Name: Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Aprenda a expressão transgênica viral em corações de roedores usando injeção intramiocárdica guiada por ultrassom. Este método minimamente invasivo permite avaliar a suscetibilidade a arritmias cardíacas em modelos animais.

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Este trabalho foi apoiado pelos Subsídios de Projeto do Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (PJT-148918 e PJT-180533, para WL), o CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, para WL), a Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) McDonald Scholarship and New Investigator Award (S-17-LI-0866, para WL), Student Scholarships (para JW e YX) e uma bolsa de pós-doutorado (para AL) da University of Ottawa Cardiac Endowment Funds no Heart Institute. Os autores agradecem ao Sr. Richard Seymour por seu apoio técnico. A Figura 2 foi criada com Biorender.com com licenças aprovadas.

Todos os métodos e procedimentos descritos foram aprovados pelo conselho de revisão ética de pesquisa animal da Universidade de Ottawa e pelo comitê de revisão de biossegurança do Instituto do Coração da Universidade de Ottawa. Os protocolos de segurança desenvolvidos incluem que todos os procedimentos que lidam com adenovírus recombinante ou vírus adenoassociado (AAV) foram realizados em um gabinete de biossegurança de nível II. Todos os itens em contato com o vírus foram completamente descontaminados após o experimento. Para o presente estudo, foram utilizados camundongos Ctnnb1 flox/flox e αMHC-MerCreMer (8-12 semanas de idade, de ambos os sexos) e ratos Sprague-Dawley (200-250g, macho). Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Todos os procedimentos relativos aos animais foram realizados por pessoal treinado e aprovado por comités institucionais de regulamentação. Foram utilizados equipamentos de proteção individual adequados durante todos os procedimentos.
1. Expressão transgênica viral em tecidos ventriculares de roedores
NOTA: Armazenar adenovírus recombinante ou AAV que expresse o gene alvo e o vírus de controle correspondente, como Ad-GFP (título de 1 x 10 10 PFU/mL) ou AAV9-GFP (título de 1 x 1013 GC/mL) (ver Tabela de Materiais), em um freezer de -80 °C.
<ol><li>No dia da injeção do vírus, descongele o vírus no gelo. Aspirar o vírus que expressa o gene alvo e o vírus de controlo em duas seringas separadas (volume = 50 μL) com 30 G 1/2 agulhas e manter no gelo até à sua utilização. NOTA: Quaisquer bolhas na seringa e na agulha devem ser cuidadosamente removidas.</li>
	<li>Administrar buprenorfina a ratos ou camundongos (0,05 mg/kg para ratos, 0,1 mg/kg para camundongos subcutâneos), 1 h depois induzir anestesia com isoflurano a 3% e manter o isoflurano a 2% (em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5-1,0 L/min) para o procedimento subsequente.</li>
	<li>Aperte suavemente o corpo do animal (por exemplo, a cauda) com um par de pinças e, se o animal não responder ao beliscão com nenhum movimento do corpo, a anestesia adequada é confirmada.</li>
	<li>Mantenha a temperatura corporal a 37 °C usando uma almofada de aquecimento elétrica. Raspe o cabelo na região do peito usando um cortador de cabelo. NOTA: Deve-se ter cuidado ao usar uma almofada de aquecimento elétrico devido à potencial distribuição de calor desigual.</li>
	<li>Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea.</li>
	<li>Mantenha o animal em decúbito dorsal e utilize um sistema de imagiologia pré-clínica (ver Tabela de Materiais) para a realização de imagens de ecografia do coração do animal na orientação de eixo curto. NOTA: As etapas a seguir são executadas em um gabinete de biossegurança de nível II que fornece um ambiente estéril. Procedimentos de segurança padrão, incluindo aqueles com manuseio seguro de agulhas, são empregados.</li>
	<li>Esterilizar a região inferior esquerda do tórax do animal com rodadas alternadas de um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool três vezes em um movimento circular.</li>
	<li>Sob orientação de imagem de ultrassom, insira a agulha 30 G 1/2 da seringa que contém o vírus, conforme preparado na etapa 1.1. no peito do animal através do lado inferior esquerdo do peito do corpo.</li>
	<li>Aproxime-se da ponta da agulha na parede livre frontal do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10-15 μL do vírus. Verifique se a injeção bem-sucedida em imagens de ultrassom pelo brilho aprimorado perto da ponta da agulha. NOTA: A quantidade de vírus injetada em cada local não é superior a 15 μL para evitar danos físicos aos tecidos miocárdicos.</li>
	<li>Retire a agulha do coração e insira-a em outras regiões do ventrículo esquerdo para uma segunda e terceira injeção da mesma quantidade de vírus. NOTA: O número total de locais de injeção é determinado pelo desenho experimental. Se for necessária expressão transgênica focal, apenas uma injeção é necessária; se for necessária uma expressão transgénica mais difusiva, são geralmente necessários múltiplos locais de injeção (três a cinco).</li>
	<li>Após a conclusão das injeções, devolva o animal à sua gaiola.</li>
	<li>Monitore cuidadosamente o animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e devolvê-lo à sua sala de alojamento.</li>
	<li>Administrar buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, duas vezes por dia para ratinhos, 0,05 mg/kg, duas vezes por dia para ratos, subcutâneo) ao animal durante os 2 dias seguintes. Devolva os animais ao biotério e monitore diariamente quaisquer sinais incomuns de dor ou angústia e, se encontrados, trate os animais de acordo com os protocolos do comitê institucional de cuidados com os animais.</li>
</ol>2. Avaliação da suscetibilidade à arritmia cardíaca
NOTA: Em 4-6 dias após a injeção de adenovírus e 1-2 semanas após a injeção de AAV, avalie a suscetibilidade dos corações dos animais a arritmias cardíacas seguindo os passos 2.1.-2.2.
<ol><li>Realizar perfusão Langendorff do coração de rato ou rato.<ol><li>Preparar a solução de Tyrode adicionando o seguinte a 1 L de água: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); e glicose, 1,8 g (10 mM). Ajuste o pH para 7,40 com NaOH (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Filtrar a solução com um filtro de 0,2 μm e borbulhar com 100% de O 2 continuamente durante os passos 2.1.6.-2.2.8 .</li>
