Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado

Estabelecemos um modelo de pequenos animais para a descelularização de um membro. Isso é útil para facilitar a pesquisa de prova de conceito sobre a de e recelularização de tecidos compostos vascularizados. Os esquemas de imunossupressão são uma das principais limitações no alotransplante composto vascularizado.

A imunogenicidade tecidual pode ser reduzida com descelularização. Para começar, faça uma incisão na pele usando uma lâmina cirúrgica número 10 ao longo do ligamento inguinal, movendo-se de uma direção lateral para uma medial, enquanto segura a pele circundante com pinça de Adson. Quando a gordura subjacente estiver exposta, use a dissecção contusa para dissecar cuidadosamente a gordura e localizar os vasos epigástricos superiores.

Usando micro tesoura, disseque proximalmente e exponha o nervo femoral subjacente, artéria e veia no nível do ligamento inguinal. Sob um microscópio de dissecção, identifique os vasos femorais e disseque a artéria e a veia proximalmente usando pinça fina para obter comprimento suficiente dos pontos de bifurcação da rede arterial. Em seguida, ligue a veia e a artéria femoral separadamente usando suturas 6-0.

Em seguida, realizar a dissecção circunferencial ao redor do restante do membro posterior sem interromper os vasos femorais ligados e transeccionar o osso femoral de médio comprimento usando um cortador ósseo. Para isolar completamente o membro posterior, transectar os vasos femorais ligados distais às ligaduras usando microtesouras e canular a artéria femoral usando um angiocateter de calibre 24 sob o microscópio de dissecção. Em seguida, lave com soro fisiológico heparinizado até que se observe uma saída clara da veia femoral.

Fixe a cânula amarrando uma sutura ao redor do vaso canulado em outra sutura distalmente ao redor da própria cânula, garantindo que a cânula seja colocada proximalmente para evitar o bloqueio dos pontos de bifurcação. Posteriormente, submergir os membros posteriores adquiridos e o PBS até a descelularização. Para construir o biorreator, coloque a câmara esterilizada e parafuse em três torneiras de três vias de uso único nas linhas de entrada, saída e reabastecimento, garantindo que a torneira para a porta de reabastecimento seja tampada em suas duas portas restantes para evitar vazamentos.

Fixe os tubos de silicone previamente feitos às torneiras nas linhas de entrada e saída. Em seguida, conecte a tubulação peristáltica aos tubos de silicone. Depois de fixar o na tubulação peristáltica, coloque-o na bomba peristáltica.

Em seguida, conecte um dos tubos de silicone ao final do tubo peristáltico da linha de saída a partir do degrau acima. Na outra extremidade, ligue uma pipeta serológica de um mililitro e ressuspenda a extremidade fixada com uma pipeta serológica no balão do reservatório de resíduos. Em seguida, suspenda a extremidade do tubo ligado à pipeta serológica no reservatório de detergente e sele imediatamente a abertura do balão do reservatório de detergente com parafilme.

Adicione 0,25%SDS do frasco de vidro de um litro na câmara do biorreator no nível intermediário. Em seguida, pegue o membro traseiro adquirido usando o Adson Forceps e suspenda-o na câmara do biorreator com cuidado. Usando dois pares de pinça de Adson, guie a porção canulada do membro posterior até a linha de entrada enquanto segura a cânula com um par de pinças.

Use o outro par de pinças para torcer e fixar a linha de entrada à cânula. Uma vez fixado, adicione mais 0,25% SDS do frasco de vidro de um litro para submergir totalmente o membro, conforme necessário, garantindo que a porta de saída também esteja submersa no reservatório do biorreator e o fluxo de saída consistente seja mantido. Em seguida, prenda um filtro de seringa de uso único à porta de ventilação na tampa da câmara do biorreator e prenda a tampa do biorreator, garantindo que a câmara esteja selada de todos os lados.

Para remover o ar da tubulação e preparar o circuito de perfusão, use uma nova seringa de 10 mililitros de uso único para extrair detergente do reservatório de detergente usando uma torneira de três vias na linha de entrada. Uma vez desenhado, use o mesmo fluido para inserir na torneira de três vias na linha de saída. Em seguida, pressione para baixo e prenda as com a tubulação na bomba peristáltica.

Em seguida, ligue a bomba peristáltica usando o botão liga/desliga. Na tela da bomba peristáltica, prossiga para a segunda guia usando a tecla de seta para definir a taxa de perfusão para o primeiro canal com a taxa de fluxo de entrada como o modo de entrega e defina a taxa de perfusão em um mililitro por minuto, garantindo que a direção do fluxo esteja correta de acordo com a configuração do aparelho. Calibre a bomba peristáltica para garantir que a quantidade de fluido fornecida através da linha de entrada e/ou retirada da linha de saída flua consistentemente entre as duas, garantindo que o ID da tubulação seja ajustado para 1,85 milímetros.

Inicie a descelularização via perfusão da máquina a um mililitro por minuto para as linhas de entrada e saída pressionando o botão liga/desliga no teclado. Monitore e garanta que o fluxo esteja e em andamento nas linhas de entrada e saída. Usando 1 litro de 0,25% STS, reabasteça o reservatório do biorreator através da porta de reabastecimento, conforme necessário.

Em seguida, procure uma aparência branca translúcida do tecido, que aparecerá no quinto dia, indicando descelularização dos membros posteriores do rato. Após a confirmação da descelularização, substituir o reservatório de detergente pelo reservatório de PBS e 1% de antibiótico-antimicótico e selar a abertura do frasco com parafilme. Comece a perfusão PBS e 1%Antibiótico-Antimicótico a um mililitro por minuto e continue por dois dias.

Substitua o reservatório PBS e 1%Antibiótico-Antimicótico por 200 mililitros de ácido parasitário a 0,1%, reservatório de etanol a 4% e inicie a perfusão a um mililitro por minuto durante duas horas. Sob um gabinete de biossegurança, desconecte o membro posterior da linha de entrada usando dois pares de pinças de Adson estéreis com um par de pinças para torcer a linha de entrada e o outro segurando a cânula, garantindo que a cânula não seja puxada para evitar a decanulação. Armazene o membro em um frasco de vidro de 500 mililitros contendo PBS e 1% de antibiótico-antimicótico a 4 graus Celsius até uso posterior.

Tanto a artéria femoral descelularizada quanto a veia mostraram perda de conteúdo nuclear em todas as camadas e no tecido conjuntivo circundante, dada a falta de núcleos corados de azul presentes nos vasos nativos. A túnica íntima média e a adventícia da veia femoral e das artérias foram mantidas nos vasos descelularizados. O nervo femoral apresentou preservação da estrutura tecidual, incluindo o endoneurium.

O osso apresentou retenção estrutural global com perda de núcleos corados de osteócitos e das camadas circundantes do endósteo e do periósteo pós-descelularização. A pele apresentou perda de células da epiderme e derme. A derme apresentava fibras colágenas retidas semelhantes ao tecido cutâneo nativo.

Por fim, a visão transversal do músculo esquelético mostrou perda de núcleos de outra forma localizados nas periferias do endomísio. O conteúdo de miofibrilas permaneceu retido dentro dos respectivos fascículos pós-descelularização. A quantificação do DNA usando PicoGreen também foi realizada, onde o conteúdo de DNA foi significativamente reduzido nos vasos femorais, nervos, pele, músculo e osso.

Seguindo esse protocolo, o membro descelularizado pode ser caracterizado posteriormente. Isso envolve o exame da matriz extracelular usando métodos histológicos e bioquímicos e avaliando o vascular usando imagens. O caule descelularizado também pode ser recelularizado usando células específicas do tecido.