Name: Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda um ensaio de transcitose em células endoteliais para avaliar a permeabilidade da barreira interna sangue-retina usando células HRMECs. Este método in vitro permite estudar mecanismos moleculares sem uso de animais.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do NIH (R01 EY028100, EY024963 e EY031765) para JC. A ZW foi apoiada por um Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Boston Children's Hospital para a geração de microscopia de luz e imagens EM (Figura 3). Os protocolos para os estudos in vivo podem ser obtidos de Wang et al.24. Todos os experimentos envolvendo células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) foram aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC) do Boston Children's Hospital.
1. Preparação de Reagentes
<ol><li>Solução para revestimento de placa de cultura de tecidos: Preparar solução de gelatina a 0,1% dissolvendo 1 mL de solução de estoque de gelatina (40%-50%) em 500 mL de cultura de tecido estéril grau 1x PBS (pH = 7,4). Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm. Conservar a 0,1% a solução de gelatina a 2-8°C. Pode ser armazenado à referida temperatura por um tempo indefinido em uma condição estéril.</li>
	<li>Meio de crescimento: Preparar 500 mL de meio completo de crescimento de células endoteliais (EGM) dissolvendo suplementos de EGM no meio basal de crescimento de células endoteliais (EBM) de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Aliquot o meio de crescimento em tubos de 50 ml e armazene os tubos a 4 °C. O prazo de validade do meio de crescimento é de 12 meses a 4 °C.</li>
	<li>Solução de tripsina: Para solução de tripsina-EDTA a 0,25%, alíquota do frasco para injetáveis de reserva em tubos de 50 ml e conservar a 4 °C (até 2 semanas) ou a −20 °C (até 24 meses).</li>
</ol>2. Cultivo de HRMECs
<ol><li>Cultura celular inicial<ol><li>Cubra as placas de Petri de cultura de células (100 mm de diâmetro x 20 mm de altura) com 5 mL de solução de gelatina a 0,1% sob um exaustor de fluxo laminar e mantenha-as intactas no exaustor por 30 min à temperatura ambiente (RT) para revestimento uniforme. NOTA: O revestimento gelatinoso de pratos aumenta a fixação celular. Alternativamente, frascos de cultura T75 revestidos de gelatina também podem ser usados.</li>
		<li>Antes de semear as células, aspirar a solução de gelatina usando uma bomba de vácuo. A pressão de vácuo do aspirador utilizado foi de até 724 mmHg. NOTA: A aspiração deve ser feita imediatamente antes das células de semeadura para evitar a secagem da solução de revestimento.</li>
		<li>Descongele um frasco para injetáveis congelado de HRMECs (a partir do armazenamento em azoto líquido) utilizando um banho-maria a 37 °C ou adicionando um meio de crescimento quente ao frasco para injetáveis. Uma vez descongelado, transfira a suspensão celular para 9 mL de meio de crescimento (supondo que o frasco descongelado de HRMECs seja de 1 mL). NOTA: Os HRMECs foram obtidos comercialmente (Tabela de Materiais). O meio de crescimento adicionado às células deve ser sempre pré-aquecido a 37 °C antes da utilização.</li>
		<li>Gire as células a 200 x g por 5 min no RT e aspirar cuidadosamente o sobrenadante para evitar a remoção do pellet celular.</li>
		<li>Ressuscite o pellet celular em 10 mL de meio de crescimento e transfira a suspensão resultante para uma placa de Petri revestida de gelatina. Manter as células na incubadora a 37 °C e a 5% de CO2. Normalmente, os HRMECs são 70%-80% confluentes após 72 h. NOTA: O meio de crescimento é alterado a cada dois dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Subcultura de HRMECs em inserções de membrana permeável<ol><li>Preparar inserções de filtro de cultura celular (pastilhas de 6,5 mm com membrana de policarbonato de tamanho de poro de 0,4 μm, colocadas em uma placa de 24 poços) para semeadura de HRMECs revestindo cada pastilha (câmara apical) com 200 μL de solução de gelatina a 0,1% por 30 min sob um exaustor de fluxo laminar. Certifique-se de que a solução cobre toda a superfície inferior da inserção do filtro. NOTA: Cada poço tem uma câmara apical e basolateral separada por uma membrana porosa.</li>
		<li>Retire a placa de Petri com HRMECs cultivados (etapa 2.1.5.) da incubadora e aspirar o meio de crescimento. Lave suavemente as células 2x com 10 mL de PBS 1x sob um exaustor de fluxo laminar para se livrar de possíveis células flutuantes / mortas.</li>
