para o encurtamento e realongamento dos miócitos intactos e podem contribuir para a disfunção contrátil 2,7. Assim, esta abordagem é recomendada quando a análise funcional in vitro requer um miócito intacto contendo a maquinaria de ciclagem Ca2+ mais os miofilamentos. Por exemplo, miócitos isolados intactos são desejáveis para o estudo da função contrátil após a modificação do miofilamento ou da função de ciclagem de Ca2+ via transferência gênica9. Além disso, uma abordagem de miócitos intactos é sugerida para analisar o impacto funcional dos neurohormônios ao estudar o impacto das vias de sinalização do segundo mensageiro a jusante e/ou a resposta a agentes terapêuticos2. Uma medida alternativa da força dependente da carga em miócitos únicos é mais frequentemente realizada após a permeabilização da membrana (ou esfolamento) a baixas temperaturas (≤15 °C) para remover a contribuição transitória de Ca2+ e focar na função miofilamentar10. A medida da força dependente da carga mais transientes de Ca2+ em miócitos intactos é rara devido em grande parte ao desafio complexo e técnico da abordagem11, especialmente quando é necessário maior rendimento, como para medir as respostas à sinalização neurohormonal ou como uma tela para agentes terapêuticos. A análise das trabéculas cardíacas supera esses desafios técnicos, mas também pode ser influenciada por não miócitos, fibrose e/ou remodelamento da matriz extracelular2. Cada uma das abordagens descritas acima requer uma preparação contendo miócitos adultos porque os miócitos neonatais e miócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzíveis (iPSCs) ainda não expressam o complemento completo de proteínas de miofilamento adulto e geralmente não possuem o nível de organização de miofilamentos presente no miócito adulto em forma de bastonete2. Até o momento, evidências em iPSCs indicam que a transição completa para isoformas adultas excede mais de 134 dias em cultura12.
Dado o foco desta coleção na IC, os protocolos incluem abordagens e análises para diferenciar a função contrátil em miócitos intactos com falha versus não falha. Exemplos representativos são fornecidos a partir de miócitos de ratos estudados 18-20 semanas após uma coarctação suprarrenal, descrita anteriormente 5,13. Comparações são então feitas com miócitos de ratos tratados com simulação.
O protocolo e a plataforma de imagem aqui descritos são utilizados para analisar e monitorar alterações no encurtamento e transientes de Ca2+ em miócitos cardíacos em forma de bastonete durante o desenvolvimento de IC. Para esta análise, miócitos em forma de bastonete tolerantes a 2 x 10 44 Ca2+ são banhados em coberturas de vidro revestidas de laminina (CSs)de 22 mm 2 mm e cultivados durante a noite, conforme descrito anteriormente8. Os componentes montados para esta plataforma de imagem, juntamente com os meios e buffers usados para imagens ideais, são fornecidos na Tabela de Materiais. Um guia para análise de dados usando um software e os resultados representativos também são fornecidos aqui. O protocolo geral é dividido em subseções separadas, com as três primeiras seções se concentrando em miócitos isolados de ratos e análise de dados, seguidas por experimentos transitórios celulares de Ca2+ e análise de dados em miócitos.

