Name: Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a descelularização de membros posteriores de rato usando perfusão ex vivo com SDS para reduzir imunogenicidade tecidual. Este método avança pesquisas em engenharia de tecidos vasculares compostos.

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A Figura 3A foi criada em BioRender.com.

Ratos Lewis machos cadavéricos (300-430 g) obtidos do Toronto General Hospital Research Institute foram utilizados para todos os experimentos. Para todos os procedimentos cirúrgicos, instrumentos e suprimentos estéreis foram utilizados para manter a técnica asséptica (ver Tabela de Materiais). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê de Cuidados com os Animais do Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Canadá). Um total de quatro membros posteriores foram descelularizados.
1. Preparação pré-cirúrgica
<ol><li>Preparar 50 mL de solução salina heparinizada a 5%. De um saco salino de 50 ml, retire 2,5 ml de solução salina utilizando uma seringa de 5 ml e elimine. Usando uma seringa de 5 mL, adicione 2,5 mL de heparina ao saco salino. Inverta o saco salino para misturar seu conteúdo.</li>
	<li>Coloque um rato cadavérico em decúbito dorsal sob uma almofada azul. Raspe o membro posterior e a área da virilha circunferencialmente usando um barbeador elétrico e remova os pelos.</li>
	<li>Traga o rato para a estação cirúrgica e aplique a solução de esfoliação de iodo Povidona usando uma gaze no membro posterior e na região da virilha. Posteriormente, aplique álcool isopropílico a 70% para limpar a solução de esfoliante usando gaze.</li>
	<li>Descarte a almofada azul da etapa 1.2 e mude para luvas novas e estéreis.</li>
</ol>2. Aquisição de membro posterior de rato
<ol><li>Faça uma incisão na pele usando uma lâmina cirúrgica #10 e um blade runner #3 ao longo do nível do ligamento inguinal, passando de uma direção lateral para uma medial (Figura 1A). Use pinça Adson para segurar a pele circundante para garantir uma incisão suave.</li>
	<li>Quando a gordura subjacente estiver exposta, use dissecção contundente para dissecar cuidadosamente a gordura. Localize os vasos epigástricos superiores.</li>
	<li>Use microtesouras para dissecar proximalmente e expor o nervo femoral subjacente, artéria e veia no nível do ligamento inguinal.</li>
	<li>Sob microscópio de dissecção, identificar os vasos femorais e dissecar a artéria e a veia proximalmente usando pinça fina para obter comprimento suficiente dos pontos de bifurcação da rede arterial (Figura 1B).</li>
	<li>Ligue a artéria e a veia femoral separadamente usando suturas 6-0.</li>
	<li>Realizar dissecção circunferencial em torno do restante do membro posterior sem interromper os vasos femorais ligados.</li>
	<li>Transecto do osso femoral de comprimento médio usando um cortador ósseo.</li>
	<li>Para isolar totalmente o membro posterior, transectar os vasos femorais ligados abaixo das ligaduras usando microtesouras.</li>
	<li>Cânular a artéria femoral usando um angiocateter 24 G sob o microscópio de dissecção. Use pinças finas para inserir a cânula com cuidado. Lavar com solução salina heparinizada até que se observe uma saída clara da veia femoral.</li>
	<li>Fixe a cânula amarrando uma sutura ao redor do vaso canulado e outra sutura distalmente ao redor da própria cânula. Certifique-se de que a cânula seja colocada proximalmente para evitar o bloqueio dos pontos de bifurcação.</li>
	<li>Submergir os membros posteriores adquiridos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) até a descelularização.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig01.jpg"> Figura 1: Aquisição do membro posterior do rato. (A) Marcação da incisão cutânea ao nível do ligamento inguinal de lateral a medial. (B) Vista da veia femoral e da artéria femoral, que foram dissecadas proximalmente em direção ao ligamento inguinal, indicadas pela linha pontilhada. Abreviaturas: L = lateral; M = medial; FV = veia femoral; AF = artéria femoral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Preparação de soluções
<ol><li>Num balão de vidro de 6 L, preparar um reservatório detergente de 5 L de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,25%, dissolvendo 12,5 g de pó SDS em 5 L de água destilada ultrapura. Cobrir a abertura do balão com parafilme para o selar.</li>
	<li>Em um frasco de vidro de 1 L, prepare 1 L de solução de SDS a 0,25% separadamente, dissolvendo 2,5 g de SDS em 1 L de água destilada ultrapura. Adicione uma barra de agitação para misturar a solução num agitador magnético até que todo o SDS esteja dissolvido.</li>
	<li>Prepare 1 L de solução de lavagem PBS a 1x com solução antibiótico-antimicótica (AA) a 1%. Num balão de 1 L, adicionar 990 ml de 1x solução de PBS e 10 ml de AA.</li>
	<li>Separadamente, em um frasco de vidro de 500 mL, prepare 1x PBS + solução AA a 1% novamente usando 495 mL de solução 1x PBS e 5 mL de AA.</li>
	<li>Preparar 200 mL de solução a 1% de ácido peracético (PAA)/etanol a 4% (EtOH). Prepare esta solução sob um exaustor.</li>
</ol>4. Construção de biorreator e circuito de perfusão
NOTA: Consulte a Figura 2 para a configuração do biorreator e do circuito de perfusão ao longo das etapas listadas.
<ol><li>Em uma câmara de 500 mL (recipiente de plástico), faça três furos (1/4 pol) nos locais rotulados na Figura 2: A porta A é a linha de entrada, a porta B é a linha de reabastecimento e a porta C é a linha de saída. Remova e descarte o excesso de plástico. Pulverize e limpe a câmara com etanol a 70%.</li>
	<li>Corte três tubos de silicone de 5 cm de comprimento e insira um a meio caminho em cada porta da câmara. Conecte um conector Luer macho na abertura da porta A voltada para o interior da câmara e um conector Luer fêmea na outra extremidade do tubo fora da câmara.</li>
	<li>Conecte um conector Luer fêmea na Porta B e na Porta C nas extremidades dos tubos voltados para fora da câmara.</li>
	<li>Em uma tampa hermética para o recipiente de plástico, faça um furo na superfície da tampa.</li>
	<li>Corte um tubo de silicone de 3 cm e insira-o no orifício da tampa. Certifique-se de que aproximadamente 2 cm do tubo estejam localizados fora da tampa, como mostra a Figura 2.</li>
	<li>Esterilize a câmara e a tampa com a tubulação.</li>
	<li>Corte dois tubos de silicone de 30 cm usando uma tesoura. Conecte um conector de 1/16 a um conector de 1/8 de polegada em uma extremidade de cada tubo.</li>
	<li>Separadamente, corte dois tubos de silicone de 12 cm usando uma tesoura. Conecte um conector de 1/16 a um conector de 1/8 de polegada em uma extremidade de ambos os tubos. Conecte um conector Luer macho na outra extremidade de um tubo e um conector Luer fêmea ao outro tubo.</li>