		<li>Dissociar as células com 0,5-1 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,25% e colocar a placa de Petri na incubadora (37 °C e 5% CO2) por 5 min.</li>
		<li>Sacie a atividade da tripsina adicionando 4,5-9 mL de meio de crescimento e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL usando uma pipeta de 10 mL.</li>
		<li>Gire as células a 200 x g por 5 min no RT, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL de meio de crescimento.</li>
		<li>Conte o número de células usando um hemocitômetro manual ou um contador de células automatizado e semeie a uma densidade de 4 x 104 células por inserção de filtro (ou seja, 1,25 x 105 células/cm2). O volume de suspensão celular para cada pastilha é de 250 μL.</li>
		<li>Aspirar a solução de revestimento dos poços que contêm inserções permeáveis e transferir 250 μL da suspensão celular por pastilha (câmara apical). Adicione apenas meio (ou seja, sem células) a uma das inserções, que será usada como um "controle em branco" para a medição do TEER. Simultaneamente, adicione também 750 μL de meio por poço, nas câmaras basolaterais.</li>
		<li>Mantenha a placa de 24 poços com inserções permeáveis na incubadora (37 °C e 5% de CO 2) por 7-12 dias até que as células cultivadas se tornem totalmente confluentes e o valor TEER desejado de ~20 Ω·cm2 seja alcançado.</li>
		<li>Mude o meio de crescimento a cada dois dias. Durante a troca do meio, aspirar cuidadosamente o meio para minimizar a ruptura da monocamada celular e adicionar 250 μL e 750 μL de meio fresco por poço às câmaras apical e basolateral, respectivamente. NOTA: O meio de crescimento é alterado para as câmaras apical e basolateral dos poços.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medições TEER (Figura 4)
<ol><li>No dia 14 pós-semeadura de células (etapa 2.2.9.), meça o TEER para HRMECs usando um sistema de resistência elétrica (ER) de volt-ohm epitelial (EVOM) (Tabela de Materiais) da seguinte forma.</li>
	<li>Pré-carregue o sistema ER e verifique a funcionalidade do medidor usando o eletrodo de teste STX04. Calibre, se necessário.</li>
	<li>Conecte o eletrodo ao medidor e equilibre o eletrodo primeiro mergulhando-o em etanol a 70% por 15-20 min e, em seguida, imergindo-o brevemente no meio de crescimento EGM de cultura celular.</li>
	<li>Enquanto isso, mantenha a placa de 24 poços contendo células no exaustor de fluxo laminar em RT por 15-20 min para equilíbrio de temperatura. NOTA: As medições de TEER são afetadas pela temperatura, por isso a etapa de equilíbrio é essencial.</li>
	<li>Para a medição do TEER, adicione o meio de crescimento fresco às câmaras apical (250 μL) e basolateral (750 μL) dos poços.</li>
	<li>Realize a medição TEER imergindo cuidadosamente o eletrodo de modo que a ponta mais curta esteja na inserção e a ponta mais longa toque o fundo do poço. Meça a resistência em todo o controle em branco primeiro. Para cada inserção, meça o TEER em triplicados. NOTA: Para enxaguar o eléctrodo entre as medições, utiliza-se um meio de cultura. Certifique-se de que o eletrodo esteja preso em um ângulo de 90° em relação à parte inferior da pastilha para leituras estáveis.</li>
	<li>Calcular a resistência elétrica (em Ω·cm 2) através da monocamada usando a fórmula, TEER = resistência líquida (Ω) x área de superfície da inserção do filtro (cm2); aqui, a resistência líquida é a diferença entre a resistência de cada poço (meio de crescimento com células) e o poço em branco (apenas meio de crescimento).</li>
	<li>Realize um tratamento adicional das células somente após o valor de TEER atingir ~ 20 Ω · cm2. Se o nível de TEER desejado não for atingido, mantenha a placa na incubadora e meça o TEER no dia seguinte. NOTA: A confluência HRMEC também pode ser validada pelo exame morfológico da forma celular (sob microscópio) com morfologia típica de paralelepípedos e/ou pela presença de proteínas de junção celular com coloração imuno-histoquímica separadamente.</li>
</ol>4. Ensaio de transcitose
<ol><li>Ensaio de transcitose in vitro mediado por clatrina utilizando transferrina marcada com Cy3 (Figura 5)<ol><li>Ao atingir a confluência com valores de TEER em torno de 20 Ω·cm 2, o soro priva as células por 24 h a 37 °C e 5% de CO2 usando FBS a 0,5% em EBM (meio reduzido sérico) em ambas as câmaras (câmara apical: 250 μL e câmara basolateral: 750 μL) antes do tratamento com o ligante. A EBM com redução sérica foi utilizada durante todo o ensaio.</li>
