Name: Transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo utilizando manguitos vasculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda o transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos utilizando manguitos vasculares para melhorar o fluxo sanguíneo laminar e reduzir a formação de trombos. Este método aumenta as taxas de sobrevivência e facilita o monitoramento pós-transplante.

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A DK é apoiada pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Veterans Administration Merit Review grant 1I01BX002730 e The Foundation for Barnes-Jewish Hospital.

Todos os procedimentos de manuseio de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do NIH Care and Use of Laboratory Animals e aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Corações de camundongos C57BL/6 (B6) e BALB/c (pesando 20-25 g) foram transplantados para receptores B6 pareados por sexo (6-8 semanas de idade). Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Transplantes singênicos foram realizados para avaliar as respostas celulares relacionadas à lesão de isquemia-reperfusão, e transplantes alogênicos foram realizados para investigar os mecanismos imunológicos envolvidos na tolerância e rejeição do enxerto. Camundongos repórteres de proteína fluorescente verde M-verde B6 lisozima (LysM-GFP)17, originalmente obtidos de Klaus Ley do Instituto La Jolla de Alergia e Imunologia, La Jolla, CA, e posteriormente criados em nossas instalações, foram usados como receptores para experimentos selecionados para visualizar a infiltração de neutrófilos em enxertos cardíacos. A cirurgia de sobrevida foi realizada por meio de procedimentos assépticos.
1. Procedimento do doador
<ol><li>Anestesiar os ratinhos injetando cetamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) por via intraperitoneal no rato dador. Confirme o plano cirúrgico da anestesia com pinça do dedo do pé e da cauda.</li>
	<li>Prepare a área cirúrgica raspando o cabelo do peito e do abdômen usando uma navalha elétrica.</li>
	<li>Administrar 100 unidades de heparina (ver Tabela de Materiais) por via intravenosa na veia peniana (machos) ou veia jugular externa (machos ou fêmeas).</li>
	<li>Coloque os ratos em decúbito dorsal com os membros dianteiros por cima. Fixar os membros anteriores e posteriores com fita cirúrgica e desinfetar a pele com três esfoliantes alternados de iodo a 0,75% e etanol a 70%.</li>
	<li>Realizar uma incisão, laparoesternotomia mediana, do umbigo ao ângulo esternal (3-4 cm), seguida de toracotomia bilateral ao longo de cada margem costal (2 cm bilateralmente). Dobre a parede torácica anterior sobre o pescoço para exposição total do mediastino.</li>
	<li>Extirpar o timo e expor a veia cava inferior intratorácica.</li>
	<li>Transecto através da largura da aorta abdominal para exsanguinação.</li>
	<li>Para perfusão retrógrada, injetar 1,5 mL de solução salina 4 °C na veia cava inferior intratorácica com a agulha orientada superiormente em direção ao enxerto, conforme descrito anteriormente13.</li>
	<li>Ligue a veia cava superior usando um 8-0 sutura de seda e dividir distalmente.</li>
	<li>Repetir a perfusão retrógrada injetando mais 1,5 mL de solução salina 4 °C através da veia cava inferior.</li>
	<li>Ligue a veia cava inferior usando um 8-0 sutura de seda e dividir distalmente.</li>
	<li>Dissecar o arco aórtico e o tronco da artéria pulmonar para a retirada do enxerto e transecto ambos distalmente. Ligue as veias pulmonares na superfície posterior do coração usando uma sutura de seda 6-0 e divida distalmente.</li>
	<li>Realize a preparação do enxerto removendo o coração do doador da cavidade torácica. Colocar o coração excisado num recipiente de plástico cheio de solução salina heparinizada a 4 °C durante 1-2 min. Transferir o enxerto para um frasco plástico estéril cheio de gelo para colocação do manguito (Figura 1A). NOTA: O enxerto cardíaco precisa permanecer no frasco por aproximadamente 5 minutos para colocar o manguito da artéria pulmonar do doador.</li>
	<li>Coloque um manguito angiocateter 20 G de 1 mm de comprimento (ver Tabela de Materiais) sobre a artéria pulmonar para o manguito do doador. Usando pinça fina, dobre suavemente as bordas da artéria de volta sobre o manguito. Prenda o vaso dobrado ao manguito com uma gravata de nylon 10-0, conforme descrito anteriormente18 (Figura 1B,C).</li>
	<li>Conservar o coração do dador em solução salina heparinizada ou noutra solução de conservação a 4 °C. NOTA: Embora alguns possam preferir soluções de preservação específicas (por exemplo, a solução da Universidade de Wisconsin) para preservação isquêmica prolongada, pode ser caro19. A solução salina pode ser uma alternativa adequada para curtos períodos de isquemia (<1 h)20. Em última análise, a escolha da solução de preservação depende do desenho experimental21.</li>
</ol>2. Procedimento do destinatário
<ol><li>Injete cetamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg) por via intraperitoneal no rato receptor para anestesia. Injete buprenorfina de liberação sustentada (0,5-1,0 mg/kg) por via subcutânea para analgesia. Confirme o plano cirúrgico da anestesia com pinça do dedo do pé e da cauda.</li>
	<li>Prepare a área cirúrgica raspando o cabelo da área cervical usando uma navalha elétrica. Aplique pomada oftálmica estéril e não medicamentosa nos olhos para evitar o ressecamento da córnea.</li>
