Name: Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Aprenda a criar um modelo de desmielinização focal estável em camundongos usando injeção estereotáxica de lisofosfatidilcolina no corpo caloso. Este método permite estudar mecanismos da esclerose múltipla e avaliar terapias potenciais.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grants: 82071380, 81873743).

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Tongji Medical College, Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong, China. Foram utilizados para o presente estudo camundongos adultos C57BL/6 masculinos e femininos (tipo selvagem, WT; 20-25 g; 8-10 semanas de idade). Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Os camundongos foram alojados em uma instalação animal específica sem patógenos (SPF) com água e alimentos fornecidos ad libitum. Eles foram mantidos em um período alternado de 12h de ciclo claro e escuro nas condições padrão de temperatura de 22 °C e umidade relativa de 55%-60%.
1. Preparação da solução LPC
<ol><li>Dissolva 25 mg de pó LPC (ver Tabela de Materiais) com 250 μL de solução mista de clorofórmio e metanol (1:1) para fazer uma solução LPC de 10% e transferi-la para um tubo de centrífuga de 500 μL. NOTA: Se o LPC não estiver completamente dissolvido, coloque o tubo centrífuga em um limpador ultrassônico e ultrassônico a 40 kHz por ~1h para obter uma solução uniforme.</li>
	<li>Divida a solução em 3 μL/tubo e armazene a −80 °C. NOTA: A solução pode ser armazenada por ~2 anos.</li>
	<li>Antes da cirurgia, diluir a solução (passo 1.2.) com 27 μL de solução naCl de 0,9% e manter a solução em um banho de água de temperatura constante a 37 °C. NOTA: Prepare a solução pouco antes de iniciar a injeção.</li>
</ol>2. Preparação cirúrgica
<ol><li>Use uma agulha de 32 G, 2 na agulha para conectar a uma seringa de 5 μL (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de que a seringa microliter está desobstruída. Retire 5 μL da solução LPC para a preparação da injeção.</li>
	<li>Anestesiar o rato em uma câmara de indução conectada a um vaporizador de isoflurano com 3% de isoflurane misturado com 100% de oxigênio a uma taxa de cerca de 0,3 L/min.</li>
	<li>Confirme a profundidade da anestesia pela falta de reflexo do dedo do sol enquanto a respiração está lisa.</li>
	<li>Raspe a cabeça do mouse entre as orelhas usando uma máquina de barbear elétrica. Aplique colírios lubrificantes para evitar o ressecamento da córnea durante o procedimento.</li>
	<li>Em seguida, posicione o mouse em uma estrutura estereotaxic (ver Tabela de Materiais) com o lado dorsal para cima, e fixe a cabeça com um cone de nariz e grampo de dente. Mantenha a anestesia com 1,2%-1,6% isoflurane pelo nariz. NOTA: A concentração de isoflurano pode ser ajustada de acordo com o estado respiratório dos camundongos.</li>
</ol>3. Procedimento cirúrgico
NOTA: Os animais são colocados em uma almofada de aquecimento durante todos os procedimentos.
<ol><li>Fixar o mouse no aparelho estereotaxico com barras de ouvido bilaterais. Certifique-se de que as barras de ouvido estão nivelados e a cabeça está horizontal e estável.</li>
	<li>Desinfete a pele na cabeça limpando várias vezes com iodophor seguido de álcool em movimento circular. Em seguida, use um bisturi para cortar uma pequena incisão de cerca de 1,5 cm ao longo da linha média do couro cabeludo para expor o crânio.</li>
	<li>Limpe o crânio com um cotonete mergulhado em peróxido de hidrogênio de 1% até que a bregma, lambda e fontanelle posterior sejam expostas. Coloque a seringa no aparelho estereotaxic. NOTA: Use peróxido de hidrogênio com cuidado e evite tocar nos tecidos circundantes.</li>
	<li>Certifique-se de posicionamento horizontal da cabeça do animal (tanto dianteira quanto traseira e esquerda e direita).<ol><li>Ajuste o botão do eixo Z do quadro estereotaxico para que a ponta da agulha e o crânio toquem sem dobrar e, em seguida, meça a coordenada do eixo Z. Verifique as coordenadas Z de bregma e fontanelle posterior.</li>
		<li>Ajuste a barra de ouvido para que a diferença entre as coordenadas Z de bregma e fontanelle posterior não seja superior a 0,02 mm. Em seguida, siga o mesmo método para medir as coordenadas Z das posições correspondentes nos lados esquerdo e direito da linha média. Ajuste a barra de ouvido para garantir que a esquerda e a direita estejam no mesmo nível.</li>
	</ol></li>
	<li>Localize o corpus calosum. Defina a origem XYZ como bregma. NOTA: O primeiro local de injeção é 1,0 mm lateral para o bregma, 2,4 mm de profundidade e 1,1 mm anterior. O segundo local de injeção é 1,0 mm lateral para o bregma, 2,1 mm de profundidade e 0,6 mm anterior. Por exemplo, a coordenada do bregma é (0,0,0). Meça a coordenada Z do local correspondente marcado como (-1, 1.1, X) e (-1, 0,6, Y). Pode-se determinar que a primeira coordenada do local de injeção do corpus callosum é (-1, 1.1, −[X + 2.4]), e o segundo local de injeção é (-1, 0,6, −[Y + 2.1]).</li>
	<li>Uma vez que o local de injeção é determinado, faça uma marca com um marcador estéril no crânio e registe as coordenadas.</li>
	<li>Perfurar suavemente o local marcado com uma broca de crânio (ver Tabela de Materiais). Tome cuidado para evitar qualquer sangramento.</li>
	<li>Mova lentamente a agulha para as coordenadas dadas e inicie a injeção. Para induzir a desmielinização do corpus callosum, injete 2 μL de solução LPC (etapa 1.) em cada local de injeção (etapa 3,5.) a uma taxa de 0,4 μL/min.</li>
	<li>Após a injeção, mantenha a agulha em cada local por mais 10 minutos. NOTA: Certifique-se de que o intervalo de duas injeções não seja superior a 20 minutos.</li>
	<li>Suture a pele com uma sutura 4-0 e espere o animal acordar dentro de 10 minutos. Administrar analgésicos no pós-operatório de acordo com as normas institucionais de cuidados com animais. NOTA: O tempo recomendado para eutanásia pode ser determinado de acordo com o propósito do experimento.</li>
</ol>4. Extração amostral para desmielinização focal
NOTA: Para obter detalhes sobre esta etapa, consulte o relatório publicado anteriormente14.
<ol><li>Dissolver corante vermelho neutro (ver Tabela de Materiais) em uma solução de 1% em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).</li>
	<li>horas antes de sacrificar os camundongos (para detalhes, ver referência anterior10), injetar 500 μL de corante vermelho neutro de 1% em PBS por injeção intraperitoneal para cada rato.</li>
	<li>Realizar perfusão cardíaca12 com 30 mL de 0,1% PBS pré-cozido a 4 °C.</li>
	<li>Corte o cérebro em 1 mm com um molde cerebral (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Visualize a lesão manchada com vermelho neutro sob o microscópio e dissociar a lesão. NOTA: Remova o máximo possível de tecido normal ao redor para melhorar a precisão da análise subsequente. O tecido da lesão pode ser examinado com RT-PCR, microscopia eletrônica e análises de manchas ocidentais.</li>
</ol>5. Coloração histológica e imunofluorescência
<ol><li>Para coloração histológica e imunofluorescência12, após perfusão cardíaca (passo 4.3.), remover o cérebro10, fixar em 4% PFA durante a noite (a 4 °C) e desidratar completamente em 30% de sacarose.</li>
	<li>Corte em seções cerebrais coronais de 20 mm usando um cortador congelado10 em temperatura constante (−20 °C).</li>
	<li>Use as fatias para coloração azul rápido luxol (LFB), imunofluorescência e mancha ocidental10.</li>
</ol>