<table><tbody><tr><td><forte>MÉDIA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina</td><td>Sigma (Roche)</td><td>3117057001</td><td>Concentração final = 0,2% (p/v)</td></tr><tr><td>Glutationa</td><td>Sigma</td><td>G-6529</td><td>Concentração final = 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td>Concentração final = 15 mM</td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M-2520</td><td>1 frasco rende 1 L; pH 7,45</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S-8875</td><td>Concentração final = 4 mM</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Fisher</td><td>15140122</td><td>Concentração final = 100 U/mL de penicilina, 100 &mu; g/mL de estreptomicina</td></tr><tr><td><forte>REAGENTES ESPECÍFICOS PARA Ca2+ IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen (Sondas Moleculares)</td><td>F1221</td><td>50 &mu; g/frasco; &nbsp; Prepare a solução estoque de 1 mM Fura-2AM + 0,5 M de probenicida em DMSO; &nbsp; A concentração final de Fura2-AM em meios é&nbsp; 5 &mu; M</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Invitrogen (Fisher)</td> <td>P36400</td><td>Adicione 7,2 mg de probenicida (0,5 M) a 1 mM de estoque Fura-2AM; A concentração final na mídia é de 2,5</td></tr> <tr><td>mMMATERIAIS PARA ESTIMULAÇÃO DE MIÓCITOS DE RATOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1 22&nbsp; mm2 lamínulas de vidro</td><td>Corning</td><td>2845-22</td><td></td></tr><tr><td>Cabos de 3 x 36 polegadas com conectores banana Pomona</td><td>Electronics</td><td>B-36-2</td><td>Figura Suplementar 1, painel C</td></tr><tr><td>Incubadora 37oC&nbsp; com 95% de O2:5% de CO2&nbsp;</td><td>Forma</td><td>3110</td><td>Suplementar Figura 1, painel E.&nbsp; Vários modelos são apropriados</td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança Classe II A/B3 com lâmpada UV</td><td>Forma</td><td>1286</td><td>Vários modelos são apropriados</td></tr><tr><td>Fórceps - Dumont #5 5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas quentes</td><td>Fine Science Tools</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido de baixa ampliação</td><td>Leica</td><td>DM-IL&nbsp;</td><td>Posicione este microscópio adjacente à incubadora para monitorar a contração dos miócitos estimulados no início da estimulação e após as mudanças de mídia; Objetivas 4X e 10X recomendadas</td></tr><tr><td>Câmara de estimulação</td><td>Suplementar personalizado</td><td></td><td>Figura 1, painel A. O sistema Ionoptix C-pace é uma alternativa disponível comercialmente ou consulte 22</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Ionoptix</td><td>Myopacer</td><td>Suplementar Figura 1, painel D.</td></tr><tr><td>MATERIAIS PARA FUNÇÃO CONTRÁTIL e/ou Ca2+ IMAGING ANALYSIS</td><td></td><td></td><td>ID na Figura Suplementar 2 & Alternativas/Opções Recomendadas</td></tr><tr><td>Componentes adicionais para análise de imagem Ca2+</td> Componentes essenciais do sistema <td>Ionoptix</td><td>: -- Sistema de contagem de fótons&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Fonte de alimentação Xenon com fonte de luz de excitação dupla&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Interface de fluorescência</td> <td>- O sistema de contagem de fótons contém um tubo fotomultiplicador (PMT) e um espelho dicróico e é instalado adjacente à câmera CCD. (painel A #4).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - A fonte de alimentação para a fonte de luz da lâmpada de xenônio (consulte o painel A #5 e o painel C, à esquerda) é integrada a uma interface de excitação dupla (excitação de 340/380 nm e emissão de 510 nm) mostrada no painel A #6. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - A interface de fluorescência entre o computador e&nbsp; a fonte de luz é mostrada no painel B, #12.</td></tr><tr><td>Câmera CCD com aquisição de imagem&nbsp; hardware e software (240 quadros/s)</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Myocam com controlador CCD&nbsp;</td><td>O controlador Myocam e CCD são mostrados na Fig. 2 suplementar, painel A #4&nbsp; e&nbsp; painel A #5 & painel C #5 (direita), respectivamente.&nbsp; O controlador é integrado a um sistema de computador PC (painel B #14).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Estimulador de câmara</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Painel B do Myopacer</td><td>, #13; Alternativa:&nbsp; Câmara de</td></tr><tr><td>perfusão montada em lamínula</td> modelo S48 Grass <td>Câmara personalizada para lamínula de 22 mm2 com adaptador de silicone e 2-4 parafusos Phillips de cabeça cilíndrica #0&nbsp; (seta, painel F)</td><td></td><td>Painel A #10 e painel F; &nbsp; &nbsp; A temperatura da câmara é calibrada para 37oC usando uma sonda TH-10Km e o controlador de temperatura TC2BIP (ver controlador de temperatura).&nbsp; Alternativas comerciais:&nbsp; Ionoptix FHD ou célula C-stim Câmaras; Sistema de estimulação de cultura Cell MicroControls</td></tr><tr><td>Computador e software dedicados para coleta de dados e análise de transientes de função/Ca2+</td><td>PC Ionoptix</td><td>com placa de PC Ionwizard e software</td><td>Painel B, #14; A função contrátil é medida usando os módulos de aquisição SarcLen (comprimento do sarcômero) ou SoftEdge (comprimento do miócito) do software IonWizard. O software Ionwizard também inclui o software de aquisição PMT para raciométrica&nbsp; Imagem Ca2+ em mioyctes carregados com Fura-2AM. - Um gabinete eletrônico de montagem em rack de 4 postes e prateleiras são recomendados para abrigar o somputer e o estimulador celular.&nbsp; A interface de fluorescência para imagens de Ca2+ também está alojada neste gabinete (veja abaixo).</td></tr><tr><td>Fórceps - Dumont #5 TI</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td>Painel F</td></tr><tr><td>Suporte de tubo isolado para mídia</td><td>Painel personalizado</td><td></td><td>A #9; Este suporte é facilmente montado usando isopor e um pacote de gel pré-aquecido para manter a mídia aquecida</td></tr><tr><td>Microscópio de campo claro invertido</td><td>Nikon</td><td>TE-2000S</td><td>Instale uma torre rotativa para epifluorescência (Painel A #2) para imagens de Ca2+. Um filtro condensador vermelho escuro (590 nm) também é recomendado para minimizar o branqueamento por fluorescência durante a imagem de Ca2+.</td></tr><tr><td>Mesa Isoladora</td><td>Controle de Vibração TMC</td><td>30 x 36 polegadas</td><td>Painel A, #1; Desejável:&nbsp; prateleiras elevadas, blindagem Faraday&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Oculares e objetiva de microscópio</td><td>Nikon</td><td>10X CFI oculares 40X água CFI Plan Fluor objective</td><td>Panel A #3; 40X objetiva:&nbsp; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&nbsp; Um aquecedor de objetiva Cell MicroControls HLS-1 é montado ao redor da objetiva (veja o controlador de temperatura abaixo).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NOTA:&nbsp; Dispensadores de imersão em água também estão agora disponíveis para objetivas à base de água. &nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>Painel A #8 e painel E</td></tr><tr><td>pequeno barco de pesagem</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Cell MicroControls</td><td>TC2BIP</td><td>Painel A #7; Painel D. Este controlador de temperatura aquece a câmara de lamínula a 37oC.&nbsp; &nbsp; &nbsp; Um pré-aquecedor e um aquecedor de objetiva são recomendados para esta plataforma.&nbsp; A Cell MicroControls HPRE2 pré-aquecedor e&nbsp; HLS-1 são controlados&nbsp; pelo controlador de temperatura TC2BIP para nossos estudos.</td></tr><tr><td>Luz LED sob o armário com sensor de movimento&nbsp;</td><td>Luz LED Sylvania</td><td>#72423</td><td>Recomendado para coleta de dados durante Ca2+ imagens transitórias sob luz mínima da sala.. &nbsp; Alternativa:&nbsp; Um clipe na lanterna / luz do livro com pescoço flexível - vários fornecedores estão disponíveis.</td></tr><tr><td>Linha de vácuo com frasco Ehrlenmeyer em linha e filtro de proteção</td><td>Tubulação Fisher</td><td>Tygon - E363; &nbsp; frasco Ehrlenmeyer em polipropileno - 10-182-50B; Filtro de vácuo - 09-703-90</td><td>Painel A #11</td></tr></tbody></table>

análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de ca2+ em miócitos de roedores

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

A disfunção contrátil e os transientes de Ca2+ são frequentemente analisados a nível celular como parte de uma avaliação abrangente da lesão e/ou remodelação induzida pelo coração. Uma abordagem para avaliar essas alterações funcionais utiliza o encurtamento descarregado e análises transitórias de Ca2+ em miócitos cardíacos adultos primários. Para esta abordagem, os miócitos adultos são isolados por digestão de colagenase, tornados tolerantes ao Ca2+ e, em seguida, aderidos a coberturas revestidas de laminina, seguidas de estimulação elétrica em meio livre de soro. O protocolo geral utiliza miócitos cardíacos de ratos adultos, mas pode ser prontamente ajustado para miócitos primários de outras espécies. Alterações funcionais em miócitos de corações lesados podem ser comparadas a miócitos simulados e/ou a tratamentos terapêuticos in vitro . A metodologia inclui os elementos essenciais necessários para a estimulação dos miócitos, juntamente com a câmara celular e os componentes da plataforma. O protocolo detalhado para esta abordagem incorpora as etapas para medir o encurtamento descarregado pela detecção do comprimento do sarcômero e transientes celulares de Ca2+ medidos com o indicador ratiometric Fura-2 AM, bem como para a análise de dados brutos.

Estudos de função contrátil são realizados em miócitos de ratos a partir do dia seguinte ao isolamento (dia 2) até 4 dias após o isolamento. Embora os miócitos possam ser registrados no dia seguinte ao isolamento (ou seja, dia 2), tempos de cultura mais longos são frequentemente necessários após a transferência gênica ou tratamentos para modificar a função contrátil8. Para miócitos cultivados por mais de 18 h após o isolamento, o protocolo de estimulação descrito na seção 1 ajuda a manter os túbul...

Um conjunto de protocolos são apresentados que descrevem a medida da função contrátil via detecção do comprimento do sarcômero juntamente com a medição transitória de cálcio (Ca2+) em miócitos isolados de ratos. A aplicação desta abordagem para estudos em modelos animais de insuficiência cardíaca também está incluída.

Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca2+ em miócitos de roedores

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Esta abordagem detecta alterações na função contrátil durante o desenvolvimento da insuficiência cardíaca. A resposta funcional dos miócitos aos neurohormônios e potenciais agentes terapêuticos também pode ser rastreada. O posicionamento do miócito pode ser prático, mas é essencial para a obtenção de imagens consistentes do comprimento do sarcômero.Demonstrando o procedimento está Margaret Westfall, professora associada e pesquisadora principal do laboratório. Antes de iniciar o experimento, pré-aqueça um pacote de gel e um meio em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos. Ligue os componentes da plataforma de função contrátil conforme mencionado no manuscrito e monte a tubulação na bomba peristáltica.Em seguida, transfira o pacote de gel pré-aquecido para o suporte do tubo e ligue o vácuo na potência para o estimulador celular. Coloque um tubo de 50 mililitros com meio no suporte do tubo isolado para iniciar a perfusão a 0,5 mililitros por minuto através do tubo da bomba peristáltica. Em seguida, adicione dois mililitros de meio pré-aquecido a um pequeno barco de pesagem e transfira uma folha de cobertura contendo miócitos da câmara de estimulação para o barco de pesagem.Devolver a câmara de estimulação à incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Remova o deslizamento da tampa do barco de pesagem e limpe suavemente a parte inferior antes de transferi-lo para uma câmara de deslizamento da tampa recém-untada e adicionar uma gota de mídia ao deslizamento da tampa. Coloque um suporte de eletrodo de platina sobre o deslizamento da tampa, em seguida, coloque um novo deslizamento da tampa sobre o topo com pinça e coloque um suporte superior sobre o sanduíche deslizante da tampa.Instale dois ou quatro parafusos de cabeça de panhead número zero para terminar de montar a câmara. Na bomba peristáltica, quando o meio estiver presente em toda a tubulação, prenda a tubulação ao pré-aquecedor e o pré-aquecedor à câmara deslizante da tampa. Em seguida, inicie a perfusão a 0,5 mililitros por minuto e coloque um lenço de papel abaixo da câmara para garantir que não haja vazamentos.Depois de colocar a câmara de deslizamento da tampa no adaptador de estágio do microscópio, ligue o sistema de aquecimento e equilibre o conjunto por cinco a 10 minutos para atingir uma temperatura constante do meio de 37 graus Celsius no centro da câmara. Observe o meio perfundido sendo coletado na extremidade oposta da câmara com tubos conectados a um sistema de vácuo. Durante o tempo de equilíbrio, visualize os miócitos com a objetiva de imersão em água de 40x no microscópio.Para ativar o estimulador de ritmo, defina a tensão para 35 a 40 volts e ajuste a frequência de estimulação para 0,2 hertz para otimizar a função contrátil e a sobrevivência dos miócitos. Para coletar traços de encurtamento de sarcômero, abra o software no computador e selecione ok, arquivo e novas guias. Prepare um modelo de tela selecionando rastreamentos, edite limites de usuário e comprimento de sarcômero.Registre os traços de comprimento do sarcômero com o arquivo e novas abas, identifique um miócito em contração e posicione o miócito ao longo do eixo longitudinal da câmera para que o padrão de estriação seja vertical. Use o mouse do computador para colocar a região de interesse ou a caixa ROI sobre o miócito. Selecione coletar e iniciar para registrar a função contrátil.Registre o encurtamento por 60 segundos de cada miócito em baixas frequências de estimulação de 0,5 hertz. Registre o encurtamento do sarcômero de cinco para 10 células por folha de cobertura. Para medir o encurtamento em uma faixa de frequências, coloque os miócitos em cada frequência para obter o encurtamento em estado estacionário antes do registro.Dobre a taxa de perfusão e comece a gravar 15 a 20 segundos após a estimulação em uma nova frequência na faixa de 0,2 a dois hertz e registre não mais do que dois miócitos por deslizamento de cobertura para encurtar toda a faixa dada de frequências de estimulação. Registre pelo menos sete contrações por célula para obter dados médios de sinal confiáveis. Selecione o arquivo, escolha um rastreamento gravado e, em seguida, selecione abrir.Selecione a guia um do rastreamento base e, em seguida, defina o painel amarelo na parte superior do rastreamento para obter o comprimento do sarc. Prepare um modelo de análise com opções de análise transitória monotônica de operações e marca de evento TTL na definição da caixa T Zero nas opções necessárias no menu. Salve essas opções de análise selecionando modelos e salve o modelo de análise com um identificador.Carregue o modelo de análise antes de analisar cada rastreamento. Para analisar os dados, selecione marcas, porta, adicione transiente e converta a partir da marca de evento e do intervalo de análise. Defina o intervalo de tempo de menos 0,01 a 1,20 segundos para miócitos com ritmo de 0,2 hertz.Selecione um intervalo de tempo mais curto para miócitos estimulados em frequências mais altas. Selecione operações e eventos médios para produzir uma gravação média de sinal abaixo do rastreamento de base original. Em seguida, selecione a guia um do traço médio do sinal e, em seguida, vá para marcas no menu superior, seguidas por adicionar transiente, escolha operações e análise transiente monotônica para exibir os valores médios do sinal para os parâmetros de sarcômero de linha de base no painel de exibição de média do sinal.Selecione exportar análise transitória monotônica e corrente da área de transferência e transferir a análise transitória de sarcômero para uma planilha para a análise composta de miócitos múltiplos. Para copiar o rastreamento médio do sinal, selecione exportar, rastrear atual, depois as guias da área de transferência e das opções em ordem e defina as casas decimais como cinco. Escolha o delimitador de guias e clique em OK.Acelere os traços médios do sinal para cada registro de miócitos em uma segunda planilha. O estudo mostrou que a sobrecarga pressórica ou PO, reduziu a função contrátil dos miócitos quando comparada ao grupo sham. No entanto, quatro dias após a transferência gênica da troponina cardíaca IT 144D ou cTnIT144D, a capacidade contrátil nos miócitos PO retornou a níveis simulados, indicando que a função dos miócitos poderia ser restaurada.Nos estudos iniciais, a transferência gênica de cTnIT144D aumentou o pico de encurtamento e níveis elevados de cálcio diastólico em comparação com CTnI. Ajustes finos no posicionamento do miócito cardíaco são frequentemente necessários para obter traços claros de encurtamento. Este protocolo também pode ser realizado em miócitos cardíacos carregados com corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio, como o Fura-2 AM, para detectar transientes de cálcio, além de encurtamento.

