Name: Ensaio gravitaxis em larga escala de Larvas de Caenorhabditis Dauer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de gravitaxis em larga escala com larvas dauer de Caenorhabditis elegans. Este método de alta vazão melhora a detecção de comportamento gravitático e permite análises detalhadas de neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde ao JHR (#R01 5R01HD081266 e #R01GM141493). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Gostaríamos de reconhecer Pradeep Joshi (UCSB) por sua contribuição editorial. Consulta estatística fornecida pelo UCSB DATALAB.

As cepas utilizadas no presente estudo são C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (ver Tabela de Materiais). Uma população de dauers de sexo misto foi usada para cada ensaio.
1. Preparação da câmara
<ol><li>Trabalhe em um capuz de fumaça. Configure o espaço de trabalho com um queimador Bunsen, 1-2 lâminas de barbear, alicates, pinças e uma superfície de corte de plástico (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Para cada câmara, reúna duas pipetas sorológicas de 5 mL. Remova o plugue de algodão de uma pipeta com pinça. Segure uma lâmina de barbear sobre o queimador Bunsen até ficar quente usando alicate. Use a lâmina aquecida para cortar a extremidade afilada da segunda pipeta para que toda a pipeta tenha um diâmetro uniforme (Figura 1A).</li>
	<li>Trabalhando rapidamente, aproxime as duas extremidades modificadas da tubulação perto da chama, derretendo-as ligeiramente. Junte essas extremidades pressionando-as firmemente, garantindo que as paredes de ambas as pipetas sejam contínuas. Se alguma lacuna for visível após a adesão, separe-as e repita esta etapa (Figura 1A,B).</li>
</ol>2. Enchendo as câmaras com ágar
<ol><li>Prepare o NGM com 4% de ágar de acordo com os procedimentos padrão de vermes21. Enquanto o ágar ainda estiver derretido, encha cada câmara anexando-a a um pipettor sorológico e elaborando lentamente a solução. Sele a ponta com filme de parafina antes de remover a câmara do pipettor. Coloque a câmara plana (paralela à bancada) para esfriar. NOTA: Cobrir o frasco com envoltório (ver Tabela de Materiais) após a autoclavagem ajuda a evitar que bolhas se formem na solução18.<ol><li>Para minimizar quaisquer variações na consistência do ágar devido ao resfriamento irregular, segure o pipettor (ver Tabela de Materiais) paralelo à bancada enquanto elabora o ágar. Coloque as câmaras planas no banco e deixe o ágar endurecer antes de se mover. NOTA: A porcentagem de ágar e o conteúdo de mídia podem ser adaptados ao experimento. 4% de ágar é mais rígido do que a concentração de cerca de 2% usada para derramamento de placas e impede que os vermes enterrem através do meio em nossas mãos. No entanto, outros experimentadores observaram o comportamento de escavação por vermes adultos em até 9% deágar 18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez resfriado, aqueça uma chave hex (ou outra ferramenta metálica do mesmo tamanho, veja Tabela de Materiais) sobre um queimador bunsen. Pressione-o firmemente na parede de cada câmara cerca de 5 mm para um lado da linha média, criando uma pequena abertura no plástico (Figura 1C). Use uma lâmina aquecida para remover o algodão e extremidades afiladas da câmara e selar estas extremidades com filme de parafina. NOTA: Uma vez preparada, cada câmara deve ser usada dentro de 1 dia ou mantida a 4 °C por vários dias. Cubra todas as aberturas expostas com filme de parafina para evitar que o ágar seque.</li>
</ol>3. Isolating dauer larvas
<ol><li>10-15 dias antes do experimento, embrulhe cada cepa em 2-3 placas grandes de NGM com bactérias OP50 e enrole com filme de parafina. Após 10-15 dias, cada prato deve estar totalmente faminto com milhares de larvas dauer presentes no ágar, paredes e tampas. NOTA: Faça placas com antecedência usando uma receita OP50 grossa para lotação máxima (ver Tabela de Materiais). A formação de dauer também pode ser induzida através de outros métodos, incluindo a adição de feromônios ou crescendo a temperaturas mais altas22.</li>
	<li>Colete vermes enxaguando as tampas e placas com tampão M9 e canalizando a solução em tubos de centrífugas de 15 mL. Gire a 1.600 x g para 30-60 s em temperatura ambiente e aspire a maior parte do tampão M9 com uma pipeta ou aspirador de vácuo.</li>
	<li>Isolador dauers por tratamento com 1% de SDS seguido de um gradiente de flutuação de sacarose de 30% após o relatório publicado anteriormente20.<ol><li>Adicione 7 mL 1% de solução SDS a cada pelota de worm. Deixe os vermes na SDS por 30 minutos; gire os tubos continuamente durante este tempo para permitir a aeração. Enxágüe 3-5x com M9 para remover o detergente.</li>
		<li>Em seguida, adicione 5 mL M9 seguido por 5 mL de solução fria e filtrada de 60% de sacarose. Misture bem e, em seguida, centrífuga a 1.600 x g por 5 min a temperatura ambiente para criar um gradiente de separação.</li>