		<li>Administrar heparina no rato ou rato (500 U/kg, injeção intraperitoneal) e 10 minutos depois anestesiar o animal com isoflurano a 3%. Garanta a anestesia adequada com uma pitada suave no corpo.</li>
		<li>Use um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1-1,5 cm na linha clavicular média para uma toracotomia esquerda e expor o coração.</li>
		<li>Colete o coração cortando com uma tesoura no nível do arco aórtico e coloque imediatamente o coração em solução gelada de Tyrode. NOTA: Recomenda-se cautela para não danificar o coração durante a coleta do coração.</li>
		<li>Canular a aorta do coração com uma agulha contundente (18 G para ratos; 23 G para camundongos) conectada a um sistema de perfusão Langendorff modificado (ver Tabela de Materiais) no modo de fluxo constante. Ajuste a taxa de fluxo para manter a pressão de perfusão em 70-80 mmHg. NOTA: Quaisquer bolhas na agulha de perfusão devem ser removidas antes da canulação aórtica. O uso de um microscópio de dissecação facilita a canulação.</li>
		<li>Colocar o coração canulado num prato de plástico de 9,10 cm revestido de elastómero de silicone com o ventrículo esquerdo virado para cima e perfundir o coração 9,12 com uma solução de Tyrode de 2 bolhas A 37 °C.</li>
		<li>Verifique a canulação aórtica correta no início da perfusão, observando a lavagem do sangue do coração durante os primeiros dois a três batimentos cardíacos e a mudança da cor do coração de vermelho para pálido.</li>
		<li>Coloque os eletrodos de um sistema de ECG de animais de pequeno porte (ver Tabela de Materiais) ao redor do coração, inserindo-os no revestimento de elastômero de silicone no prato (Figura 1). Grave o ECG usando software compatível.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar estimulação do receptor adrenérgico e estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares.<ol><li>Após a canulação aórtica bem-sucedida, continue a perfundir o coração com solução de Tyrode por 20 minutos para estabilizar a preparação do coração.</li>
		<li>Adicionar 1 μM de isoproterenol (ver Tabela de Materiais) à solução de Tyrode utilizada para perfusão cardíaca nos passos 2.2.3.-2.2.8.</li>
		<li>Após 10 min de perfusão de isoproterenol, estimular o coração no ápice com dois eletrodos de platina conectados a um estimulador elétrico (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Comece com o procedimento de estimulação (Figura 2), que inclui 10 estímulos consecutivos (intervalos S1, 5 V, 100 ms) que são seguidos por um estímulo extra (S2) com intervalo inicial de 80 ms. Reduza repetidamente o intervalo S2 em 2 ms de cada vez até que o batimento cardíaco não possa mais ser capturado (ou seja, atingindo o período refratário efetivo do coração, ERP)13.</li>
		<li>Monitore quaisquer taquiarritmias ventriculares induzidas (incluindo taquicardia ventricular e fibrilação) por ECG.</li>
		<li>Se nenhuma arritmia for induzida pelo procedimento acima, adicione outro estímulo extra (S3) após S2 com os mesmos intervalos iniciais (80 ms) e decréscimo (por 2 ms) até que o ERP seja atingido.</li>
		<li>Se as taquiarritmias ventriculares ainda não forem induzidas, adicione mais um estímulo extra (S4) após S3 com os mesmos intervalos inicial e de decréscimo até que o ERP seja atingido.</li>
		<li>Se as taquiarritmias ventriculares ainda não forem induzidas (como esperado no controle de corações saudáveis), interrompa o protocolo de estimulação elétrica e considere o coração não induzível.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+deletion+of+%CE%B2-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5%2FBDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+Nod1%2FRIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-%CE%BAB+activation+and+atherogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li>
<li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118(2021).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na%2B+channel+inhibition+by+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li>
<li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphoinositide+3-kinase+%7Balpha%7D%2C+protein+kinase+C%2C+and+L-type+Ca2%2B+channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
<li>Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+complete+atrioventricular+block+recapitulates+clinical+indices+of+bradycardia+and+provides+a+platform+to+test+disease-modifying+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6930(2019).</li>
<li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit%3A+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li>
<li>Ionta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHOX2+overexpression+favors+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+pacemaker+cells%2C+improving+biological+pacing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).</li>
<li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length%2C+pacing+site+and+atropine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li>
<li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li>
<li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes%3A+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170(2021).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Allison, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+nanoengineered+biomimetic+hybrid+fibers+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+human+cardiac+myocytes+for+medical+research%3A+Promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges.</a> Stem Cells International. 2017, 4528941(2017).</li>
<li>Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-based+treatment+of+acquired+heart+block%3A+The+battle+for+tomorrow+has+begun%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331(2017).</li>
<li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866(2019).</li>
<li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li>
<li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010(2020).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Várias etapas são críticas para o sucesso da preparação cardíaca isolada e perfundida por Langendorff. Em primeiro lugar, é importante evitar qualquer dano ao coração durante a coleta do coração (por exemplo, devido a espremer ou cortar acidentalmente com a tesoura). Em segundo lugar, é fundamental colocar o coração coletado em solução de Tyrode frio o mais rápido possível, porque isso interromperá os batimentos cardíacos e reduzirá o consumo de oxigênio do coração. Em terceiro lugar, a inserção da agulha na aorta não de...