<ol><li>Gaire, B. P., Choi, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+lysophospholipid+receptors+in+activation+of+neuroglia+and+their+neuroinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+mechanisms+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).</li>
<li>Villoslada, P., Steinman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+targets+and+therapeutics+for+neuroprotection%2C+remyelination+and+repair+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).</li>
<li>Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+the+CNS%3A+From+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Remyelination in the CNS: From biology to therapy.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).</li>
<li>Gentile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+exercise+in+experimental+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+microglial+Hv1+channel+is+associated+with+activation+of+autophagic+pathway+and+ROS+production+in+LPC-induced+demyelination+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+easily+reproducible+model+of+focal+white+matter+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).</li>
<li>Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+experimental+models+of+toxin-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).</li>
<li>Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+relaxation+characteristics+during+preacute+stage+of+lysophosphatidyl+choline-induced+demyelinating+lesion+in+rat+brain%3A+An+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis.</a> Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination%3A+A+primary+lipid+disrupting+myelinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy.</a> Glia. 66 (2), 327-347 (2018).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Kassis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+expression+in+white+matter+oligodendrocytes+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke.</a> Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).</li>
<li>Vorhees, C. V., Williams, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze%3A+Procedures+for+assessing+spatial+and+related+forms+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.</a> Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).</li>
<li>Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+focal+EAE+model+of+cortical+demyelination%3A+multiple+sclerosis-like+lesions+with+rapid+resolution+of+inflammation+and+extensive+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination.</a> Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+macrophages+in+progressive+multiple+sclerosis%3A+Relationship+to+neurodegeneration+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Kutzelnigg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+and+diffuse+white+matter+injury+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis.</a> Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality).</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
<li>Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+accelerates+remyelination+after+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination+in+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum.</a> Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).</li>
<li>Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model+for+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurologica+Scandinavica.+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model for demyelination.</a> Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).</li>
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<li>Torre-Fuentes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+demyelination+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologia+%28Barcelona%2C+Spain%29%22%5BJournal%5D)">Experimental models of demyelination and remyelination.</a> Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).</li>
<li>Merkler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+common+marmoset+reflects+the+immunopathology+of+pattern+II+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Journal%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions.</a> Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).</li>
<li>Ucal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+cortical+demyelination+of+both+hemispheres+can+be+induced+by+injection+of+pro-inflammatory+cytokines+via+an+implanted+catheter+in+the+cortex+of+MOG-immunized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats.</a> Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A ESM, doença desmielinização crônica do SNC, é uma das causas mais comuns de disfunção neurológica em adultos jovens20. Clinicamente, aproximadamente 60%-80% dos pacientes com ES experimentam o ciclo de recaídas e remissões antes de desenvolver umaESM 21,22 secundária-progressiva, e isso eventualmente leva a prejuízos de movimento cumulativos e déficits cognitivos ao longo do tempo23. Atualmente, nenhum modelo expe...