	</ol></li>
	<li>Encha novos tubos de centrífugas de 15 mL com 2 mL de tampão M9. Esmague as extremidades das pipetas pasteur de vidro para ampliar o furo e use essas pipetas para transferir a camada superior da solução (contendo dauers isolados) do gradiente de sacarose para os novos tubos. Enxágüe os dauers 3-5x com M9. NOTA: Haverá milhares de dauers isolados em solução neste momento. Eles podem ser usados imediatamente ou mantidos arejados girando em 5-7 mL M9 durante a noite.</li>
</ol>4. Adicionando dauers à câmara
<ol><li>Dauers centrífugas a 1.600 x g por 5 min à temperatura ambiente e aspiram a maior parte da solução M9 com um aspirador de pipeta ou vácuo. Para estimar a densidade dos vermes, conte manualmente o número de vermes em três gotículas separadas de 1 μL sob um microscópio dissecado. Use a média dessas contagens para aproximar o número de vermes por μL. NOTA: Alguns pipettores de pequeno volume podem ser incapazes de atingir o fundo de um tubo de centrífuga de 15 mL; neste caso, uma gota concentrada de vermes pode ser transferida primeiro para um pedaço de filme de parafina.</li>
	<li>Corte a ponta de pipeta de 10, 20 ou 200 μL para ampliar o furo. Ajuste a micropipette em um volume ligeiramente maior do que o volume de aspiração pretendido. Aspire aproximadamente 1-2 μL da solução concentrada de vermes (idealmente entre 100-300 worms) e permita que uma pequena quantidade de ar entre na ponta. NOTA: Um grande número de vermes (mais de 1.000) em uma câmara pode aumentar a faixa de distâncias percorrida devido à superlotação9.</li>
	<li>Empurre suavemente a ponta da pipeta para dentro do ágar enquanto deprimi a micropipette. Isso criará um site de injeção no ágar sem entupir a ponta. Solte os vermes no ágar. Use filme de parafina para selar a abertura.</li>
</ol>5. Correr e marcar o ensaio
NOTA: A gravitaxis pode ser testada em várias condições que podem afetar o comportamento9.
<ol><li>Para eliminar o maior número possível de variáveis, coloque as câmaras dentro de uma gaiola escura de Faraday (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Rotule cada câmara e pendure-a verticalmente dentro da gaiola de Faraday (execute isso usando fita de rotulagem). Teste controles horizontais simultaneamente colocando algumas câmaras planas dentro das mesmas condições ambientais. Teste as cepas experimentais contra vermes N2 verticalmente orientados como um controle positivo. Use câmaras orientadas horizontalmente contendo dauers N2 como um controle negativo adicional. NOTA: Os ensaios horizontais e verticais devem ser realizados no mesmo ambiente dentro do laboratório para minimizar a variabilidade ambiental entre as duas condições. Uma grande incubadora pode ser usada para abrigar ambas as gaiolas de Faraday.</li>
	<li>Dauers começam a se dispersar do local de partida após algumas horas e levam várias horas para chegar a ambos os lados da câmara. Deixe as câmaras intactas durante este tempo e marque dentro de 12-24 h após a injeção. NOTA: Não use um paralítico (como o azida de sódio) para imobilizar vermes que chegaram às extremidades das câmaras. Como a distribuição geral de vermes está sendo medida em vez de um índice de preferência (como em um ensaio de duas escolhas), o azida de sódio é desnecessário e pode alterar os resultados.</li>
	<li>Remova e marque câmaras gravitaxis uma de cada vez. Procure por dauers vivos sob um microscópio dissecando e marque suas localizações em tinta (Figura 1C,D). Não marque vermes dentro de 2,5 cm para ambos os lados do local da injeção, pois esses vermes não estão demonstrando uma preferência direcional.<ol><li>Além disso, evite marcar vermes que pareçam mortos ou estão presos no líquido. Descarte quaisquer câmaras contendo >50% de vermes mortos ou nadando. NOTA: Uma vez que a câmara tenha sido removida da área de teste, ela precisa ser pontuada prontamente para precisão. Dauers só devem ser visíveis entre a superfície do ágar e a parede da pipeta. Se o comportamento de escavação for observado, considere aumentar a concentração de ágar em ensaios futuros.</li>
	</ol></li>
	<li>Para quantificar os resultados, use um marcador para dividir cada metade da câmara em sete seções de 3,5 cm a partir de 2,5 cm do local da injeção (em algumas pipetas, 3,5 cm = 1 mL de volume). Use um contador de contagem manual (ver Tabela de Materiais) para contabilizar o número de worms observados em cada seção. NOTA: Deve haver sete seções em cada lado da origem, que podem ser numeradas de -7 (inferior) a +7 (superior). Esses números devem corresponder aos mesmos locais relativos com base na forma como as câmaras foram construídas; ágar é desenhado do -7 final para o +7 final na etapa 2.</li>
</ol>