		<li>Incubar as células (utilizando o meio com redução sérica na etapa 4.1.1.) na câmara apical com ligante transferrina fluorescente (cianina 3) (Cy3-Tf) (concentração final de 40 μg/ml) durante 60 min a 37 °C. NOTA: As placas contendo Cy3-Tf devem ser protegidas da luz para evitar o fotobranqueamento de Cy3-Tf, envolvendo nelas folha de alumínio e realizando o experimento em um exaustor de cultura de células com as luzes apagadas.</li>
		<li>Após 1 h, colocar a placa sobre gelo e lavar a monocamada apicamente e basolateralmente 4x (3-5 min por lavagem) com o meio reduzido de soro no RT para remover o Cy3-Tf livre não ligado. NOTA: A lavagem é essencial para remover moléculas traçadoras livres e permitir uma leitura precisa da transcitose sem potencial vazamento da via paracelular.</li>
		<li>Adicionar meio fresco com soro reduzido (como na etapa 4.1.1.) às pastilhas de filtro cuidadosamente lavadas que contenham células e transferir as pastilhas para poços frescos da placa de 24 poços contendo meio com soro reduzido pré-aquecido.</li>
		<li>Incubar as células por mais 90 min na incubadora (37 °C e 5% de CO2) e, em seguida, coletar o meio da câmara basolateral.</li>
		<li>Registar a intensidade de fluorescência da solução a partir da câmara basolateral utilizando um detector de fluorescência. Os níveis de intensidade de fluorescência, medidos como unidades fluorescentes relativas (RFU), indicam a quantidade de complexo Cy3-Tf transcitosada através da monocamada HRMEC via transcitose dependente de clatrina.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de transcitose in vitro mediado por cavéolas utilizando HRP (Figura 6)<ol><li>Ao atingir a confluência total com os valores de TEER em torno de 20 Ω cm 2, o soro priva as células por 24 h a 37 °C e 5% de CO2 usando 0,5% de EBM contendo FBS (meio reduzido sérico) antes do tratamento (como na etapa 4.1.1.). O meio EBM com redução sérica foi utilizado durante todo o ensaio.</li>
		<li>Trate as células da câmara apical com os tratamentos e controles do veículo desejados. NOTA: Aqui, usamos moduladores Wnt como exemplo para demonstrar a regulação da transcitose mediada por cavéolas pela via de sinalização Wnt em HRMECs: Norrin recombinante humano e inibidor de Wnt XAV939. Em um experimento típico, as células foram tratadas por 24 h em incubadora (37 °C e 5% de CO2) com as seguintes concentrações: Norrin (125 ng/mL), Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM) e solução de controle do veículo. Além disso, o meio condicionado Wnt3a (produzido a partir de células L Wnt-3A) também foi usado.</li>
		<li>Incubar as células na câmara apical com HRP (5 mg/mL) por 15 min a 37 °C.</li>
		<li>Posteriormente, colocar a placa de 24 poços sobre gelo e lavar intensamente as câmaras apical e basolateral 6x com tampão P (pH HEPES 10 mM = 7,4, piruvato de sódio 1 mM, glicose 10 mM, CaCl 2 3 mM, NaCl145 mM) para remover a HRP extracelular livre. NOTA: A lavagem é essencial para remover moléculas traçadoras livres e permitir uma leitura precisa da transcitose sem potencial vazamento da via paracelular.</li>
		<li>Adicionar meio fresco com soro reduzido (como indicado no ponto 4.1.1.) à câmara apical e transferir as pastilhas para um alvéolo fresco contendo meios pré-aquecidos.</li>
		<li>Incubar a monocamada por mais 90 min na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 antes de recolher o meio da câmara basolateral.</li>
		<li>Ao meio coletado, adicionar 100 μL de substrato de peroxidase fluorogênica HRP (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante, e incubar em RT por 10 min antes de interromper a reação com 100 μL de solução Stop.</li>
		<li>Detectar os níveis de produto de reação do substrato HRP no meio usando um leitor de placa de fluorescência. Medir a intensidade de fluorescência no comprimento de onda de emissão de 420 nm (com excitação de 325 nm) e como unidades fluorescentes relativas (RFU). Os valores indicam o nível de HRP transcitosado através da camada HRMEC através de transcitose mediada por cavéolas. NOTA: O produto fluorescente usado aqui (Tabela de Materiais) não faz fotobranqueamento. A proteção contra a luz contra o fotobranqueamento não é necessária.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse ou interesses financeiros a divulgar.