	<li>Esterilize todo o material da tubulação a partir das etapas 4.7 e 4.8. Inclua duas tubulações de bomba de 3 paradas (1,85 mm) na esterilização.</li>
	<li>Prepare três torneiras de 3 vias, um filtro de seringa, duas pipetas sorológicas de 1 mL e uma seringa de 10 mL para a configuração de descelularização. Remova o filtro das pipetas sorológicas de 1 mL.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig02.jpg"> Figura 2: Preparação do biorreator e construção do circuito de perfusão. Aparelhos indicados do circuito de perfusão, incluindo (A) bomba peristáltica e (B) correspondentes para as linhas de entrada e de saída. (C, D) Tubos de silicone de 12 cm e 30 cm também são mostrados com os respectivos conectores. (E) Tubulação para bomba peristáltica (1,85 mm). Câmara de biorreator com portas rotuladas para (F) entrada, (G) porta de reabastecimento e (H) saída. (I) Tampa do biorreator mostrada com porta de ventilação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
5. Descelularização dos membros posteriores de ratos
<ol><li>Coloque a câmara esterilizada e parafuse em três torneiras de 3 vias de uso único nas linhas de entrada, saída e reabastecimento. Certifique-se de que a torneira da porta de reabastecimento esteja tampada em suas duas portas restantes para evitar vazamentos.</li>
	<li>Fixar os tubos fabricados no passo 4.8 às torneiras nas linhas de entrada e saída.</li>
	<li>Conecte a tubulação peristáltica aos tubos na etapa acima. Prenda o na tubulação peristáltica e coloque-o na bomba peristáltica. Não prenda as com tubos no lugar ainda.</li>
	<li>Conecte um tubo da etapa 4.7 até o final da tubulação peristáltica da linha de saída a partir da etapa acima. Conecte uma pipeta sorológica de 1 mL na outra extremidade. Suspender a extremidade fixada com uma pipeta serológica no balão do reservatório de resíduos.</li>
	<li>Repita a etapa 4.7 para a linha de entrada. Suspender a extremidade do tubo ligado à pipeta serológica no reservatório de detergente. Selar imediatamente a abertura do balão reservatório de detergente com parafilme. Consulte a Figura 3A,B para obter uma visão geral do circuito de descelularização.</li>
	<li>Adicionar 0,25% de SDS do frasco de vidro de 1 L (passo 3.2) à câmara do biorreactor a meio nível.</li>
	<li>Pegue o membro posterior adquirido usando a pinça de Adson e suspenda-o na câmara do biorreator com cuidado.</li>
	<li>Use dois pares de pinças de Adson para guiar a porção canulada do membro posterior até a linha de entrada. Ao segurar a cânula com um par de pinças, use o outro par de pinças para torcer e fixar a linha de entrada à cânula. Certifique-se de que a cânula não esteja puxada ou torcida para evitar a decanulação.</li>
	<li>Uma vez fixado, adicione mais 0,25% de SDS do frasco de vidro de 1 L para submergir totalmente o membro, conforme necessário. Certifique-se de que a porta de saída também esteja submersa no reservatório do biorreator para garantir que o fluxo de saída consistente seja mantido (Figura 3C).</li>
	<li>Fixar um filtro de seringa de utilização única à porta de ventilação na tampa da câmara do biorreactor, referindo-se às etapas 4.4 e 4.5.</li>
	<li>Prenda a tampa do biorreator e assegure-se de que a câmara esteja selada de todos os lados (Figura 3B).</li>
	<li>Para remover o ar da tubulação e preparar o circuito de perfusão, use uma seringa nova de 10 mL de uso único para extrair detergente do reservatório de detergente usando a torneira de 3 vias na linha de entrada.</li>
	<li>Uma vez desenhado, use o mesmo fluido para inserir na torneira de 3 vias na linha de saída. Certifique-se de que há detergente presente em toda a tubulação nas linhas de entrada e saída.</li>
	<li>Pressione para baixo e prenda as com a tubulação na bomba peristáltica. Ligue a bomba peristáltica usando o botão liga/desliga.<ol><li>Na tela da bomba peristáltica, prossiga para a segunda guia usando a tecla de seta para definir a taxa de perfusão para o primeiro canal. Taxa de fluxo de entrada como o modo de entrega e definir a taxa de perfusão em 1 mL/min. Certifique-se de que a direção do fluxo está correta de acordo com a configuração do aparelho. Repita para o segundo canal.</li>
		<li>Calibre a bomba peristáltica para garantir que a quantidade de fluido entregue através da linha de entrada e/ou retirada da linha de saída esteja fluindo a uma taxa consistente entre as duas. Certifique-se de que o ID da tubulação esteja definido como 1,85 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Inicie a descelularização via perfusão da máquina a 1 mL/min para as linhas de entrada e saída pressionando o botão liga/desliga no teclado. Monitore e garanta que o fluxo seja consistente e contínuo nas linhas de entrada e saída.</li>
	<li>Continue a descelularização e monitore diariamente. Use o 1 L de 0,25% SDS (etapa 3.2) para reabastecer o reservatório do biorreator através da porta de reabastecimento, conforme necessário. Procure uma aparência branca e translúcida do tecido, que aparecerá no dia 5, indicando descelularização dos membros posteriores do rato.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig03.jpg"> Figura 3: Visão geral do circuito do biorreator de descelularização da perfusão do membro posterior do rato. (A) Representação esquemática do circuito de perfusão do biorreator. As setas azuis indicam a direção do fluxo de detergente e resíduos. (B) Visão geral do circuito de descelularização com biorreator contendo membro posterior de rato. O reservatório SDS (balão esquerdo) conduz à bomba peristáltica e à tubulação de entrada do biorreator. A saída é ligada ao reservatório de resíduos (balão direito) através da bomba peristáltica. (C) (I) Biorreator contendo membro posterior de rato com tubo de entrada conectado à artéria femoral canulada. (II) Porto de reabastecimento localizado no canto para perfusão de detergente. (III) Tubulação de saída suspensa em reservatório de suspensão. Abreviatura: SDS = dodecil sulfato de sódio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
6. Lavagem e esterilização pós-descelularização
<ol><li>Após a confirmação da descelularização, substitua o reservatório de detergente pelo reservatório de 1x PBS + 1% AA. Selar a abertura do balão com parafilme. Comece 1x PBS + 1% de perfusão AA a 1 mL/min e continue por 2 dias.</li>
	<li>Substitua o reservatório 1x PBS + AA a 1% por 200 mL de PAA a 0,1%/reservatório de EtOH a 4% e inicie a perfusão a 1 mL/min por 2 h.</li>
	<li>Desconecte o membro posterior da linha de entrada usando dois pares de pinças Adson estéreis, com um par de pinças para torcer a linha de entrada e o outro segurando a cânula. Certifique-se de que a cânula não seja puxada para evitar a decanulação.</li>
	<li>Conservar o membro num frasco de vidro de 500 ml contendo 1x PBS + 1% AA a 4 °C até nova utilização.</li>
</ol>

