Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a

Huang long bing, abreviado como HLB. É uma doença cítrica devastadora em todo o mundo. Nos países mais produtores de citros, como a China e os EUA, o HLB é causado pela bactéria restrita ao floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abreviada como CLas.

A detecção precoce de CLas foi importante para os produtores, facilitando a intervenção precoce e prevenindo a propagação da doença. Então, aqui desenvolvemos um novo método para o diagnóstico rápido e portátil de HLB, combinando com a amplificação da recombinase polimerase e o sistema CRISPR-Cas12a. Nós o chamamos de CLas-DETECTR.

A sensibilidade da nossa plataforma é muito maior do que a PCR. Além disso, apresenta resultado semelhante com qPCR quando as amostras foliares foram utilizadas. Comparando com as detecções CLas convencionais, nosso método pode ser concluído em 90 minutos e funciona em uma condição isotérmica.

O resultado também pode ser visualizado através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente no campo. O CLas-DETECTR contém quatro etapas: preparação da solução, isolamento do DNA total dos citros, amplificação isotérmica do DNA e os resultados da visualização. O esquema do ensaio CLas-DETECTR é ilustrado aqui.

O buffer A, a solução B e a solução C são preparados conforme descrito no protocolo. Para economizar tempo e tornar este método adequado para a detecção de CLas de campo, a abordagem à base de polietilenoglicol E.coli foi usada para obter extratos brutos de plantas para amplificação de DNA. As folhas cítricas são usadas na ferramenta.

Soque os poucos pedaços de discos de folha de folha. Coloque os discos de folha em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão A no tubo.

Moer os discos foliares até ficarem lisos com uma haste de plástico manualmente. Deixe o tubo intacto por 10 minutos. O sobrenadante é subsequentemente aplicado à amplificação do DNA.

Para amplificação isotérmica do DNA, adicione um microlitro de sobrenadante da etapa 2.3 e um microlitro de acetato de magnésio na Solução B e misture bem. No laboratório, incube-os em uma incubadora simples a 37 graus por 15 minutos. Para visualizar os resultados, adicione 10 microlitros da mistura da etapa 3.2 na Solução C e misture bem.

Incube-os na incubadora de 37 graus por 60 minutos. Use um óculos e observe o sinal de fluorescência verde através de um dispositivo de detecção fluorescente portátil. Para testar a especificidade do CLas-DETECTR, primeiras colônias puras de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.

citri que é o patógeno do cancro cítrico e Burkholderia stabilis cepa 1440 isolada em nosso laboratório foram utilizados para extrair seu DNA genômico. Em seguida, este DNA genômico de três bactérias e o DNA genômico de folhas de Newhall CLas positivo foram submetidos ao teste CLas-DETECTR. Para testar a sensibilidade do CLas-DETECTR, uma série de diluições de fragmentos de DNA de CLas foram detectadas usando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, conforme descrito no protocolo Após o teste de especificidade e sensibilidade, o método CLas-DETECTR foi usado para detectar a presença do CLas em campo.

Amostras de folhas coletadas da laranjeira doce Newhall cultivada no viveiro de recursos de germoplasma no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. qPCR, um método convincente de detecção de CLas geralmente usado no laboratório também foi aplicado. As amostras foliares da árvore de Newhall infectada e não infectada pelo HLB, nas quais a presença do CLas foi confirmada em nosso laboratório, foram submetidas ao teste CLas-DETECTR.

O sinal de fluorescência verde foi capturado na amostra infectada pelo HLB, mas não no controle negativo e não infectado pelo HLB. Determinamos a especificidade do CLas-DETECTR utilizando ácidos nucleicos extraídos de outras bactérias. No ensaio CLas-DETECTR, apenas o gDNA extraído de folhas de Newhall CLas-positivas demonstrou sinais fluorescentes verdes.

gDNA extraído de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri e Burkholderia stabilis cepa 1440 não, o que significa que o CLas-DETECTR pode detectar CLas especificamente. Também testamos a sensibilidade do CLas-DETECTR usando uma série de diluições de DNA CLas, listadas no protocolo.

PCR pode detectar 201 cópias por megalitro. Por outro lado, o CLas-DETECTR pode detectar 2,01 cópias por megalitro, sugerindo sua disponibilidade como um diagnóstico de campo sensível. qPCR pode detectar 0,201 cópias por megalitro e o valor de Ct é superior a 36.

Assim, o CLas-DETECTR é duas ordens de magnitude mais sensível que a PCR tradicional e uma ordem de magnitude menos sensível que a qPCR quando foram utilizados amplificadores específicos de CLas diluídos. Finalmente, reexaminou a viabilidade do CLas-DETECTR para amostras de campo e comparou sua sensibilidade com a qPCR. Em números, vemos.

Podemos ver que o valor de Ct é superior a 36 quando a concentração de CLas é inferior a 0,2 cópias por megalitro, o que é uma concentração muito baixa. Dentre as 15 amostras, o valor de Ct das amostras 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 e 14 detectadas por qPCR foi inferior a 36. Observou-se um sinal de fluorescência verde aparente.

Por outro lado, quando o valor de Ct das amostras 6, 7, 9, 12 e 15 detectado por qPCR foi indeterminado, não foram observados sinais fluorescentes verdes. Além disso, sinais fluorescentes verdes fracos foram observados quando o valor da TC das amostras 5 e 11 detectado pela qPCR foi superior a 36. Os resultados sugerirão que nossa plataforma é uma ferramenta rápida, robusta e sensível para o diagnóstico de HLB no campo.