O BRB desempenha um papel essencial na saúde e na doença da retina. Técnicas in vitro que avaliam a permeabilidade vascular têm se mostrado ferramentas cruciais em estudos sobre o desenvolvimento e a função da barreira (BRB/BBB). O procedimento aqui descrito poderia ser utilizado para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à transcitose CE ou avaliar moduladores moleculares relacionados que afetam a permeabilidade do BRB. In vitro Os ensaios de transcitose EC têm múltiplas vantagens em relação ao...

A retina humana é um dos tecidos que mais demandam energia no corpo. O bom funcionamento da retina neural requer um suprimento eficiente de oxigênio e nutrientes, juntamente com um fluxo restrito de outras moléculas potencialmente nocivas para proteger o ambiente da retina, que é mediado pela barreira sangue-retina (BRB)1. Semelhante à barreira hematoencefálica (BBB) no sistema nervoso central, o BRB atua como uma barreira seletiva no olho, regulando o movimento de íons, água, aminoácidos e açúcar dentro e fora da retina. O BRB também mantém a homeostase da retina e seu privilégio imunológico, impedindo a exposição a fatores circulatórios, como células imunes, anticorpos e patógenos nocivos2. A disfunção do BRB contribui para a fisiopatologia de diversas doenças oculares vasculares, como retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão da veia retiniana e uveíte, resultando em edema vasogênico e subsequente perda de visão 3,4,5.
O BRB consiste em duas barreiras separadas para duas redes vasculares oculares distintas, respectivamente: a vasculatura da retina e o coriocapilar fenestrado abaixo da retina. O BRB interno (iBRB) é composto principalmente de células endoteliais microvasculares da retina (RMECs) que revestem a microvasculatura da retina, que nutre as camadas neuronais internas da retina. Por outro lado, o epitélio pigmentar da retina forma o principal componente do BRB externo, que se encontra entre a retina neurossensorial e o coriocapilar2. Para o iBRB, o transporte molecular através das RMECs ocorre por via paracelular e transcelular (Figura 1). O alto grau de seletividade de substâncias em todo o iBRB depende (i) da presença de complexos proteicos juncionais que restringem o transporte paracelular entre células endoteliais (CE) adjacentes e (ii) baixos níveis de expressão de mediadores, transportadores e receptores de cavéolas dentro das células endoteliais que mantêm baixas taxas de transporte transcelular 1,6,7,8 . Os complexos juncionais que regulam o fluxo paracelular são compostos por junções apertadas (claudinas, occludinas), junções aderentes (caderinas VE) e junções gap (conexinas), permitindo a passagem de água e pequenos compostos solúveis em água. Enquanto pequenas moléculas lipofílicas se difundem passivamente pelo interior das RMECs, o movimento de moléculas lipofílicas e hidrofílicas maiores é regulado por vias transendoteliais impulsionadas por ATP, incluindo transporte vesicular e transportadores de membrana 5,9.
A transcitose vesicular pode ser categorizada em transcitose caveolar mediada por caveolina, transcitose dependente de clatrina (e mediada por receptor) e macropinocitose independente de clatrina (Figura 2). Esses processos de transporte vesicular envolvem vesículas de tamanhos diferentes, com macropinossomos sendo os maiores (variando de 200-500 nm) e cavéolas sendo os menores (com média de 50-100 nm), enquanto as vesículas revestidas de clatrina variam de 70-150 nm10. As cavéolas são invaginações de membrana plasmática ricas em lipídios em forma de frasco com revestimento proteico, composto principalmente de caveolina-1 que se liga ao colesterol da membrana lipídica e a outras proteínas estruturais e sinalizadoras através de seu domínio cavamolíne-andaime11. As caveolinas trabalham em conjunto com a cavina periféricamente ligada para promover a estabilização das cavéolas na membrana plasmática12. As membranas caveolares também podem transportar receptores para outras moléculas, como insulina, albumina e lipoproteínas circulantes, incluindo lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína de baixa densidade (LDL), para auxiliar seu movimento através das células endoteliais13. Durante o desenvolvimento, a formação de BRB funcional depende da supressão da transcitose CE8. O endotélio retiniano maduro, portanto, apresenta níveis relativamente baixos de receptores de cavéolas, casofalina-1 e albumina em relação a outras células endoteliais em condições fisiológicas, contribuindo para suas propriedades de barreira 4,9.
Como a degradação do iBRB é uma das principais características de muitas condições oculares patológicas, é essencial desenvolver métodos para avaliar a permeabilidade vascular da retina in vivo e in vitro. Esses métodos ajudam a fornecer insights prováveis sobre os mecanismos de integridade comprometida do BRB e a avaliar a eficácia de potenciais alvos terapêuticos. Exames de imagem in vivo atuais ou ensaios quantitativos de vazamento vascular geralmente empregam fluorescentes (fluoresceína de sódio e dextrano), colorimétricos (corante Evans Blue e substrato de peroxidase de rábano [HRP]) ou marcadores radioativos14 para detectar extravasamento da vasculatura para tecidos retinianos circundantes com imagens de microscópio ou em lisado de tecido isolado. Um marcador ideal para quantificar a integridade vascular deve ser inerte e grande o suficiente para permear livremente os vasos comprometidos enquanto confinados em capilares saudáveis e intactos. Métodos que empregam fluoresceína de sódio ou dextrano conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) em angiografia de fluoresceína de fundo de olho vivo (FFA) ou montagens planas isoladas da retina são amplamente utilizados para quantificar o extravasamento da retina in vivo ou ex vivo. O FITC-dextran tem a vantagem de estar disponível em diferentes pesos moleculares variando de 4-70 kDa para estudos seletivos de tamanho15,16,17. A albumina FITC (~68 kDa) é um traçador alternativo de proteínas de grande porte de relevância biológica para estudos de extravasamento vascular18. O corante Evans Blue, injetado intracardialmente19, retro-orbitalmente ou através da veia caudal 20, também depende de sua ligação com albumina endógena para formar uma molécula grande que pode ser quantificada principalmente por detecção espectrofotométrica ou, menos comumente, microscopia de fluorescência em montagens planas20,21. Essas metodologias de imagem quantitativa ou leve, no entanto, muitas vezes não distinguem o transporte paracelular do transporte transendotelial. Para a análise específica da transcitose com visualização ultraestrutural de vesículas transcitosadas, moléculas traçadoras, como a HRP, são tipicamente utilizadas para localizar vesículas transcitosadas dentro de células endoteliais que podem ser observadas em microscópio eletrônico 22,23,24 (Figura 3A-C).
O desenvolvimento e o uso de modelos de iBRB in vitro para avaliar a permeabilidade das células endoteliais poderiam fornecer uma avaliação robusta e de alto rendimento para complementar os experimentos in vivo e auxiliar na investigação de reguladores moleculares de vazamento vascular. Ensaios comumente utilizados para avaliar o transporte paracelular e a integridade de junções apertadas incluem resistência elétrica transendotelial (TEER), uma medida de condutância iônica (Figura 4)2,25 e ensaio de vazamento vascular in vitro usando marcadores fluorescentes de pequeno peso molecular26. Além disso, ensaios de transcitose à base de transferrina modelando BBB têm sido utilizados para explorar a transcitose dependente de clatrina27. Apesar disso, os ensaios para avaliar o BRB e, mais especificamente, a transcitose caveolar da CE retiniana in vitro são limitados.
Neste estudo, descrevemos um ensaio de transcitose CE usando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) como modelo in vitro para determinar a permeabilidade do iBRB e a transcitose CE. Este ensaio baseia-se na capacidade dos HRMECs de transportar transferrina ou HRP através das vias de transcitose mediadas por receptores ou dependentes de cavéolas, respectivamente (Figura 2). Os HRMECs cultivados até a confluência total na câmara apical (ou seja, inserção de filtro) foram incubados com transferrina conjugada fluorescente (Cy3-Tf) ou HRP para medir a intensidade de fluorescência correspondente aos níveis de transferrina ou HRP transferidos para a câmara inferior apenas através da transcitose CE. A confluência da monocamada celular pode ser confirmada pela medição do TEER, indicando a integridade da junção apertada25. Para demonstrar a técnica de TEER e ensaio de transcitose, foram utilizados moduladores moleculares conhecidos de permeabilidade vascular e transcitose CE, incluindo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)28 e aqueles na sinalização Wnt (ligantes Wnt: Wnt3a e Norrin)29.