A sinalização linfosfolipídica mediada por receptores envolve diversos processos fisiológicos de quase todos os sistemasde órgãos 1. No sistema nervoso central (SNC), essa sinalização desempenha um papel crítico nas patógenias de doenças neurológicas autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). A esclerose múltipla é uma doença imunomediada crônica caracterizada por desmielinização patológica e resposta inflamatória, causando disfunção neurológica e comprometimento cognitivo 2,3. Após uma recaída contínua e a remissão durante a doença precoce, a maioria dos pacientes eventualmente evolui para o estágio secundário-progressivo, o que poderia causar danos irreversíveis ao cérebro e incapacidaderesultante 4. Acredita-se que a marca patológica do curso secundário-progressivo é a desmielinização de placas causadas por lesões inflamatórias5. Os tratamentos existentes para ESM podem reduzir significativamente o risco de recaída. No entanto, ainda não há terapia eficaz para danos desmielinizados de longo prazo causados pela ESMprogressiva 6. Assim, é necessário um modelo estávelmente estabelecido e facilmente reprodutível para estudar terapêuticas pré-clínicas que se concentrem na degeneração da matéria branca.
Demielinização e remiellinação são dois grandes processos patológicos no desenvolvimento da esclerose múltipla. A demyelinação é a perda da baia de mielina em torno de axônios induzidos por microglia com fenótipos pró-inflamatórios7, e leva à condução lenta de impulsos nervosos e resulta na perda de neurônios e distúrbios neurológicos. A remielinação é uma resposta endógena de reparo mediada por oligodenrócitos, onde distúrbios podem levar à neurodegeneração e comprometimento cognitivo8. A resposta inflamatória é crucial para todo o processo, afetando tanto o grau de dano e reparação da mielina.
Portanto, um modelo animal estável de desmielinização inflamatória persistente é significativo para a exploração de estratégias terapêuticas para MS. Devido à complexidade da ESM, vários tipos de modelos animais foram estabelecidos para imitar lesões desmielinizadoras in vivo, incluindo encefalomielite autoimune experimental (EAE), modelos tóxicos-desmielinizadores, cuprizone (CPZ) e linfosfatilina (LPC)9 . LPC é um lysofosfolipídio endógeno associado à inflamação, e pode induzir danos rápidos com toxicidade aos lipídios de mielina, levando à dessalinização focal. Com base em relatórios anteriores e pesquisas10,11, é fornecido um protocolo detalhado de injeção de dois pontos com algumas modificações. Geralmente, o modelo clássico de injeção LPC de um ponto só produz desmielinização local no local da injeção e é frequentemente acompanhado de remielinização espontânea12,13. No entanto, o modelo LPC de injeção de dois pontos pode demonstrar que o LPC pode induzir diretamente a desmielinização no calosum do corpus do mouse e causar desmielinização mais durável com pouca regeneração de mielina.