A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo, ceifando a vida de 18 milhões de pessoas apenas em 20171. Roedores, especialmente camundongos e ratos, tornaram-se o modelo mais comumente usado em pesquisas cardiovasculares devido à facilidade de manuseio e à disponibilidade de várias linhas de superexpressão ou knockout transgênicas. Modelos de roedores têm sido fundamentais para a compreensão dos mecanismos da doença e para a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos no infarto do miocárdio2, hipertensãoarterial 3, insuficiência cardíaca4 e aterosclerose5. No entanto, o uso de roedores em estudos de arritmias cardíacas é limitado pelo seu pequeno tamanho cardíaco e frequência cardíaca mais rápida em comparação com modelos humanos ou animais de grande porte. Portanto, arritmias letais espontâneas em camundongos ou ratos após infarto do miocárdio são raras2. Os pesquisadores são forçados a se concentrar em alterações secundárias indiretas que possam refletir um substrato pró-arrítmico, como fibrose ou expressão gênica, sem mostrar mudanças significativas na carga de arritmia ou tendências pró-arrítmicas. Para superar essa limitação, um método que permite uma avaliação confiável da suscetibilidade de corações de camundongos e ratos a taquiarritmias ventriculares após modificação genética 6,7 ou infarto do miocárdio2 é descrito no presente protocolo. Este método combina a estimulação do receptor adrenérgico com a estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares em8 corações isolados, perfundidos por Langendorff e camundongos.
As abordagens padrão para a transferência de genes virais no tecido miocárdico de roedores geralmente envolvem a exposição do coração por toracotomia 9,10,11, que é um procedimento invasivo e está associado ao atraso na recuperação dos animais após o procedimento. Este artigo descreve um método de injeção intramiocárdica direta de vírus sob orientação por ultrassonografia para a superexpressão de transgenes. Este procedimento menos invasivo permite uma recuperação animal mais rápida após a injeção viral e menos lesão tecidual, em comparação com a toracotomia, reduz a dor pós-operatória e a inflamação no animal e, assim, permite uma melhor avaliação dos efeitos dos genes transgênicos na função cardíaca.

