Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Apesar de muitos exemplos de coordenação, a maioria dos estudos examina as proteínas actina ou microtúbula individualmente. Este método permite a visualização de ambos os polímeros dinâmicos em uma única reação. Essa técnica permite ao usuário avaliar diversas proteínas regulatórias para propriedades emergentes que só podiam ser vistas com versões dinâmicas de actina e microtúbulos.

Esta técnica pode ser expandida para incluir lipídios ou extratos para se aproximar da construção de uma célula sintética. Comece descongelando alíquotas de pós PEG-Silane e Biotin-PEG-Silane, e dissolvendo os pós PEG em 80% de etanol para gerar as soluções de calção de revestimento de 10 miligramas por mililitro mPEG-Silane e dois a quatro miligramas por mililitro Biotin-PEG-Silane. Remova o deslizamento de cobertura limpa do armazenamento de etanol usando fórceps.

Seque com gás nitrogênio e guarde em uma placa de Petri limpa. Cubra os deslizamentos com 100 microliters de solução de revestimento e incuba-os a 70 graus Celsius por pelo menos 18 horas ou até o uso. Corte 12 tiras de fita dupla faceda para um comprimento de 24 milímetros.

Remova um lado do suporte da fita e corrija pedaços de fita adjacentes às seis ranhuras presentes em uma câmara de imagem limpa. Remova o segundo pedaço de suporte da fita para expor o lado pegajoso da fita ao longo de cada ranhura da câmara e coloque a fita da câmara de lado em uma superfície limpa. Misture soluções de resina epóxi e endurecedor um-a-um em um pequeno barco de pesagem, e use uma ponta P1000 para colocar uma gota de epóxi misto entre as tiras de fita no final de cada sulco de câmara de imagem.

Em seguida, coloque câmara, fita ou lado epóxi para cima, em uma superfície limpa. Remova um deslizamento de cobertura revestido da incubadora Celsius de 70 graus e enxágue as superfícies revestidas e não revestidas dos deslizamentos de cobertura com água dupla destilada seis vezes. Seque com gás nitrogênio filtrado e, em seguida, afixe na câmara de imagem com o lado de revestimento de deslizamento de tampa em direção à fita.

Use uma ponta de pipeta P200 ou P1000 para aplicar pressão na interface de vidro colado para garantir um bom selo entre a fita e o deslizamento da tampa. Incubar as câmaras montadas à temperatura ambiente por pelo menos cinco a 10 minutos para permitir que o epóxi sele totalmente os poços da câmara antes de usar. As câmaras de perfusão expiram dentro de 12 a 18 horas de montagem.

Use uma bomba de perfusão e troquencialmente as soluções de condicionamento na câmara de perfusão, fluindo 50 microliters de 1%BSA para preparar a câmara de imagem. Remova o excesso de tampão do reservatório de encaixe da trava de isca. Em seguida, flua 50 microliters de 0,005 miligramas por mililitro streptavidin e incubar por um a dois minutos em temperatura ambiente.

Remova o excesso de tampão do reservatório. Flua 50 microliters de 1%BSA para bloquear a ligação inespecífica e incubar por 10 a 30 segundos. Remova o excesso de tampão do reservatório.

Em seguida, flua 50 microliters de tampão TIRF quente 1x e, em seguida, 50 microliters de sementes de microtúbulo estabilizadas e 50% biotiniladas diluídas em 1x tampão TIRF. Configure o estágio ou dispositivo de aquecimento objetivo para manter a temperatura de 35 a 37 graus Celsius durante 30 minutos antes de imaginar a primeira reação bioquímica. Em seguida, ajuste o intervalo de aquisição para cada cinco segundos por 15 a 20 minutos.

Em seguida, defina 488 e 647 exposições a laser a 50 a 100 milissegundos a 5% a 10% de potência, ajustando primeiro a reação de polimerização para iniciar o conjunto de filamentos de actina. Adquira as imagens em 647 nanômetros e faça os ajustes apropriados. Em seguida, ajuste a reação de polimerização em um segundo poço de perfusão condicionado para iniciar o conjunto de microtúbulos.

Visualize a 488 nanômetros e faça os ajustes apropriados. Combine três microliters de 10 micromolar 488 tubulin com a alíquota de 7,2 microliteres de 100 micromolar fluorescentemente não rotulado tubulin não mais do que 15 minutos antes do uso. Em seguida, combine três microliters de actina diluída relacionada à biotina em volumes apropriados de atos fluorescentes sem rótulo e rotulados de tal forma que a mistura final será de 12,5 mímola total actin com 10% a 30% de rótulo fluorescente.

Prepare a mistura de citoesqueleto combinando dois microlitadores do estoque de mistura de actina de 12,5 micromolar com a mistura de calção de tubulina não mais do que 15 minutos antes da imagem. Guarde no gelo até o uso. Prepare o mix de reação proteica combinando todos os outros componentes e proteínas experimentais, incluindo tampão 2x TIRF, antilvejante, nucleotídeos, tampões e proteínas acessórias.

Incubar a mistura de citoesqueleto e a reação proteica se mistura separadamente a 37 graus Celsius por 30 a 60 segundos. Para iniciar a reação adicione o conteúdo da mistura de reação proteica à mistura de citoesqueleto e misture-a. Flua 50 microliters da mistura de reação contendo 1x tampão TIRF suplementado com 15 tubulina livre de micromolar, um GTP milimolar, 0,5 monômeros de actina micromolar e volumes apropriados de controles tampão para a câmara de perfusão.

Grave um filme de lapso de tempo usando um software de microscópio para adquirir a cada cinco segundos por 15 a 20 minutos. Condicionar um novo poço de perfusão e substituir o volume tampão pela proteína reguladora de interesse e controles tampão. Adquira para avaliar as proteínas regulatórias para funções de microtúbulos de actina emergentes.

As medidas de exemplo de microtúbulos e dinâmicas de filamentos de actina são mostradas nessas imagens. A projeção de tempo médio do canal tubulina visualiza eficientemente os comprimentos totais de microtúbulos para as varreduras de linha usadas para gerar as parcelas de Kymograph. Linhas pontilhadas pretas correspondem aos dois exemplos de Kymographs dos microtúbulos dinâmicos.

As fases de crescimento e desmontagem dos microtúbulos são mostradas em cada kymograph. Duas montagem de imagem de lapso de tempo que retratam filamentos de actina únicas ativamente polimerizando são mostradas aqui. As taxas de alongamento são calculadas como a inclinação das parcelas do comprimento dos filamentos de actina ao longo do tempo por actina micromolar.

Assim, um fator de correção de dois deve ser aplicado a reações de atolar de 0,5 micromolar para comparar as taxas tipicamente determinadas na concentração de actina de um micromolar. Exemplos de cinco filamentos são mostrados aqui. Fluorescência de reflexão interna total, ou imagens de TIRF dos microtúbulos dinâmicos em filamentos de actina polimerizando na ausência ou presença de 250 tau nanomolar são mostrados aqui.

Linhas pontilhadas azuis e setas marcam desgaste uma linha foi desenhada para as parcelas de varredura de linha correspondentes a cada condição. A sobreposição entre os microtúbulos nas regiões de actina pode ser pontuada em um ponto de tempo definido por área. Proteínas citoesqueletal, especificamente actina, microtúbulos e seus reguladores são muito sensíveis a ciclos de congelamento/degelo.

Para consistência e sucesso, use proteínas altamente puras e devidamente armazenadas.