<table><tbody><tr><td>Armário de Segurança Biológica</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Petridish para cultura de células&nbsp;</td><td>Nest Biotechnology</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (15 mL)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 mL)</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Cianina 3-Transferrina Humana&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>Meio Basal de Células Endoteliais-2 (EBM-2)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Endoteliais-2 (EGM-2) Suplementos SingleQuots Lonza</td><td>Bioscience</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino (FBS)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro (2 chips)</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de Rábano (HRP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMEC)</td><td>Sistemas Celulares</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L células (para meio condicionado por controle)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Células Wnt-3A (para meio condicionado por Wnt3A)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas multimodo</td><td>EnSight, PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) tampão (1x)</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>QuantaBlu Kit de substrato de peroxidase fluorogênica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>Norrin humano recombinante (rhNorrin)</td><td>R& D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento endotelial vascular humano recombinante (rhVEGF)</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa (0.22 &micro; m)</td> <td>Inserções Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Transwell (6,5 mm transwell, 0,4 &micro; inserção de membrana de poliéster de poros m)</td> <td>Corning Inc.</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%) (1x)</td> <td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Precisão do banho-maria</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>51221060</td><td></td></tr><tr><td>XAV939 (Wnt/&beta;-inibidor de catenina)</td> <td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de transcitose de células endoteliais como modelo in vitro para avaliar a permeabilidade da barreira interna sangue-retina