<ol><li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+for+human+balance+control%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li>
<li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584(2014).</li>
<li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li>
<li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gravitational+Physiology%22%5BJournal%5D)">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li>
<li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391(2014).</li>
<li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%2C+is+regulated+by+IL2+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li>
<li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li>
<li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%A4der%2C+D-P+%22Euglena%3A+Biochemistry%2C+Cell+and+Molecular+Biology%22">Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology</a>. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston%27s+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li>
<li>Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186(2021).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069(2013).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493(2015).</li>
<li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293(2011).</li>
<li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li>
<li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn%27s+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Stata+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li>
<li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans%3A+a+sensible+model+for+sensory+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li>
<li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049(2018).</li>
<li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).</li>
<li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li>
<li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469(2013).</li>
<li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li>
<li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+the+vestibular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li>
<li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+vestibular+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li>
<li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207(2021).</li>
<li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hearing+and+balance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567(2019).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Comparação com métodos anteriores Ao contrário da quimiotaxis, a gravitaxis em Caenorhabditis não pode ser observada de forma confiável usando um design experimental tradicional de placa de ágar. Uma placa de Petri padrão tem 150 mm de diâmetro, resultando em apenas 75 mm disponíveis em qualquer direção para dauers demonstrarem preferência gravitaxis. Embora a preferência orientacional de C. elegans possa ser avaliada na solução12, este método é de baixa produ...