<table><tbody><tr><td>30 G 1/2 Agulha PrecisionGlide</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>vírus adeno-associado (AAV9-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>adenovírus (Ad-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>adenovírus (Ad-Wnt3a)</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-276318</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança (Nível II)</td><td>Microzone Corporation</td><td>N/A</td><td>Modelo #: BK-2-4</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Vetergésica</td><td>DIN 02342510</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de cortar cabelo</td><td>WAHL Clipper Corporation</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20701</td><td>705 LT, volume 50 &mu; L</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Life Brand</td><td>E12107</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Fresenius Kabi</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fresenius Kabi Ltd.</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de isoproterenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1351005</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8 software</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>Versão 8.1.5</td><td>para gravação de ECG</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos (Ctnnb1flox/flox)</td><td>Jackson Labs</td><td>4152</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos (&alpha; Microscópio Jackson</td> <td>Labs</td><td>5650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>para transdutor do sistema Langendorff</td></tr><tr><td>MS400</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>pomada oftálmica</td><td>Systane</td><td>DIN 02444062</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de potássio (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pressão</td><td>NETECH</td><td>DigiMano 1000</td><td>para bomba do sistema Langendorff</td></tr><tr><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-77924-65</td><td>para o sistema Langendorff</td><td></td></tr><tr><td>Rato (Sprague-Dawley, macho)</td> <td>Charles River</td><td>400</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-12</td><td></td></tr><tr><td>Elastômero de silicone</td><td>Down Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>para sistema Langendorff</td></tr><tr><td>Sistema de ECG para pequenos animais</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Powerlab 8/35 e Animal Bio Amp</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>VEVO3100 Sistema de Imagem Pré-clínica</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão transgênica viral em corações de roedores e avaliação do risco de arritmia cardíaca

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

A doença cardíaca é a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Devido à facilidade de manuseio e abundância de cepas transgênicas, os roedores tornaram-se modelos essenciais para a pesquisa cardiovascular. No entanto, arritmias cardíacas letais espontâneas que muitas vezes causam mortalidade em pacientes com doença cardíaca são raras em modelos de roedores de doença cardíaca. Isto é principalmente devido às diferenças de espécies nas propriedades elétricas cardíacas entre humanos e roedores e representa um desafio para o estudo de arritmias cardíacas usando roedores. Este protocolo descreve uma abordagem para permitir a expressão transgênica eficiente no miocárdio ventricular de camundongos e ratos usando injeções intramusculares guiadas por ecocardiografia de vírus recombinante (adenovírus e vírus adenoassociado). Este trabalho também descreve um método para permitir uma avaliação confiável da suscetibilidade cardíaca a arritmias usando corações isolados de camundongos e ratos perfundidos por Langendorff com estímulos elétricos adrenérgicos e programados. Essas técnicas são fundamentais para o estudo de distúrbios do ritmo cardíaco associados ao remodelamento cardíaco adverso após lesões, como o infarto do miocárdio.