<ol><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allotransplantation%3A+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+a+human+face+graft%3A+The+matrix+of+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skin%2Fadipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li>
<li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).</li>
<li>Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+rat+hind+limb+transplant+as+an+experimental+model+of+vascularized+composite+allotransplantation%3A+Approaches+and+advantages%5BTitle%5D)+AND+%22SAGE+Open+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages.</a> SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871(2020).</li>
<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+and+disinfection+methods+for+decellularized+matrix+materials%3A+Review%2C+consideration+and+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal.</a> Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).</li>
<li>Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+decellularized+liver+scaffolds+and+recellularized+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts.</a> Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).</li>
<li>Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+generation+of+bioreactors+that+advance+extracellular+matrix+modelling+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering.</a> Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).</li>
<li>Cohen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+chimerism+within+donor+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular chimerism within donor organs.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13437(2021).</li>
<li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularised+skeletal+muscles+allow+functional+muscle+regeneration+by+promoting+host+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8398(2018).</li>
<li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+composite+tissue+as+a+bioartificial+limb+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft.</a> Biomaterials. 61, 246-256 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Membros posteriores de ratos são úteis como modelos experimentais na VCA5. A engenharia tecidual de andaimes acelulares representa o primeiro passo para abordar as deficiências dos regimes de imunossupressão a longo prazo associados à VCA. O uso de enxertos compostos representa um desafio adicional, dada a presença de múltiplos tecidos, cada um com propriedades funcionais, imunogênicas e estruturais únicas. O presente protocolo mostra um método bem-sucedido para a obtenção de membros posteriores d...