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

A disfunção da barreira sangue-retina (BRB) contribui para a fisiopatologia de várias doenças oculares vasculares, muitas vezes resultando em edema da retina e subsequente perda de visão. A barreira hemato-retiniana interna (iBRB) é composta principalmente de endotélio vascular da retina com baixa permeabilidade em condições fisiológicas. Esta característica de baixa permeabilidade é rigidamente regulada e mantida por baixas taxas de transporte paracelular entre as células endoteliais microvasculares adjacentes da retina, bem como o transporte transcelular (transcitose) através delas. A avaliação da permeabilidade da barreira transcelular da retina pode fornecer insights fundamentais sobre a integridade do iBRB na saúde e na doença. Neste estudo, descrevemos um ensaio de transcitose de células endoteliais (CE), como um modelo in vitro para avaliar a permeabilidade do iBRB, utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs). Este ensaio avalia a capacidade dos HRMECs de transportar transferrina e peroxidase de rábano (HRP) em processos de transporte transcelular mediados por receptores e cavéolas, respectivamente. HRMECs totalmente confluentes cultivados em membrana porosa foram incubados com transferrina marcada com fluorescência (transcitose dependente de clatrina) ou HRP (transcitose mediada por cavéolas) para medir os níveis de transferrina ou HRP transferidos para a câmara inferior, indicativos de níveis de transcitose em toda a monocamada da CE. A sinalização Wnt, uma via conhecida que regula o iBRB, foi modulada para demonstrar o método de ensaio de transcitose baseado em HRP mediado por cavéolas. O ensaio de transcitose EC descrito aqui pode fornecer uma ferramenta útil para investigar os reguladores moleculares da permeabilidade CE e da integridade do iBRB em patologias vasculares e para o rastreamento de sistemas de liberação de medicamentos.

Imagens EM de endotélio vascular da retina mostram transporte vesicular transcitótico e vesículas caveolares em células endoteliais in vivo. A transcitose EC pode ser visualizada in vivo dentro de cortes transversais da retina com precipitado marrom escuro refletindo vasos sanguíneos contendo HRP sob um microscópio de luz (Figura 3A) e como precipitado denso em elétrons indicativo de vesículas transcitóticas contendo HRP (Figura ...

Este protocolo ilustra um ensaio de transcitose de células endoteliais in vitro como um modelo para avaliar a permeabilidade da barreira sangue-retina interna, medindo a capacidade das células endoteliais microvasculares da retina humana de transportar peroxidase de rábano através das células em processos de transporte transcelular mediados por cavéolas.

Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Este protocolo fornece um modelo celular útil para estudar a função e a permeabilidade de barreiras vasculares seletivas, como a barreira hemato-retiniana ou hematoencefálica, com foco específico na transcitose endotelial. Este ensaio é fácil de configurar e usar, não exigindo animais vivos. Pode ser utilizado para investigar vários reguladores moleculares da permeabilidade das células endoteliais e da transcitose que afetam a integridade da barreira hemato-retiniana interna.Este ensaio pode fornecer insights sobre biologia vascular e pesquisa ocular e cerebral, permitindo uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao controle do BRB BBB e explorando a potencial entrega de medicamentos através das barreiras. Para começar, prepare as inserções de filtro de cultura celular para semear células endoteliais microvasculares da retina humana ou HRMECs, revestindo cada inserção com 200 microlitros de solução de gelatina a 0,1% por 30 minutos sob um exaustor de fluxo laminar. Certifique-se de que a solução cobre toda a superfície inferior da inserção do filtro.Pegue uma placa de Petri com HRMECs cultivados incubados a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e aspirar o meio de crescimento. Lave suavemente as células duas vezes com 10 mililitros de 1X PBS sob o exaustor de fluxo laminar para se livrar das potenciais células flutuantes ou mortas. Dissociar as células com 0,5 a 1 mililitro de solução de 0,25% tripsina-EDTA e colocar a placa de Petri na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 5 minutos.Apague a atividade da tripsina adicionando 4,5 a 9 mililitros de meios de crescimento e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros usando uma pipeta de 10 mililitros. Gire as células a 200 vezes g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mililitros de meios de crescimento.Conte o número de células usando um hemocitômetro manual ou um contador de células automatizado e sementes a uma densidade de 40.000 células por inserção de filtro. O volume de suspensão celular para cada pastilha é de 250 microlitros. Aspirar a solução de revestimento dos poços contendo inserções permeáveis e transferir 250 microlitros da suspensão celular por inserção, em seguida, adicione apenas o meio a uma das pastilhas, que será usado como um controle em branco para a medição da resistência elétrica transendotelial, ou TEER.Simultaneamente, adicione também 750 microlitros de meio por poço nas câmaras basolaterais. Mantenha a placa de 24 poços com inserções permeáveis na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 7 a 12 dias até que as células cultivadas se tornem totalmente confluentes e o valor TEER desejado de cerca de 20 ohms por centímetro quadrado seja alcançado. Antes das medições TEER, coloque a placa de 24 poços contendo células no exaustor de fluxo laminar à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos para equilíbrio da temperatura.Para medir o TEER para HRMECs, usando um sistema epitelial de resistência elétrica do medidor de volts/ohm, conecte o eletrodo ao medidor e equilibre o eletrodo primeiro mergulhando-o em etanol a 70% por 15 a 20 minutos e, em seguida, imergindo-o brevemente no meio de crescimento EGM de cultura celular. Realize a medição TEER imergindo cuidadosamente o eletrodo, de modo que a ponta mais curta esteja na inserção e a ponta mais longa toque o fundo do poço. Meça a resistência através do controle em branco primeiro e, em seguida, para cada inserção, meça o TEER em triplicados.Ao atingir a confluência com os valores de TEER em torno de 20 ohm centímetros quadrados, privar as células de soro por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono usando 0,5% de FBS em EBM em ambas as câmaras antes do tratamento com o ligante. A EBM com redução sérica foi utilizada durante todo o ensaio. Incubar as células usando o meio reduzido de soro na câmara apical com ligante fluorescente de cianina 3-tag para transferrina por 60 minutos a 37 graus Celsius.Depois de lavar a monocamada apicamente e basolateralmente 4 vezes com o meio com soro reduzido, adicione o meio fresco às inserções de filtro contendo as células e transfira as inserções para poços frescos da placa de 24 poços contendo meio pré-aquecido com soro reduzido. Incubar as células por mais 90 minutos na incubadora e, em seguida, coletar o meio da câmara basolateral. Registar a intensidade de fluorescência da solução a partir da câmara basolateral utilizando um detector de fluorescência.Ao atingir a confluência com os valores de TEER em torno de 20 ohm centímetros quadrados, privar as células de soro por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono usando 0,5% de FBS em EBM em ambas as câmaras antes do tratamento com o ligante. A EBM com redução sérica foi utilizada durante todo o ensaio. Em seguida, trate as células na câmara apical com os tratamentos desejados e controles do veículo.Adicione 5 miligramas por mililitro de peroxidase de rábano, ou HRP, às células e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Adicione o meio fresco com soro reduzido à câmara apical e transfira as inserções para um poço fresco contendo meio pré-aquecido. Incubar a monocamada por mais 90 minutos na incubadora.Após a coleta do meio da câmara basolateral, adicionar 100 microlitros de substrato de peroxidase fluorogênica HRP ao meio coletado e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Pare a reação com 100 microlitros de solução de parada e detecte os níveis do produto de reação do substrato HRP no meio usando um leitor de placa de fluorescência. Antes de demonstrar os ensaios de transcitose in vitro, a visualização da transcitose de células endoteliais na retina é mostrada como informação de base.Aqui, a imagem do microscópio de luz mostra um lúmen de vaso sanguíneo cheio de HRP de uma seção de retina de camundongo do tipo selvagem de 3 meses de idade corada com DAB. A HRP foi injetada retroorbitalmente. Os vasos da retina cheios de HRP podem ser vistos como precipitado marrom escuro sob o microscópio de luz.A seção ultrafina do microscópio eletrônico de transmissão mostra vasos transcitóticos cheios de HRP com RMECs representando transcitose CE através da barreira hemato-retiniana interna. Aqui, a grande vesícula reflete potencialmente o macropinossomo e um glóbulo vermelho no lado do luminol. A imagem TeM mostra pequenas vesículas transcitóticas cheias de HRP, provavelmente vesículas de caveola, dentro do RMEC.A coloração imuno-histoquímica do anticorpo CAV-1 e da isolectina B4 demonstra a localização do CAV-1, um marcador de vesículas de caveola nos vasos sanguíneos da retina, na retina de camundongo do tipo selvagem de 3 meses de idade. A imagem TeM de CAV-1 marcada com imunoouro dentro das células endoteliais da retina é mostrada aqui com uma imagem ampliada da vesícula de caveola positiva para CAV-1. Para o ensaio de transcitose EC mediada por clatrina em HRMECs usando transferrina, aqui, uma imagem de microscópio de fluorescência mostra a transferrina Cy3 endocitosada na cor vermelha dentro de HRMECs corados com DAPI em azul.Para transcitose EC mediada por cavéolas usando HRP, a sinalização Wnt aqui é usada como um exemplo para demonstrar o ensaio. Recentemente, descobriu-se que a sinalização Wnt regula a transcitose CE mediada por cavéolas. As células foram tratadas com o ativador da via Wnt Wnt3a-condicionado meio e Norrin recombinante, com ou sem inibidor de sinalização Wnt XAV939 e seus controles reativos.Os ativadores Wnt reduziram o nível de transcitose baseada em HRP, que foram revertidos pelo XAV939. A medição correta do TEER é crucial para determinar a integridade da monocamada. É muito afetado por vários fatores, como manuseio inadequado, flutuações de temperatura, meio de cultura, duração da cultura, etc.Este ensaio pode ser modificado como sistemas de co-cultura ou cultura organotípica 3D imitando condições in vivo.