<table><tbody><tr><td>L-&alpha;-Lisofosfatidilcolina de gema de ovo</td> Agulha de calibre 32 <td>Sigma-Aldrich</td><td>L4129-25MG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HAMILTON</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l seringa</td><td>HAMILTON</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>broca de alta velocidade do crânio</td><td>forte, coreia</td><td>strong204</td><td></td></tr><tr><td>broca</td><td>Hager & Meisinger, Alemanha&nbsp;</td><td>REF 500 104 001 001 005</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de Anestesia Animal Matrx</td><td>MIDMARK</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Estereotáxico Portátil para Mouse</td><td>Reward</td><td>68507</td><td></td></tr><tr><td>Micro seringa</td><td>Reward</td><td>KDS LEGATO 130</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>VETEASY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>LuxoL rápido bLue</td><td>Servicebio</td><td>G1030-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>FUSUNPHARMA</td><td>20152021225</td><td></td></tr><tr><td>molde</td> cerebral <td>Recompensa</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Fixador</td> <td>de microscópio eletrônicoServicebio</td><td>G1102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho Neutro (C.I. 50040), para microscopia Certistain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.01376</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Básico Anti-Mielina&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#AB5864</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST-P pAb</td><td>MBL</td><td>#311</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Anticorpo Monoclonal (SolA15)</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Anticorpo Monoclonal Beta</td><td>Actina Scientific 14-5698-95</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Proteintech</td><td>66009-1-Ig&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Policlonal de Proteína Básica de Mielina</td><td>Proteintech</td><td>10458-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>OLIG2 Anticorpo Policlonal</td><td>Proteintech</td><td>13999-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; AffiniPure&nbsp; Burro anti-coelho&nbsp; IgG (H+L)</td><td>YEASEN</td><td>34206ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rato IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34412ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594&nbsp; AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34212ES60</td><td></td></tr><tr><td>HRP IgG Anti-Coelho para Cabras (H+L)</td><td>abclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>HRP IgG Anti-Rato para Cabras (H+L)&nbsp;</td><td>abclonal</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Adulto C57BL / 6 camundongos machos e fêmeas</td><td>Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-induced focal demyelination modelo em camundongos

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

A sinalização linfosfolipídida mediada por receptores contribui para a fisiopatologia de diversas doenças neurológicas, especialmente a esclerose múltipla (EM). Lisofosphatidylcholina (LPC) é uma lisofosfosfolipídio endógena associada à inflamação, e pode induzir danos rápidos com toxicidade aos lipídios de mielina, levando à desmielinização focal. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para injeção estereotática de LPC de dois pontos que poderia causar diretamente desmielinização grave e replicar a lesão de desmielinização experimental rapidamente e stably em camundongos por procedimento cirúrgico. Assim, esse modelo é altamente relevante para as doenças de desmielinização, especialmente a ESM, podendo contribuir para o avanço clínico da pesquisa. Além disso, os métodos de coloração azul rápido e imunofluorescência e Luxol foram usados para retratar o curso do tempo da desmielinização no caloso corpus de camundongos injetados com LPC. Além disso, o método comportamental foi utilizado para avaliar a função cognitiva dos camundongos após a modelagem. No geral, a injeção de dois pontos de linfosfatidylcholina através de um quadro estereotaxico é um método estável e reprodutível para gerar um modelo de dessalinização em camundongos para estudos posteriores.

