Name: Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a editar genes CRISPR/Cas9 em células-tronco hematopoiéticas para terapia gênica. Este protocolo otimizado preserva a pluripotência celular durante o cultivo ex vivo, aumentando a eficiência de enxertia in vivo.

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Os autores querem reconhecer a equipe da instalação de citometria de fluxo e da instalação animal da CSCR. A. C. é financiado por uma bolsa ICMR-SRAF, K. V. K. é financiado por uma bolsa DST-INSPIRE e P. B. é financiado por uma bolsa CSIR-JRF. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia (subvenção n.º BT/PR26901/MED/31/377/2017 e BT/PR31616/MED/31/408/2019)

<ol><li>Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+stem-cell-based+gene+therapy+for+inherited+disorders%3A+State+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+hematopoiesis%3A+Current+stage+of+clinical+translation+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958(2019).</li>
<li>Srivastava, A., Shaji, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cure+for+thalassemia+major+-+From+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy.</a> Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).</li>
<li>Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+developmental+gamma-globin+gene+expression%3A+An+approach+for+healing+hemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies.</a> Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253(2020).</li>
<li>Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivector-mediated+clonal+tracking+reveals+intrinsic+heterogeneity+in+the+human+hematopoietic+stem+cell+compartment+and+culture-induced+stem+cell+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment.</a> Blood. 103 (2), 545-552 (2004).</li>
<li>Piras, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+escape+innate+sensing+but+trigger+p53+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).</li>
<li>Christopher, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+human+CD34%2BCD133%2BCD90%2B+hematopoietic+stem+cells+enhances+gene-modified+cell+frequency+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).</li>
<li>Karuppusamy, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCR5+gene+edited+CD34%2B+CD90%2B+hematopoietic+stem+cell+population+serves+as+an+optimal+graft+source+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 792684(2022).</li>
<li>Hopman, R. K., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stem+cell+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in stem cell mobilization.</a> Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).</li>
<li>Hoffman, T. L. Counting Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffman%2C+TL+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).</li>
<li>Antoniani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+fetal+hemoglobin+synthesis+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+the+human+b-globin+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus.</a> Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).</li>
<li>Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+gene-editing+approaches+for+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12, 500(2021).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Bagchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+immortalized+erythroid+progenitor+cell+lines+from+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells.</a> Cells. 10 (3), 1-18 (2021).</li>
<li>Ravi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+HPFH-like+mutations+by+CRISPR+base+editing+that+elevates+the+expression+of+fetal+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin.</a> eLife. 11, 65421(2020).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
<li>Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+asphyxia+on+the+development+of+synaptic+junctions+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica+Japonica%3B+Overseas+Edition%22%5BJournal%5D)">Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice.</a> Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).</li>
<li>Audigé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+leukocyte+reconstitution+in+NSG+mice+transplanted+with+human+cord+blood+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells.</a> BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-receptors+as+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Fc-receptors as regulators of immunity.</a> Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

Os autores declaram que não existem interesses financeiros concorrentes.

O resultado bem-sucedido da terapia gênica com HSPC depende predominantemente da qualidade e quantidade de HSCs enxertáveis no enxerto. No entanto, as propriedades funcionais das HSCs são altamente afetadas durante a fase preparatória dos produtos de terapia gênica, inclusive pela cultura in vitro e toxicidade associada ao procedimento de manipulação gênica. Para superar essas limitações, identificamos condições ideais de cultura de HSPCs que retêm a caule de HSCs CD34+CD133+CD90+</sup...

A inacessibilidade a doadores pareados com antígeno leucocitário humano (HLA) em ambientes de transplante alogênico e o rápido desenvolvimento de ferramentas de engenharia genética altamente versáteis e seguras tornam o transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TCTH) uma estratégia de tratamento curativo para os hemodistúrbios hereditários 1,2. A terapia gênica autóloga com células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) envolve a coleta de HSPCs dos pacientes, manipulação genética, correção de mutações causadoras de doenças e transplante de HSPCs corrigidos por genes no paciente 3,4. No entanto, o resultado bem-sucedido da terapia gênica depende da qualidade do enxerto modificado por genes transplantáveis. As etapas de manipulação gênica e a cultura ex vivo de HSPCs afetam a qualidade do enxerto, diminuindo a frequência de células-tronco hematopoiéticas de longo prazo (LT-HSCs), necessitando da infusão de grandes doses de HSPCs manipulados por genes 2,5,6.
Várias moléculas pequenas, incluindo SR1 e UM171, estão sendo empregadas atualmente para expandir robustamente os HSPCs do sangue do cordão umbilical 7,8. Para HSPCs adultos, devido ao maior rendimento celular obtido na mobilização, não é necessária expansão robusta. No entanto, a retenção da haste de HSPCs isolados em cultura ex vivo é crucial para suas aplicações de terapia gênica. Portanto, uma abordagem com foco no enriquecimento cultural de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é desenvolvida utilizando uma combinação de pequenas moléculas: Resveratrol, UM729 e SR1 (RUS)7. As condições de cultura otimizadas do HSPC promovem o enriquecimento das HSCs, resultando no aumento da frequência de HSCs modificadas por genes in vivo, e reduzem a necessidade de manipulação gênica de grandes doses de HSPCs, facilitando abordagens de terapia gênica custo-efetivas8.
Aqui, um protocolo abrangente para a cultura de HSPCs é descrito, juntamente com a infusão e análise de células editadas por genes in vivo.