Quando perfundido seguindo o protocolo descrito aqui (Figura 1), um coração isolado de rato ou rato bate rítmica e de forma estável por pelo menos 4 h. Se o delineamento experimental requer um período mais longo de perfusão cardíaca, é útil adicionar albumina à solução de perfusão para reduzir a ocorrência de edema miocárdico após perfusão de longa duração14. A inclusão de isoproterenol na solução de perfusão imita a ativação do sistema nervoso simpático que ocorre em...

O presente protocolo descreve métodos de expressão transgênica em corações de ratos e camundongos por injeção intramiocárdica direta do vírus sob orientação ecocardiográfica. Métodos para a avaliação da suscetibilidade de corações a arritmias ventriculares pela estimulação elétrica programada de corações isolados, perfundidos por Langendorff, também são explicados aqui.

Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Este protocolo permite ao usuário alcançar uma expressão transgênica eficiente no miocárdio ventricular, facilitando os estudos de expressão gênica para examinar arritmias cardíacas e função no tecido ventricular. A técnica de expressão transgênica viral é minimamente invasiva para o animal, causando menos danos e tempo de recuperação reduzido do que as abordagens convencionais que envolvem toracotomia. A técnica de indução de arritmias em corações de pequenos roedores é útil para avaliar a suscetibilidade a arritmias em pequenos modelos animais de doença cardíaca.Demonstrando o procedimento estará a doutora Alice Lu, pós-doutoranda do laboratório. Para começar, esterilize a região torácica inferior esquerda do rato anestesiado com rodadas alternadas de um esfoliante à base de iodo ou clorexidina, em álcool, três vezes em movimento circular. Sob orientação de imagem de ultrassom, insira a agulha da seringa que contém o vírus no peito do animal.Aproxime-se da ponta da agulha na parede livre frontal do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 a 15 microlitros do vírus. Verifique se a injeção bem-sucedida em imagens de ultrassom pelo brilho aprimorado perto da ponta da agulha. Retire a agulha do coração e insira em outras regiões do ventrículo esquerdo para uma segunda e terceira injeção da mesma quantidade de vírus.Para realizar a perfusão Langendorff do coração do rato, coloque o coração canulado num prato de plástico de 10 centímetros revestido de elastomero de silicone, com o ventrículo esquerdo virado para cima. Anular a aorta do coração com uma agulha contundente conectada a um sistema de profusão Langendorff modificado no modo de fluxo constante. Perfunda o coração com solução de Tyrode borbulhada de oxigênio a 37 graus Celsius.No início da perfusão, verifique a canulação aórtica correta, observando a lavagem do sangue do coração durante os primeiros dois a três batimentos cardíacos e alterando a cor do coração de vermelho para pálido. Ajuste a vazão para manter a pressão de perfusão em 70 a 80 milímetros de mercúrio. Após a confirmação, coloque os eletrodos de um sistema de ECG de animais pequenos ao redor do coração, inserindo-os no revestimento de elastômero de silicone no prato.Em seguida, registre o ECG usando um software compatível. Em seguida, realize a estimulação do receptor adrenérgico e perfunda o coração com isoproterenol e solução de tiroide. Após 10 minutos, realizar estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares, estimulando o coração no ápice com dois eletrodos de platina conectados a um estimulador elétrico.Inicie o procedimento de estimulação com 10 estímulos iniciais consecutivos, S1, seguido de um estímulo extra, S2, com um intervalo inicial de 80 milissegundos. Em seguida, reduza repetidamente o intervalo S2 em dois milissegundos de cada vez até que o batimento cardíaco não possa mais ser capturado ou o período refratário efetivo do coração, ou ERP, seja atingido. Monitore quaisquer taquiarritmias ventriculares induzidas, incluindo taquicardia ventricular e fibrilação, por ECG.Se nenhuma arritmia for induzida. adicione outro estímulo extra, S3, após S2, com os mesmos parâmetros até que o ERP seja alcançado. Se as taquiarritmias ventriculares ainda não forem induzidas, interrompa a estimulação elétrica e considere o coração não induzível.Durante a estimulação elétrica programada, a estimulação cardíaca bem-sucedida é verificada pela captura um-para-um dos batimentos cardíacos durante os estímulos S1 consecutivos e pelo complexo QRS prolongado durante a estimulação S1. Essas estimulações adrenérgicas e elétricas combinadas não induziram taquiarritmias ventriculares em corações de camundongos selvagens saudáveis, operados por simulação, ou em corações de ratos injetados com adenovírus-GFP de controle. Em contraste, o mesmo protocolo induziu taquiarritmias ventriculares em 77% dos corações de camundongos do tipo selvagem após infarto do miocárdio e em três em cada quatro ratos após injeção intramiocárdica de Ad-Wnt3a.Ao inserir a agulha, certifique-se de que a ponta da agulha esteja embutida dentro da parede livre e não dentro do ventrículo. Além disso, prender e canular a aorta do coração é o passo mais crítico. Após esses procedimentos, os corações podem ser usados para estudos histológicos padrão ou ensaios de biologia molecular.Alternativamente, células vivas podem ser isoladas para realizar estudos de eletrofisiologia unicelular.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Telemétrica ECG tem emergido como uma ferramenta essencial na avaliação de modelos animais para arritmias cardíacas e morte súbita cardíaca. Aqui, apresentamos um guia passo a passo para gravações de telemetria de ECG para aplicação em monitoramento de longo prazo ECG ambulatorial em camundongos.