analysis-cardiac-contractile-dysfunction-ca2-transients-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Músculo papilar do ventrículo esquerdo de murino pode ser usado para investigar in vitro a contractilidade cardíaca. Este artigo descreve em detalhes o isolamento e protocolos experimentais para estudar características contráteis cardíacas.

Medidas de contratilidade no isolado músculos papilares de Investigação de Cardiac inotropia em Ratos

Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Este trabalho descreve um protocolo que avalia as alterações da sensibilidade do miofilamento Ca2+ durante a contração em miócitos cardíacos isolados do coração de ratos. Juntamente com a eletrofisiologia cardíaca, os níveis sistólicos/diastólicos de citosol Ca2+ e a contração/relaxamento, essa medição é imperativa para sustentar os mecanismos que medeiam o acoplamento excitação-contração cardíaca em corações saudáveis e doentes.

Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

Apresentamos a metodologia para o isolamento dos miócitos de urina e como obter traços de tensão ou cálcio simultaneamente com traços de encurtamento de sarcomeros usando fotometria de fluorescência com medições simultâneas de geometria celular digital.

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

Este protocolo visa descrever passo a passo a técnica de extração e avaliação da função cardíaca utilizando cardiomiócitos esfolados. Esta metodologia permite a medição e a sintomadulação aguda da função de miofilament usando pequenas biópsias congeladas que podem ser coletadas de diferentes locais cardíacos, de camundongos a homens.

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

Apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos eletromecânicos da ativação do GtACR1 em cardiomiócitos de coelho. Fornecemos informações detalhadas sobre isolamento celular, cultivo e transdução adenoviral, e sobre experimentos funcionais com as técnicas de patch-clamp e fibra de carbono.

Avaliação eletromecânica da atividade cardiomiocito optogeneticamente modulada

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Este protocolo descreve como medir a contratilidade em cardiomiócitos primários humanos adultos de corações doados com o sistema MyoBLAZER, uma plataforma confiável para avaliar mudanças na contratilidade induzidas por drogas durante o desenvolvimento pré-clínico.

Medida da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Primários Humanos Isolados

Este protocolo introduz o mapeamento óptico dual-dye de corações de camundongos obtidos de animais selvagens e knock-in afetados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluindo medidas eletrofisiológicas de voltagem transmembrana e transientes intracelulares de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial.

Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica

Aprenda a medir a função contrátil e os transientes de cálcio em miócitos de ratos isolados. Este protocolo permite estudar a disfunção cardíaca e avaliar respostas a agentes terapêuticos em modelos animais.

Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca²⁺ em miócitos de roedores

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