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&reg; X Unidade</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Kit X (16-well Nucleocuvette&trade; Tiras)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD13 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555394 <tr><td>Anti-humano CD19 PerCP</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 340421 <tr><td>Anti-humano CD3 PE-Cy7</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>557749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD90 APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561971 <tr><td>Anti-humano CD133/1&nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>Irradiador de Sangue-2000</td><td>&nbsp; BRIT (Departamento de Biotecnologia, Índia)</td> <td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células (placas de 6 poços tratadas com superfície delta)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife solutions</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60mg/10mL)</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it Recombinante Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo de centrífuga-15ml</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo de centrífuga-50ml</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Phosphate Buffered Saline- 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Kit de Seleção Positiva Humana CD34 II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>Ímã EasySep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de eletroforese</td><td>ORANGE INDIA</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>Citômetro de fluxo - ARIA III</td><td>BD BIOCIÊNCIA-</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo&nbsp;</td><td>BD BIOSCIENCE&</td><td>nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Flt3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel</td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>Reagente HighPrep DTR</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Bloco BD Fc Humano</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDM mídia</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada infravermelha</td><td>Seringa</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>insulina MURPHY 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>Cetamina</td><td>KETMIN 50-Carregamento</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>corante 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Restritor de camundongos</td> Espectrofotômetro de nano gota <td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td></td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células Neubauer</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2RGTM1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gamma; &menos;/&menos; KitW41/W41 (NBSGW)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços Nunc delta</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de poliestireno</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>P3 solução de nucleofecção de células primárias</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpeza de PCR</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Gaiola de torta de rato</td><td>FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>tubo de fundo redondo de poliestireno (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Whitehead Institute for Biomedical Research</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>Extração rápida&trade; Solução de Extração de DNA</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de análise ICE</td><td>SYNTHEGO</td><<td>a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA tampão solução (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>Fornecido com gRNA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>XILAXINA - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

edição de genes crispr/cas9 de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras para aplicações de terapia gênica

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição de genes altamente versátil e eficiente adotada amplamente para corrigir várias mutações genéticas. A viabilidade da manipulação gênica de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) in vitro torna os HSPCs uma célula-alvo ideal para a terapia gênica. No entanto, os HSPCs perdem moderadamente seu potencial de enxerto e repovoamento de multilinhagem em cultura ex vivo. No presente estudo, são descritas condições ideais de cultura que melhoram o enxerto de HSPC e geram um aumento do número de células geneticamente modificadas in vivo. O relatório atual exibe condições de cultura in vitro otimizadas, incluindo o tipo de meio de cultura, suplementação exclusiva de coquetéis de pequenas moléculas, concentração de citocinas, placas de cultura celular e densidade de cultura. Além disso, um procedimento otimizado de edição de genes do HSPC, juntamente com a validação dos eventos de edição de genes, são fornecidos. Para validação in vivo , a infusão de HSPCs editados por genes e a análise pós-enxerto em receptores de camundongos são exibidas. Os resultados demonstraram que o sistema de cultura aumentou a frequência de HSCs funcionais in vitro, resultando em enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

O presente estudo identifica condições ideais de cultura HSPC que facilitam a retenção de HSCs CD34+CD133+CD90+ em cultura ex vivo. Para demonstrar o enriquecimento cultural de HSCs, juntamente com a geração aprimorada de HSCs modificadas por genes, são fornecidos os procedimentos otimizados para isolamento de PBMNC, purificação de células CD34+, cultura, edição de genes, transplante, caracterização de enxerto e células modificadas por genes in vivo (<strong c...