Sentir a atração gravitacional da Terra é crucial para a orientação, movimento, coordenação e equilíbrio de muitos organismos. No entanto, os mecanismos moleculares e o neurocircuito da sensação gravitacional são mal compreendidos em comparação com outros sentidos. Em animais, a sensação de gravidade interage e pode ser superada por outros estímulos para influenciar o comportamento. Pistas visuais, feedback proprioceptivo e informações vestibulares podem ser integrados para gerar uma sensação de consciência corporal em relação ao entorno de um animal 1,2. Por outro lado, a preferência gravitactica pode ser alterada na presença de outros estímulos 3,4,5. Portanto, o comportamento gravitactic é ideal para estudar a sensação da gravidade e entender a complexa integração sensorial e a tomada de decisões do sistema nervoso.
C. elegans é um organismo modelo especialmente útil para estudar gravitaxis devido ao seu ciclo de vida polifenóico. Quando expostas a estressores durante o desenvolvimento, incluindo calor, superlotação ou falta de alimentos, as larvas C. elegans se desenvolvem em dauers, que são altamente resistentes ao estresse6. Como dauers, os vermes realizam comportamentos característicos, como a nictação, em que os vermes "ficam" em suas caudas e acenam com a cabeça, o que pode facilitar a dispersão para melhores habitats7. Ensaios gravitaxis de C. elegans e C. japonica sugerem que larvas dauer negativamente gravitax, e que este comportamento é mais facilmente observado em dauers do que em adultos 8,9. Testar gravitaxis em outras cepas de Caenorhabditis pode revelar variação natural no comportamento gravitacático.
Mecanismos para a sensação gravitacional têm sido caracterizados em Euglena, Drosophila, Ciona, e várias outras espécies usando ensaios gravitaxis 3,10,11. Enquanto isso, estudos de gravitaxis em Caenorhabditis inicialmente forneceram resultados mistos. Um estudo da preferência orientacional de C. elegans descobriu que os vermes orientam com a cabeça para baixo em solução, sugerindo preferência gravitactica positiva12. Enquanto isso, embora os dauers C. japonica tenham sido identificados no início como sendo negativamente gravitactic8, este comportamento só foi recentemente descrito em C. elegans9. Vários desafios surgem no desenvolvimento de um ensaio representativo de gravitaxis em vermes. As cepas de caenorhabditis são mantidas em placas de ágar; por essa razão, ensaios comportamentais normalmente usam placas de ágar como parte de seu projeto experimental 13,14,15. O ensaio gravitaxis mais antigo relatado em Caenorhabditis foi realizado de pé uma placa ao seu lado em um ângulo de 90° para a placa de controle horizontal8. No entanto, o comportamento gravitaxis nem sempre é robusto nessas condições. Embora os vermes adultos possam ser avaliados para preferência orientacional na solução12, essa preferência direcional também pode ser dependente do contexto, levando a diferentes comportamentos se os vermes estiverem engatinhando em vez de nadar. Além disso, C. elegans é sensível a outros estímulos, incluindo campos leves e eletromagnéticos16,17, que interferem com suas respostas à gravidade9. Portanto, um ensaio gravitaxis atualizado que protege contra outras variáveis ambientais é importante para dissecar os mecanismos desse processo sensorial.
No presente protocolo, é descrito um ensaio para observar caenorhabditis gravitaxis. A configuração deste estudo baseia-se, em parte, em um método desenvolvido para estudar a integridade neuromuscular18,19. As larvas dauer são cultivadas e isoladas usando procedimentos padrão20. Eles são então injetados em câmaras feitas de duas pipetas sorológicas de 5 mL cheias de ágar. Estas câmaras podem ser orientadas vertical ou horizontalmente e colocadas dentro de uma gaiola escura de Faraday por 12-24 h para proteger contra campos claros e eletromagnéticos. A localização de cada verme nas câmaras é registrada e comparada com os táxis verticais de uma cepa de referência como C. elegans N2.