A injeção de dois pontos do LPC resultou em uma dessalinização mais durável LPC leva principalmente a danos rápidos com toxicidade à mielina e decote da integridade do axônio15. O dia da injeção foi considerado como o dia 0. Os camundongos foram mantidos por um período de 10 a 28 dias (10 dpi e 28 dpi). A coloração10 do azul rápido luxol (LFB) foi utilizada para avaliar a área de desmielinização em camundongos nesses pontos de tempo. No modelo de injeção...

O presente protocolo descreve uma injeção de dois pontos de linfosfatilcolina através de um quadro estereotaxico para gerar um modelo de desmielinização estável e reprodutível em camundongos.

Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Nosso modelo é altamente relevante para doenças de desmielinização, especialmente a esclerose múltipla. E pode contribuir para o avanço relacionado à pesquisa clinicamente relevante. É um protocolo detalhado que pode causar desmielinização severa rapidamente e facada em camundongos por procedimento cirúrgico.Ao tentar essa técnica pela primeira vez, seja paciente e garanta que as coordenadas sejam precisas. Comece conectando uma agulha de calibre 32 a uma seringa de 5 microliter. Retire 5 microliters da solução LPC para a preparação da injeção.Em seguida, confirme a profundidade da anestesia do mouse pela falta de reflexo de beliscar o dedo do dedo do dedo enquanto a respiração é lisa. Posicione o mouse na estrutura estereotaxic com o lado dorsal para cima, e fixe a cabeça com um cone de nariz e grampo de dente. Fixar o mouse no aparelho estereotaxico com barras de ouvido bilaterais.Certifique-se de que as barras de ouvido estão nivelados e a cabeça está horizontal e estável. Desinfete a pele da cabeça limpando com iodophor. Em seguida, use bisturi para cortar uma pequena incisão para cerca de 1,5 centímetros ao longo da linha média do couro cabeludo para expor o crânio.Limpe a habilidade com um cotonete mergulhado em peróxido de hidrogênio de 1% até que a bregma, lambda e fontanelle posterior sejam expostas. Coloque a seringa no aparelho estereotaxic. Certifique-se do posicionamento horizontal da cabeça do animal e localize o corpo caloso.Uma vez que o local de injeção é determinado, registe as coordenadas, e faça uma marca com um marcador no crânio. Perfurar suavemente o local marcado com uma broca de crânio. Tome cuidado para evitar qualquer sangramento.Mova lentamente a agulha para as coordenadas dadas. Para induzir a desmielinização do corpus callosum, injete 2 microliters de solução LPC em cada local de injeção a uma taxa de 0,4 microliters por minuto. Após a injeção, mantenha a agulha em cada local por mais 10 minutos.Por fim, suturar a pele com uma sutura 4-0, e esperar o animal acordar em 10 minutos. A imagem representativa mostra a detecção das legiões de matéria branca através da mancha azul rápida de Luxol. A partir dos resultados, a desmielinização estável do corpus calosum pode ser vista aos 10 e 28 dias após a injeção.A quantificação da área de desmielinização em diferentes pontos de tempo é mostrada aqui. Através da coloração da imunofluorescência de proteína básica degradada da mielina, observou-se um notável aumento de dMBP no grupo injetado pelo LPC aos 10 dias após a injeção, o que representa a perda de mielina no caloso corpus. A análise da mancha ocidental da proteína básica da mielina, ou MBP, expressão mostrou uma perda significativa de MBP após a injeção de LPC.Beta-actin foi usado como controle de carregamento para medir a expressão da linha de base. Imagens de microscopia eletrônica confirmam a ultraestrutura mieliada no corpo caloso do grupo sham e do grupo injetado pelo LPC. GST-pi é o marcador da célula precursora oligodendrocyte, ou OPC, maturação de diferenciação.Após 10 dias de injeção de LPC, o GST-pi diminuiu em comparação com o grupo falso. Ao mesmo tempo, a capacidade de proliferação dos oligodendrócitos pode ser refletida pela proporção de oligodendrócitos proliferam e as células de linhagem total de oligodendrocytes. A maior proporção representa mais proliferação de oligodendrócitos após 10 dias após a injeção.As imagens representativas mostram o caminho de natação dos ratos em cada grupo, na presença da plataforma e após a remoção da plataforma. Os resultados sugerem que a memória espacial de camundongos desmielinados é significativamente prejudicada no modelo de injeção LPC de dois pontos. Ao tentar este procedimento, certifique-se de que a taxa de injeção é precisa, e mantenha a agulha em cada local por mais 10 minutos.