Gravação de ECG ambulatorial em Ratos

Um método de transferência de genes para o tratamento da insuficiência cardíaca isquêmica é descrito usando um modelo de suínos de infarto do miocárdio. Nosso método simples e reprodutível nos permite facilmente avaliar a eficácia da transferência de genes diferentes com uma maneira muito simples e reprodutível.

Transferência de genes para insuficiência cardíaca isquêmica em um modelo pré-clínica

Neste vídeo, demonstramos a entrega de genes baseados em adenovírus associados recombinantes no filhote de camundongo. Este método ajuda no estudo da expressão gênica nas células-alvo.

Entrega de genes baseada em vírus adeno-associados recombinantes: uma técnica para entrega de transgenes e expressão cardíaca específica em modelo de roedor

Este protocolo descreve um método de imagem de células vivas usando cardiomiócitos neonatais primários de ratos após transdução lentiviral e adenoviral usando microscopia de disco giratório confocal. Isso permite observações detalhadas dos processos celulares em cardiomiócitos vivos.

Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

Neste manuscrito, é descrito um método para preparar vetores recombinantes do vírus adeno-associado 9 (rAAV9) para manipular a expressão gênica no coração de camundongos.

Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações

Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e acampamento dinâmica usando uma configuração de Langendorff ex vivo .

Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo

Este trabalho relata um método de controle do ritmo cardíaco de corações murinos intactos de camundongos transgênicos com canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulação local com matriz micro-LED e mapeamento óptico simultâneo do potencial de membrana epicárdica.

Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos

A terapia gênica miocárdica para cardiopatia isquêmica é uma grande promessa para futuras terapêuticas. Aqui, apresentamos um modelo animal de grande porte para avaliar a eficácia da terapia gênica no coração isquêmico.

Modelo animal de grande porte para avaliação da eficácia da terapia gênica em coração isquêmico

Este protocolo introduz o mapeamento óptico dual-dye de corações de camundongos obtidos de animais selvagens e knock-in afetados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluindo medidas eletrofisiológicas de voltagem transmembrana e transientes intracelulares de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial.

Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica

Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

Aprenda a expressão transgênica viral em corações de roedores usando injeção intramiocárdica guiada por ultrassom. Este método minimamente invasivo permite avaliar a suscetibilidade a arritmias cardíacas em modelos animais.

Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

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