<table><tbody><tr>Solução <td></td><td></td> de <td>Dodecil Sulfato de Sódio a 1%</td><td>Do estoque 10% (p/v) SDS em água DI</td></tr><tr><td>15 mL Tubos de centrífuga</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>3 mm Chave</td><td></td><td></td> hexagonal <td>Outras ferramentas de metal de tamanho semelhante podem ser usadas</td></tr><tr><td>4% Agar em Meio de Crescimento Normal (NGM) - 1 L</td><td></td><td></td><td>Antes da autoclavagem: 3 g de NaCl, 40 g de ágar, 2,5 g de peptona, 2 g de dextrose, 10 mL de uracila (2 mg / mL), 500 &mu; L Colesterol (10 mg/mL), 1 mL de CaCl2, 962 mL DI de água; Após autoclavagem: 24,5 mL de tampão fosfato, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL de estreptomicina (200 mg/mL)</td></tr><tr><td>5 mL de pipetas sorológicas</td><td>Fisherbrand</td><td>S68228C</td><td>poliestireno, não vidro borossilicato</td></tr><tr><td>60% Solução</td><td></td><td></td> fria de sacarose <td>60% sacarose (p/v) em água DI; esterilizar por filtração (0,45 &mu; m). Manter em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>AF16 C. briggsae ou outra cepa</td><td></td><td></td> experimental <td>Disponível no CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr><tr><td>Bico</td><td></td><td></td><td></td>de Bunsen</tr><tr><td>Filme plástico</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305654</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>clínica</tr><tr><td>Lâminas de barbear descartáveis</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr>Gaiola <td></td><td></td><td>de Faraday</td><td>Pode ser construída usando papelão e folha de alumínio; 30" L x 6" W x 26" H ou maior</td></tr><tr><td>Marcadores</td><td></td><td></td> de tinta <td>Sharpie ou outra marca para marcação em plástico</td></tr><tr><td>Fita de rotulagem</td><td>Carolina</td><td>215620</td><td></td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td></td><td></td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td></tr><tr><td>N2 C. elegans cepa</td><td></td><td></td> Disponível nas placas NGM do <td>CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr> <tr><td>com ágar OP50</td><td></td><td></td><td>1,7% (p/v) em NGM (ver descrição: ágar 4% em NGM). Semente com filme de parafina OP50</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Tábua</td><td></td><td></td><td></td>de corte de plástico</tr><tr><td>Alicate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador vertical rotativo</td><td>BTLab SYSTEMS</td><td>BT913</td><td>Com barra de tubo de 22 x 15 mL</td></tr><tr><td>Pipetador sorológico</td><td>Corning</td><td>357469</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo</td><td>Laxco</td><td>S2103LS100</td><td></td></tr><tr><td>Contador</td><td>de contas ULINE</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Espessura NGM/meio de placa de ágar - 1 L</td><td></td><td></td><td>Ver 4% de ágar na receita NGM; substitua 40 g de ágar por 20 g</td></tr><tr><td>de pinça de</td><td></td><td></td><td></td></tr> ágar</tbody></table>

ensaio gravitaxis em larga escala de larvas de caenorhabditis dauer

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

A sensação da gravidade é um processo importante e relativamente subestudado. A percepção da gravidade permite que os animais naveguem em seus arredores e facilite o movimento. Além disso, a sensação gravitacional, que ocorre no ouvido interno dos mamíferos, está intimamente relacionada à audição - assim, entender esse processo tem implicações para pesquisas auditivas e vestibulares. Ensaios gravitaxis existem para alguns organismos modelo, incluindo drosophila. Worms únicos já foram avaliados por sua preferência de orientação à medida que se instalam em solução. No entanto, um ensaio confiável e robusto para caenorhabditis gravitaxis não foi descrito. O presente protocolo descreve um procedimento para a realização de ensaios gravitaxis que podem ser usados para testar centenas de dauers caenorhabditis de cada vez. Este ensaio de longa distância e em larga escala permite a coleta detalhada de dados, revelando fenótipos que podem ser perdidos em um ensaio padrão baseado em placas. O movimento de Dauer ao longo do eixo vertical é comparado com controles horizontais para garantir que o viés direcional seja devido à gravidade. A preferência gravitactic pode então ser comparada entre cepas ou condições experimentais. Este método pode determinar requisitos moleculares, celulares e ambientais para gravitaxis em vermes.

Comparando gravitaxis entre espécies Seguindo o procedimento descrito acima, C. briggsae dauer gravitaxis pode ser comparado com C. elegans gravitaxis e controles horizontais. A distribuição vertical (marrom) de dauers C. briggsae é inclinada em direção ao topo das câmaras, com uma grande porcentagem de vermes atingindo +7 (Figura 2A). Contrastada com controles horizontais (aqua), em que os dauers são distribuídos em uma curva em forma de sino a...