a-stably-established-two-point-injection-lysophosphatidylcholine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra o procedimento de acesso cirúrgico ao nervo óptico em um animal anestesiado e entrega precisa de lisolecitina para induzir a desmielinização focal, criando condições neuropatológicas para estudos posteriores.

Induzindo desmielinização local no nervo óptico usando lisolecitina

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de camundongo desmielinizante focal usando uma injeção de lisofosfatidilcolina (LPC) de dois pontos. O crânio de um camundongo anestesiado é exposto. As coordenadas de injeção são determinadas e um orifício é perfurado para permitir injeções de LPC em locais específicos. O LPC induz a desmielinização focal dos neurônios por meio da inflamação, enquanto uma injeção de dois pontos garante sua sustentabilidade.

Estabelecendo um modelo de camundongo de desmielinização focal por meio de uma injeção de dois pontos de lisofosfatidilcolina

Este vídeo demonstra o método para induzir a desmielinização em neurônios da medula espinhal de camundongos usando injeções de lisolecitina, seguida de remielinização por meio da migração e diferenciação de células precursoras de oligodendrócitos. O processo prejudica e restaura gradualmente a transmissão do sinal neuronal.

Desmielinização e remielinização de neurônios da medula espinhal de camundongos

Fonte: Wang, X. et. al., Entrega de medicamentos baseada em bomba osmótica para pesquisa de remielinização in vivo no sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o método de administração de medicamentos neuroterapêuticos usando uma bomba osmótica em um modelo de camundongo desmielinizado. A liberação controlada do medicamento promove a remielinização ativando as células produtoras de mielina no corpo caloso.

 Entrega de medicamentos neuroterapêuticos baseados em bomba osmótica em um modelo de camundongo desmielinizado

Uma nova ex vivo preparação para a imagem latente o mouse medula espinhal. Este protocolo permite a dois fotões imagiologia de interacções celulares vivos ao longo da medula espinal.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Doenças desmielinizantes podem ser modeladas em animais por aplicação focal de lisolecitina no SNC. Uma única injeção de lisolecitina na medula espinhal do camundongo produz uma lesão que se repara espontaneamente com o tempo. O objetivo é estudar os fatores envolvidos na desmielinização e remielinização e testar agentes para melhorar o reparo.

Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

O protocolo aqui apresentado permite a reprodução de uma desmielinização de matéria cinzenta generalizada de ambos os hemisférios corticais em ratos agouti machos adultos. O método compreende a implantação intracerebral de um cateter, imunização subclínica contra glicoproteína de oligodendrocyte de mielina e injeção intracerebral de uma mistura de citocinas pró-inflamatórias através do cateter implantado.

Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias

A desmielinização ocorre em múltiplas doenças do sistema nervoso central. Uma técnica confiável de entrega de medicamentos in vivo é necessária para remyeliar testes de drogas. Este protocolo descreve um método baseado em bomba osmótica que permite a entrega de drogas a longo prazo diretamente no parenchyma cerebral e melhora a biodisponibilidade da droga, com ampla aplicação em pesquisas de remyelination.

Entrega de drogas baseada em bomba osmótica para pesquisa de remyelination in vivo sobre o sistema nervoso central

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Aprenda a criar um modelo de desmielinização focal estável em camundongos usando injeção estereotáxica de lisofosfatidilcolina no corpo caloso. Este método permite estudar mecanismos da esclerose múltipla e avaliar terapias potenciais.

Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos

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