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Medicine

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Ensaio de permeabilidade mimetizada da barreira hematoencefálica: um ensaio in vitro para avaliar a permeabilidade do BBB Mimic a moléculas traçadoras

Este vídeo demonstra um método para avaliar a resistência elétrica transendotelial (TEER) em células endoteliais microvasculares do cérebro de camundongos in vitro. Um valor TEER alto indica junções de células endoteliais intactas, enquanto a adição de células T ativadas reduz o valor TEER, refletindo a ruptura da barreira juncional.

Avaliação da resistência elétrica transendotelial em um modelo de barreira hematoencefálica in vitro

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

Um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica baseado em uma co-cultura de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato e astrócitos é descrito e validado. Este sistema mostrou-se uma ferramenta válida para estudar o efeito da nanoformulação na permeação transbarreira de moléculas fluorescentes.

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Um baixo custo, o sistema easy-to-use e poderoso é estabelecida para avaliar potenciais tratamentos que possam amenizar violação sangue barreira retina induzida pela histamina. vazamento dos vasos sanguíneos, a ativação de células Müller e a continuidade dos processos neuronais são utilizados para avaliar a resposta a danos e sua reversão com uma droga potencial, lipoxina A4.

Um Modelo aguda da retina para a Avaliação sanguíneos da retina barreira Descumprimento e potenciais fármacos para o tratamento

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

Aprenda um ensaio de transcitose em células endoteliais para avaliar a permeabilidade da barreira interna sangue-retina usando células HRMECs. Este método in vitro permite estudar mecanismos moleculares sem uso de animais.

Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

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