A VCA é uma opção emergente para pacientes que necessitam de reconstrução cirúrgica complexa. Lesões traumáticas ou ressecções tumorais resultam em perda volumétrica de tecido que pode ser difícil de reconstruir. A VCA oferece o transplante de múltiplos tecidos, como pele, osso, músculo, nervos e vasos, como um enxerto composto de um doador para um receptor1. Apesar de sua natureza promissora, a VCA é limitada devido a regimes imunossupressores de longo prazo. O uso ao longo da vida dessas drogas resulta em aumento do risco de infecções oportunistas, neoplasias malignas e toxicidade de órgãos-alvo 1,2,3. Para ajudar a reduzir e/ou eliminar a necessidade de imunossupressão, os andaimes de engenharia de tecidos usando abordagens de descelularização para VCA mostram grande promessa.
A descelularização tecidual implica a retenção da estrutura da matriz extracelular enquanto remove o conteúdo celular e nuclear. Este andaime descelularizado pode ser repovoado com células específicas do paciente4. No entanto, preservar a rede de ECM de tecidos compostos é um desafio adicional. Isto é devido à presença de vários tipos de tecido com diferentes densidades de tecido, arquiteturas e locais anatômicos dentro de um andaime. O presente protocolo oferece uma técnica cirúrgica e um método de descelularização para um membro posterior de rato. Este é um modelo de prova de conceito para aplicar esta técnica de engenharia de tecidos a tecidos compósitos. Isso também pode levar a esforços subsequentes para regenerar tecidos compostos através da recelularização.