O presente protocolo descreve métodos para a realização de um ensaio gravitaxis em larga escala com larvas dauer Caenorhabditis . Este protocolo permite uma melhor detecção do comportamento gravitaxis em comparação com um ensaio baseado em placas.

Ensaio gravitaxis em larga escala de Larvas de Caenorhabditis Dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Este ensaio de alto rendimento pode ser usado para observar um comportamento gracástico robusto em larvas de caenorhabditis dauer. O comportamento do verme é observado em grandes distâncias em comparação com ensaios realizados em uma placa de petri. Isso aumenta a sensibilidade do ensaio e permite uma análise detalhada dos dados.Estudar o comportamento da gravitaxis pode fornecer uma visão de como a sensação da gravidade ocorre na caenorhabdite, que tem relevância para a compreensão do sistema vestibular de mamíferos. Criar as câmaras de ensaio gravitaxis, isolar os promotores e injetar os vermes nas câmaras requer prática. Você pode economizar tempo isolando os dauers e criando as câmaras com um dia de antecedência.Comece montando um queimador Bunsen, uma a duas lâminas de barbear, alicate, pinças e uma superfície de corte de plástico, e um capô de fumaça. Para fazer uma câmara, reúna duas pipetas sorológicas de 5 mililitros, e com pinças, retire o plugue de algodão de uma pipeta. Segure uma lâmina de barbear usando alicate sobre o queimador Bunsen até ficar quente.Use a lâmina aquecida para cortar a extremidade afilada da segunda pipeta para que toda a pipeta tenha um diâmetro un

large-scale-gravitaxis-assay-of-caenorhabditis-dauer-larvae

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

C. elegans O comportamento de postura de ovos pode fornecer informações importantes em estudos de desenvolvimento, reprodutivos e anatômicos. Este vídeo apresenta as etapas importantes de um ensaio de postura de ovos e mostra um experimento de amostra no qual um medicamento é testado quanto à toxicidade reprodutiva.

Ensaio de postura de ovos: um método para quantificar o comportamento de postura de C. elegans

Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica...

C. elegans Chemotaxis Assay

Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção...

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Descrevemos as etapas detalhadas de um ensaio químico de alto rendimento no nematóide Caenorhabditis elegans usado para avaliar a toxicidade da linha germinativa. Neste ensaio, a interrupção da função germinativa após a exposição química é monitorada usando um repórter fluorescente específico para embriões aneuploides.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Comportamento de imagem e atividade neural em longas escalas de tempo sem imobilização do animal é um pré-requisito para entender o comportamento. A imagem das câmaras microfluídicas de agarose (IAM) pode ser usada para obter imagens da atividade neural e do comportamento de todos os estágios da vida de Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Aqui detalhamos protocolos projetados especificamente para monitorar defeitos morfogênicos que ocorrem durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans. Em última análise, esses protocolos são projetados para identificar genes que regulam essas fases e caracterizar suas necessidades diferenciais ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Para usar caenorhabditis elegans (C. elegans) em pesquisas de omics, um método é necessário para gerar grandes populações de vermes onde uma única amostra pode ser medida entre plataformas para análises comparativas. Aqui, é apresentado um método para cultivar populações de C. elegans em placas de cultura em larga escala (LSCPs) e documentar o crescimento populacional.

Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

Caenorhabditis elegans servem como um excelente sistema de modelos com métodos robustos e de baixo custo para levantamento da vida saudável, vida útil e resiliência ao estresse.

Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans

Aprenda a realizar ensaios de gravitaxis em larga escala com larvas dauer de Caenorhabditis elegans. Este método de alta vazão melhora a detecção de comportamento gravitático e permite análises detalhadas de neurociência.

Ensaio gravitaxis em larga escala de Larvas de Caenorhabditis Dauer

Explorar mais vídeos