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

A cultura ex vivo pode dificultar o potencial de repovoamento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras. Nosso protocolo preserva a caule durante a cultura e, assim, melhora a frequência de células modificadas por genes in vivo. A terapia genética com células-tronco hematopoiéticas está sendo empregada atualmente para doenças monogênicas e doenças infecciosas como o HIV.O protocolo de terapia gênica do HSPC depende fortemente da cultura ex vivo. Nosso protocolo deve ser compatível com qualquer procedimento que empregue cultura ex vivo. Demonstrando este protocolo estará Vigneshwaran Venkatesan, estudante de doutorado do meu laboratório.Após o isolamento dos HSPCs, cultivá-los em meios de cultura de células-tronco que contenham citocinas e pequenas moléculas Resveratrol, UM729 e StemRegenin1. Antes da edição do gene, ajuste o ThermoMixer a 37 graus Celsius para reconstituir o RNA guia e, em seguida, pré-aqueça o tampão TE a 37 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugar o frasco de sgRNA sintético quimicamente modificado a 11.000 vezes g durante 1 minuto a 4 graus Celsius e adicionar 15 microlitros de tampão TE ao frasco para injetáveis contendo 1,5 nanomolar de sgRNA liofilizado e misturar por rodopio suave para obter uma concentração final de 100 picomolares por microlitro.Incubar o frasco para injetáveis na BimMisturador com agitação mínima a 37 graus Celsius durante 30 a 40 segundos. Bata suavemente no frasco para injetáveis nas laterais e gire o frasco para injetáveis para recolher 15 microlitros de sgRNA. Faça alíquotas de 1 microlitro e armazene-as a menos 80 graus Celsius por até 1 ano.Para nucleofecção, pellet 2 vezes 10 para as 5ª células, centrifugando a 200 vezes g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Uma vez que o sobrenadante é descartado, ressuspenda o pellet em 20 microlitros do buffer. Misture suavemente a suspensão celular com o complexo RNP preparado evitando bolhas de ar.Agora, transfira a suspensão para a tira de nucleofeção comercial e eletroporate as células usando o 4D-Nucleofector selecionando o código de pulso DZ-100. Às células eletroporosas na tira de nucleofeção, adicione 100 microlitros de meio de cultura pré-incubado e deixe as células intactas por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, transfira o conteúdo para a placa de cultura de acordo com os requisitos experimentais.Coloque os camundongos NSG nas gaiolas de torta em 6 a 8 horas antes do transplante de HSPC. Irradie os ratos a 3,5 de cinza usando um irradiador comercialmente disponível. Para NBSGW, pré-condicionar camundongos machos e fêmeas de 6 a 8 semanas de idade injetando bussulfano por via intraperitoneal na dose de 12,5 miligramas por quilograma de peso corporal 48 horas antes do transplante de HSPC.Para a infusão de 1 rato, pellet 6 vezes 10 para as 5 células em um tubo de 1,5 mililitro por centrifugação a 200 vezes g por 5 minutos. à temperatura ambiente. Pipete suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de PBS.Coloque os ratos NSG ou NBSGW pré-condicionados na contenção do rato e infunda os HSPCs por injeção na veia da cauda. Segure a cauda do mouse e pressione suavemente o plugue para conter o mouse. Limpe suavemente a cauda do rato com etanol a 70%.Usando uma seringa de insulina de calibre 31, aspirar 100 microlitros da suspensão celular. Agora, direcione a luz da lâmpada infravermelha para a cauda por 30 a 40 segundos, cobrindo a área do corpo do mouse com dobras de papel de seda. Para manter a cauda no eixo da plaina com a seringa, levante-a com o dedo indicador esquerdo.Insira suavemente a parte chanfrada da agulha na veia caudal esquerda ou direita em um ângulo de 20 graus. Empurre o êmbolo para infundir a suspensão celular na veia e aplique uma pressão suave perto da região perfurada com papel de seda e retire a agulha. Após anestesiar, posicione o animal em decúbito ventral e scruff suavemente os ratos para abrir o olho, permitindo que o globo do olho se projete ligeiramente.Insira suavemente a pipeta de pastagem em um ângulo de 30 a 45 graus no canto medial do olho sob a membrana nictante. Depois de colocar a pipeta Pasteur na posição correta, aplique uma leve pressão no tubo e comece a girar o tubo suavemente. Depois de coletar 50 a 80 microlitros de sangue periférico, retire suavemente a pipeta do canto medial do olho.Após a eutanásia, faça uma incisão vertical 1 centímetro acima da uretra e estenda até 1 centímetro abaixo do diafragma. Corte horizontalmente nos cantos da área incisada para abrir a região abdominal. Depois de dissecar o fêmur e a tíbia, use uma tesoura para remover os tecidos moles ligados ao fêmur e à tíbia e esfregue suavemente os ossos com um papel de seda.Use um bisturi para fazer um pequeno orifício com um diâmetro não superior a 0,2 centímetros na parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Remova as extremidades proximais dos ossos usando um bisturi e coloque os ossos com o lado cortado voltado para o orifício do tubo de microcentrifugação de 0,5 mililitro. Agora, coloque o tubo de 0,5 mililitro com os ossos no tubo de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de PBS estéril.Feche a tampa, gire os tubos a 200 vezes g durante 3 minutos em condições estéreis à temperatura ambiente e descarte os tubos de 0,5 mililitros que contenham ossos com uma cavidade de medula vazia. Para o tubo de reação de 1,5 mililitro contendo medula óssea, adicione 1 mililitro de PBS, em seguida, usando uma pipeta de 1 mililitro, ressuspenda suavemente as células 10 vezes. Transfira 1 mililitro da suspensão celular para um tubo de 15 mililitros contendo 9 mililitros de tampão de lise RBC.Incubar as células no gelo por 7 minutos, invertendo suavemente o tubo a cada dois minutos. Após a incubação, centrifugar o tubo a 200 vezes g durante 5 minutos à temperatura ambiente e repetir a lavagem até se observar um pellet branco pálido claro. A frequência de células vivas e CD34-positivas, CD90-positivas aumentaram no grupo RUS após 48 horas de nucleofecção.Após 72 horas, a porcentagem e a frequência de indel aumentaram no grupo tratado com RUS, em comparação com o grupo tratado com DMSO, sugerindo um aumento na edição de genes. O número absoluto de células CD34-positivas, CD90-positivas e células nucleadas totais são significativamente maiores 48 horas após a edição. A análise por citometria de fluxo de células CD45-positivas humanas nos camundongos NSG mostrou aumento do enxerto nas condições de cultura.A análise da frequência de edição de genes nas células BM de camundongos mostrou aumento do enxerto de HSPCs editados por genes em condições de cultura suplementadas por RUS. Cultivar os HSPCs a uma confluência de 200.000 células por mL é crucial para melhorar as células-tronco funcionais. A amplificação das células estaminais do sangue do cordão umbilical e das células estaminais derivadas do iSPC são as novas áreas em que este protocolo está a ser testado.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra um ensaio para realizar a edição de genes em células T humanas usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Uma mistura de células T CD4+ e CD8+ primárias é combinada com um complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, visando genes específicos para nocaute. Após a eletroporação, o sgRNA guia Cas9 para a sequência de DNA alvo, criando cortes precisos. Esses cortes são então reparados pelo mecanismo de junção final não homólogo da célula, levando ao nocaute do gene.

