Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Este método descreve a captação cirúrgica de três retalhos suínos vascularizados e sua subsequente descelularização perfusional. Este método pode auxiliar os esforços para regenerar retalhos suínos usando uma abordagem de descelularização e recelularização tecidual. A principal vantagem desta técnica é a sua versatilidade para alcançar a descelularização da profusão através de uma variedade de retalhos suínos vascularizados em uma configuração de biorreator simples de montar.

A técnica aqui descrita pode ser amplamente aplicada a outros retalhos vascularizados como uma potencial solução de engenharia tecidual utilizando retalhos suínos em cirurgia reconstrutiva. Para começar, faça uma tubulação de entrada e saída medindo aproximadamente 50 centímetros de tubulação de silicone revestida de platina LS16. Conecte uma extremidade a um tubo de bomba amarelo de 3 paradas e a outra a uma pipeta sorológica estéril de 2 mililitros para transportar o perfusato dos reservatórios de detergente para a câmara do biorreator.

Autoclave a câmara e os tubos em embalagens estéreis embaladas individualmente. Para a obtenção do retalho omental, coloque um porco Yorkshire anestesiado de 12 semanas de idade na posição supina e, em seguida, prepare o abdômen da maneira estéril usual. Realizar uma laparotomia xifo-umbilical para entrar no abdômen e mobilizar o estômago cefálico, e colocar o omento no campo operatório.

Começando pelo aspecto esquerdo da curvatura maior, onde a artéria gastroepiplóica esquerda se une à artéria esplênica, esqueletize a artéria e a veia gastroepiplóica esquerda usando tesouras de tenotomia de Stevens retas. Em seguida, ligue e divida ambos separadamente usando laços cirúrgicos ou clipes. Prossiga ao longo da maior curvatura do estômago da esquerda para a direita para ligar e dividir os ramos vasculares curtos que surgem do omento, suprindo a maior curvatura do estômago.

Continue a mobilização do omento maior até que a junção dos vasos gastroepiplóicos direitos e da artéria gastroduodenal seja encontrada. Em seguida, ligue e divida a artéria e a veia gastroepiplóica direita para liberar o retalho omental e permitir a canulação do retalho mais tarde. Para a obtenção do retalho tensor da fáscia lata, coloque o porco na posição de decúbito lateral.

Marque o limite do retalho interior da coluna ilíaca anterossuperior, ou ASIS, em direção à patela lateral, e um limite posterior de aproximadamente 8 a 10 centímetros caudalmente. Use um bisturi para fazer uma incisão afiada na margem distal na patela. Aprofunde a incisão através dos tecidos subcutâneos para alcançar a fáscia que recobre o reto femoral e continue as incisões em direção ao ASIS ao longo dos limites marcados.

Para isolar o retalho fascial sozinho, remova o componente da pele sobrejacente da camada subjacente da fáscia. Em seguida, ligue ou cauterize pequenos vasos perfuradores à pele. Retorne à borda distal do retalho e incite a fáscia profunda.

Mobilize a fáscia do músculo vasto lateral subjacente em direção ao ASIS. Depois de traçar o pedículo em direção aos vasos femorais profundos, esqueletizar a artéria e veia femoral circunflexa lateral que supre o retalho fascial. Em seguida, ligue e divida os vasos do retalho proximalmente, onde eles se juntam aos vasos femorais profundos e permitem a canulação posterior.

Para a obtenção do retalho radial do antebraço, marque um quadrado de 3 por 3 centímetros no aspecto radial de um antebraço de porco estendido. Desenhe uma linha entre o ponto médio da margem do retalho proximal e a fossa antecubital para denotar o curso aproximado do pedículo da artéria radial. Confirme o curso arterial com palpação.

Em seguida, incite a pele usando um bisturi no aspecto distal com uma profundidade até a fáscia antebraquial. Dissecar com tesoura de tenotomia até que a artéria radial distal e sua veia comitante sejam encontradas. Em seguida, ligue e divida a artéria e as veias com laços cirúrgicos ou clipes.

Continue as incisões cutâneas nas margens radial e ulnar do quadrado da pele marcado. Em seguida, mobilize o retalho do osso radial subjacente com uma lâmina cirúrgica ou cauterização, procedendo de uma direção ulnar para radial enquanto eleva o retalho cutâneo proximalmente em direção à fossa antecubital. Usando tesoura de tenotomia, esqueletizar a artéria radial e a veia comitante proximalmente na fossa antecubital, onde se unem à artéria braquial e às veias, respectivamente.