<table><tbody><tr><td>Injeção de cloreto de sódio a 0,9% USP 50 mL</td><td>Baxter Corporation</td><td>JB1308M</td><td></td></tr><tr><td>1 mL de pipetas sorológicas descartáveis</td><td>VWR</td><td>75816-102</td><td></td></tr><tr><td>Seringas</td><td></td><td></td> descartáveis de 10 cc <td>obtidas da instituição de pesquisa</td></tr><tr><td>Torneira</td><td></td><td></td> de 3 vias <td>obtida da instituição de pesquisa</td></tr><tr><td>Seringas</td><td></td><td></td> <td>descartáveis de 5 ccObtido da Instituição de Pesquisa</td></tr><tr>Álcool <td></td><td></td><td>Isopropílico 70%</td><td>Obtido da Instituição de Pesquisa</td></tr><tr><td>Filtro de Seringa Acrodisc 0.2 &micro; m</td><td>VWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>Adson Fórceps, Reta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Angiocateter 24 G 19 mm (&frac34; &rdquo;)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>38112</td><td></td></tr><tr><td>Solução Antimítica Antimistótica (100x) Cortador de</td> Ossos <td>Multicelular</td><td>450-115-EL</td><td></td>de 100 mL</tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Conectores para&nbsp; Tubos de 1/16" a 1/8"</td><td>McMasterCarr</td><td>5117K52</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador Luer para farpado fêmea (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K328</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina com Pontas Micro-Cegas</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de Heparina Sódica 10.000 UI/10 mL</td><td>LEO Pharma Inc.</td><td>006174-09</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador Luer macho para farpado (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K322</td><td></td></tr><tr><td>Micro Needle Holder</td><td>WLorenz</td><td>04-4125</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WLorenz</td><td>SP-4506</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Peracético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>269336-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica, 3-Channel</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-78001-68</td><td></td></tr> Solução de <tr><td>Esfoliação</td><td></td><td></td> Cirúrgica de Povidona Wisent 311-425-CL <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Tamponada 1x 500 mL</td><td></td></tr> Obtida da Instituição de Pesquisa <tr><td>Tubulação da Bomba, 3 Pontos, Tygon E-LFL</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação da Bomba, Silicone Curado com Platina</td> Lâmina de Bisturi <td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>- #10</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Bisturi - #3&nbsp;</td><td>Reagente de</td> Dodecil Sulfato de Sódio Fine Science Tools <td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Grau: Pureza: >99%, 1 kg</td><td>Bioshop</td><td>SDS003.1</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Cirúrgica #6-0</td><td>Covidien</td><td>VS889</td><td></td></tr></tbody></table>

captação e descelularização de membros posteriores de rato usando biorreator ex vivo à base de perfusão para alotransplante composto vascularizado

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Pacientes com lesões traumáticas graves e perda tecidual requerem reconstrução cirúrgica complexa. O alotransplante composto vascularizado (VCA) é uma via reconstrutiva em evolução para a transferência de múltiplos tecidos como uma subunidade composta. Apesar da natureza promissora da VCA, as necessidades imunossupressoras a longo prazo são uma limitação significativa devido ao aumento do risco de malignidades, toxicidade de órgãos-alvo e infecções oportunistas. A engenharia tecidual de andaimes compostos acelulares é uma alternativa potencial na redução da necessidade de imunossupressão. Neste documento, descreve-se a aquisição de um membro posterior de um rato e sua subsequente descelularização usando dodecil sulfato de sódio (SDS). A estratégia de aquisição apresentada baseia-se na artéria femoral comum. Um sistema de biorreator baseado em perfusão mecânica foi construído e utilizado para descelularização ex vivo do membro posterior. A descelularização perfusional bem-sucedida foi realizada, resultando em uma aparência branca translúcida do membro posterior. Observou-se uma rede vascular intacta, perfusável, em todo o membro posterior. As análises histológicas mostraram a remoção do conteúdo nuclear e a preservação da arquitetura tecidual em todos os compartimentos teciduais.

O protocolo de aquisição foi bem sucedido em isolar e canular as artérias femorais comuns para as etapas subsequentes de perfusão. As imagens de dissecção representativas da Figura 1A,B mostram a localização da incisão e a exposição dos vasos femorais com distância suficiente dos pontos de bifurcação. A Figura 2 mostra o aparelho necessário para a preparação do biorreator e do circuito de perfusão. O desfecho da descelularização foi determinado ...

Descrevemos a técnica cirúrgica e o processo de descelularização de membros posteriores compostos de ratos. A descelularização é realizada usando dodecil sulfato de sódio de baixa concentração através de um sistema de perfusão de máquina ex vivo.

Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Estabelecemos um modelo de pequenos animais para a descelularização de um membro. Isso é útil para facilitar a pesquisa de prova de conceito sobre a de e recelularização de tecidos compostos vascularizados. Os esquemas de imunossupressão são uma das principais limitações no alotransplante composto vascularizado.A imunogenicidade tecidual pode ser reduzida com descelularização. Para começar, faça uma incisão na pele usando uma lâmina cirúrgica número 10 ao longo do ligamento inguinal, movendo-se de uma direção lateral para uma medial, enquanto segura a pele circundante com pinça de Adson. Quando a gordura subjacente estiver exposta, use a dissecção contusa para dissecar cuidadosamente a gordura e localizar os vasos epigástricos superiores.Usando micro tesoura, disseque proximalmente e exponha o nervo femoral subjacente, artéria e veia no nível do ligamento inguinal. Sob um microscópio de dissecção, identifique os vasos femorais e disseque a artéria e a veia proximalmente usando pinça fina para obter comprimento suficiente dos pontos de bifurcação da rede arterial. Em seguida, ligue a veia e a artéria femoral separadamente usando suturas 6-0.Em seguida, realizar a dissecção circunfer

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Aqui nós descrevemos o rato ortotópico membro-hind procedimento de transplante, o que parece ser o padrão...

Transplante Limb-Hind ortotópico em ratos

Este vídeo descreve a preparação de um rim de rato descelularizado. O arcabouço vascular acelular obtido pode servir como uma plataforma promissora para a engenharia tecidual de enxertos de órgãos.

Preparação de rim de rato descelularizado: um procedimento para gerar andaime de órgão inteiro vascularizado acelular a partir de um rim de rato colhido

Vascularizado Composite Allotransplantations (VCA) tornaram-se uma realidade clínica. No entanto, a vasta aplicação clínica de VCA é limitada pela imunossupressão multi-droga crónica. Os autores apresentam um grande modelo animal confiável e reprodutível para traduzir estratégias inovadoras imunomoduladores que podem minimizar ou potencialmente eliminar a necessidade de imunossupressão em VCA.

Um modelo de transplante heterotópico Modificado Swine Hind Limb para Translational vascularizado Composite Alotransplante (VCA) Pesquisa

Este novo modelo de transplante de membro posterior ortotópico em ratos, aplicando uma técnica manguito não sutura para a anastomose super-microvascular, fornece uma ferramenta poderosa para in vivo pesquisa imunológica mecanicista relacionadas com alotransplante composta vascularizado (VCA).

Ortotópico Hind Limb Transplantation no mouse

O allograft composto vascularized oferece benefícios Life-alterando aos receptores da transplantação, mas as causas biológicas da rejeição da corrupção e do vasculopatia permanecem mal compreendidas. O modelo cirúrgico do roedor apresentado aqui apresenta um modelo de transplante reprodutível e clinicamente relevante, permitindo que os pesquisadores avaliem eventos de rejeição e potenciais estratégias terapêuticas para prevenir sua ocorrência.

Modelo Osteomyocutaneous Heterotopic modificado da aleta do Hindmembro no rato para a pesquisa de Allotransplante composta Vascularized translacional

Este protocolo apresenta um modelo robusto e reprodutível de alotransplante composto vascularizado (VCA) voltado para o estudo simultâneo de imunologia e recuperação funcional. O tempo investido em técnica meticulosa em um transplante ortotópico do membro traseiro da coxa direita com anastomoses vasculares costurados à mão e coaptation neural produz a capacidade de estudar a recuperação funcional.

Dando o próximo passo: um modelo de transplante ortotópico ortotópico de coaptation ortotópico para maximizar a recuperação funcional em ratos

Descrevemos um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico em ratos, implicando modificações nas estratégias atuais, que levam a uma abordagem cirúrgica simplificada. Além disso, descrevemos um novo modelo de rejeição pela injeção in-ear de células musculares cardíacas vitais, permitindo novas análises imunológicas de transplante em ratos.

Um modelo imunológico para transplante heterotópico de células cardíacas e cardíacas em ratos

Este protocolo introduz um método para desenvolver um andaime usando rins descelularizados. O protocolo inclui processos de descelularização e recelularização para confirmar a biodisponibilidade. A descelularização é realizada utilizando-se triton X-100 e sulfato de dodecyl de sódio.

Preparação de andaimes renais descelularizados em ratos

Este artigo apresenta um protocolo de transplante de retalho osteomyocutâneo heterotópico em ratos e seus resultados potenciais no acompanhamento a médio prazo.

Modelo de transplante de hindlimb heterotópico parcial em ratos

O protocolo descreve a captação cirúrgica e subsequente descelularização de retalhos suínos vascularizados pela perfusão de detergente dodecil sulfato de sódio através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado.

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Aprenda a descelularização de membros posteriores de rato usando perfusão ex vivo com SDS para reduzir imunogenicidade tecidual. Este método avança pesquisas em engenharia de tecidos vasculares compostos.

Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado (Vídeo) | JoVE Journal

Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado

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