Uma técnica CRISPR-Cas9 para edição de genes em células T

Gene alvo edição usando CRISPR/Cas9 facilitou muito a compreensão das funções biológicas dos genes. Aqui, nós utilizamos a metodologia CRISPR/Cas9 a mutações de calreticulin modelo em células hematopoiéticas dependentes de citocina para estudar sua atividade oncogênica.

Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

É apresentado aqui um protocolo para a edição eficiente do gene de CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-negociado em pilhas de mamíferos usando o electroporation do tubo.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Aqui, apresentamos um protocolo para editar geneticamente as células CAR-T através de um sistema CRISPR/Cas9.

Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Novas estratégias para modelar fielmente mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) são necessárias para melhor estudar a biologia das células-tronco hematopoiéticas e as neoplasias hematológicas. Aqui, um protocolo para modelar mutações heterozigotas de ganho de função em HSPCs combinando o uso de CRISPR/Cas9 e transdução dupla de doador de rAAV é descrito.

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

A linhagem celular THP-1 é amplamente utilizada como modelo para investigar as funções de monócitos/macrófagos humanos em várias áreas de pesquisa relacionadas à biologia. Este artigo descreve um protocolo para engenharia eficiente baseada em CRISPR-Cas9 e isolamento de clone de célula única, permitindo a produção de dados fenotípicos robustos e reprodutíveis.

Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

Aqui, apresentamos um protocolo que integra a tecnologia CRISPR/Cas9 com o ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para identificar genes candidatos que são cruciais para a capacidade proliferativa anormal de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras.

Avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia CRISPR/Cas9 com contagem de células

Aprenda a editar genes CRISPR/Cas9 em células-tronco hematopoiéticas para terapia gênica. Este protocolo otimizado preserva a pluripotência celular durante o cultivo ex vivo, aumentando a eficiência de enxertia in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

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