Dissecar os vasos dos tecidos fibro-gordurosos circundantes para isolar o pedículo vascular. Em seguida, ligue e divida a artéria e a veia separadamente para liberar o retalho radial do antebraço. Em seguida, canular os vasos pediculares com angiocateter de calibre 20 a 24 fixado com laços de seda 3-0.

Lavar soro fisiológico heparinizado na cânula arterial do retalho até que se observe um fluxo venoso claro. Ao trabalhar em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar, coloque abas na câmara de tecido do biorreator. Tubo de entrada primário com solução salina heparinizada estéril para remover o ar residual e organizar os retalhos para permitir a conexão entre a cânula arterial do retalho e o conector luer masculino.

Em seguida, use hemostatos estéreis para parafusar a cânula arterial no conector. Em seguida, lave a solução salina heparinizada através da torneira para verificar se a conexão luer está sem vazamentos e se os flops podem ser perfundidos com evidências de saída venosa. Depois de fechar a tampa da câmara de tecido, conecte a tubulação de entrada com uma tubulação de bomba amarela de 3 paradas à torneira de entrada da câmara de tecido.

Além disso, conecte um transdutor de sensor de pressão em linha à torneira de 3 vias de entrada para monitoramento da pressão de perfusão. Em seguida, ligue a bomba peristáltica de entrada e, na tela inicial, vá para a terceira guia usando a seta para definir o ID da tubulação para 1,85 milímetros. Em seguida, defina a taxa de perfusão a partir da segunda guia.

A taxa de entrada como o modo de entrega é definida como 2 mililitros por minuto. Verifique se a direção do fluxo está correta, conforme exibido na tela. Carregue a tubulação da bomba de 3 paradas na bomba peristáltica com um compatível.

Defina a configuração da bomba de saída para uma taxa de 4 mililitros por minuto. Conecte a tubulação de saída com uma tubulação de bomba amarela de 3 paradas à torneira de saída da câmara de tecido. Em seguida, carregue a tubulação da bomba de 3 paradas na bomba peristáltica e inicie o fluxo para ambas as bombas pressionando o botão liga/desliga em cada bomba.

Iniciar a descelularização perfusional dos retalhos com solução salina heparinizada na câmara tecidual por 15 minutos para remover quaisquer coágulos sanguíneos retidos. Após a conclusão, substitua a solução salina residual por 500 mililitros de dodecil sulfato de sódio, ou SDS, solução de descelularização para submergir o retalho. Em seguida, transfira a tubulação de entrada para a solução SDS e profuse o tecido.

Após a descelularização do SDS, aspirar o SDS restante antes de perfundir o retalho com PBS por um dia. Após a descelularização da perfusão SDS, perfundir sequencialmente os retalhos em solução de DNA por duas horas e, em seguida, em PBS por um dia, seguido de transferência da tubulação de entrada em ácido peracético e etanol em água destilada para esterilizar os retalhos por perfusão por três horas. Uma vez feito, remova os retalhos assepticamente e mergulhe-os em duas lavagens de PBS contendo 1% de antibióticos antimicóticos por 15 minutos cada.

Armazene as abas a 4 graus Celsius até que esteja pronto para a recelularização. Use uma ferramenta de biópsia por punção de 3 a 10 milímetros para obter amostras de tecido para avaliação de retalhos descelularizados. Os retalhos descelularizados isolados lavados sob controle manual demonstraram evidências de saída da cânula venosa de drenagem livre do omento, do tensor da fáscia lata e do retalho radial do antebraço.

A morfologia macroscópica do omento nativo, do tensor da fáscia lata e dos retalhos radiais do antebraço apareceu de cor rosa imediatamente após a aquisição. Em comparação, os tecidos descelularizados eram caracteristicamente brancos ou opacos na aparência. O exame histológico dos tecidos nativos com hematoxilina e eosina mostrou a presença de núcleos azuis.

Nos retalhos descelularizados, a coloração histológica revelou perda de material celular sem coloração nuclear azul, indicando um andaime tecidual acelular. A quantificação adicional do conteúdo de DNA mostrou uma diminuição significativa no DNA em andaimes acelulares em comparação com os tecidos nativos. A consideração mais importante é uma técnica cirúrgica utilizada durante a aquisição, tomando o cuidado de evitar danos ao pedículo do retalho, a fim de permitir a subsequente descelularização da perfusão.

Após a descelularização da perfusão, os retalhos resultantes podem ser recelularizados com populações celulares específicas do tecido, a fim de regenerar os compartimentos teciduais nativos.