	<li>Coloque o animal em decúbito dorsal com os membros anteriores adjacentes ao corpo e a cabeça ligeiramente virada para a esquerda. Prenda os membros anteriores e posteriores com fita cirúrgica. Desinfete a pele com três esfoliantes alternados de iodo a 0,75% e etanol a 70%.</li>
	<li>Faça uma incisão cervical na linha média da mandíbula inferior até o esterno.</li>
	<li>Transect o músculo esternocleidomastóideo direito. Excise o lobo direito da glândula submandibular para criar espaço para o implante do enxerto.</li>
	<li>Amarre um nó escorregadio sobre a veia jugular externa proximal usando uma sutura de seda 6-0. Ligue a veia jugular externa distal e os ramos adjacentes usando um 8-0 sutura de seda. Faça uma incisão transversal através da parede anterior da veia jugular externa.</li>
	<li>Colocar uma sutura de nylon 10-0 através da borda da veia jugular externa proximal e do tecido subjacente para fixar a veia durante a inserção do manguito (Figura 1D).</li>
	<li>Lige a artéria carótida comum direita distal usando um 8-0 sutura de seda logo inferior à bifurcação carotídea. Amarre um nó escorregadio sobre a artéria carótida comum proximal usando uma sutura de seda 6-0. Transectar a artéria distalmente entre as suturas.</li>
	<li>Semelhante ao manguito do doador, coloque um manguito angiocateter 24 G de 0,6 mm de comprimento sobre a artéria carótida comum direita do receptor. Usando pinça fina, dobre suavemente as bordas da artéria de volta sobre o manguito. Prenda o recipiente dobrado ao manguito usando uma gravata de nylon 10-0.</li>
	<li>Coloque o coração do doador superior à área cervical direita.</li>
	<li>Goteje solução salina fria no enxerto cardíaco a cada poucos minutos durante a implantação.</li>
	<li>Colocar uma sutura de nylon 10-0 através da borda da aorta doadora e através de uma mordida superficial do tecido subjacente para fixar o enxerto no lugar (Figura 1E).</li>
	<li>Lavar a aorta do doador com 0,5 mL de solução salina heparinizada a 0,9%.</li>
	<li>Insira o manguito comum da artéria carótida do receptor na aorta do doador. Proteja a anastomose com um 8-0 gravata de seda (Figura 1F). Remova a sutura da âncora aórtica.</li>
	<li>Desaire a veia jugular externa lavando a veia jugular externa do receptor com 0,5 mL de solução salina heparinizada a 0,9%.</li>
	<li>Realizar anastomose da artéria pulmonar inserindo o manguito da artéria pulmonar doadora na veia jugular externa do receptor e segurar com um 8-0 gravata de seda (Figura 1G). Remova a sutura da âncora da veia jugular externa e transecte a parede posterior restante da veia jugular externa para liberar o enxerto do tecido subjacente. Certifique-se de que o enxerto esteja devidamente orientado sem torção ou torção das anastomoses.</li>
	<li>Solte os nós escorregadios na veia jugular externa do receptor seguido da artéria carótida comum para iniciar a reperfusão do enxerto cardíaco (Figura 1H).</li>
	<li>Feche a incisão da pele cervical usando uma sutura de nylon 6-0 interrompida.</li>
</ol>3. Cuidados pós-operatórios
<ol><li>Coloque o receptor em uma câmara de recuperação quente imediatamente após a cirurgia e monitore de perto até que esteja totalmente recuperado da anestesia (aproximadamente 1 h).</li>
	<li>Continue a monitorar de perto o animal (a cada 6-8 h) por pelo menos 72 h após a cirurgia para sinais de comportamento anormal, como letargia, tremores, respiração rápida ou anorexia.</li>
	<li>Para o controle da dor, injete carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea a cada 8-12 h para analgesia, além de buprenorfina subcutânea (0,05 mg/kg) a cada 8-12 h por 24-48 h a partir do final da cirurgia.</li>
</ol>4. Imagem intravital de dois fótons do tráfico de leucócitos no enxerto cardíaco
<ol><li>Injetar cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (8-10 mg/kg) por via intraperitoneal em um camundongo receptor de B6 LysM-GFP17 2 h após reperfusão do enxerto para anestesia.</li>
	<li>Realizar a intubação orotraqueal com angiocateter 20 G, conforme descrito anteriormente18.</li>
	<li>Conecte o angiocateter à tubulação de um ventilador mecânico de camundongo e ventile com ar ambiente a uma taxa de 120 respirações/min e um volume corrente de 0,5 mL18.</li>
	<li>Injete 12 μL de pontos quânticos não direcionados de 655 nm (ver Tabela de Materiais), suspensos em 50 μL de PBS por via intravenosa, conforme descrito anteriormente13.</li>
	<li>Reabra a incisão do pescoço para expor o enxerto cardíaco. Coloque o rato numa câmara de estabilização.</li>
	<li>Prenda uma parte da parede livre do ventrículo esquerdo usando um anel fino de adesivo de tecido (ver Tabela de Materiais), aplicado a uma tampa de vidro presa à placa da câmara superior.</li>
	<li>Colocar a câmara sob a objetiva do microscópio de dois fótons para aquisição de imagens e vídeos, conforme descrito anteriormente13.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+heart+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for heart transplantation in the rat.</a> The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).</li>
<li>Ono, K., Lindsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heart transplantation in rats.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice.</a> Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).</li>
<li>Heron, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+accessory+cervical+heart+transplantation+in+rabbits+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pathologica+Microbiologica+Scandinavica+Section+A+Pathology%22%5BJournal%5D)">A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats.</a> Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Section A Pathology. 79 (4), 366-372 (1971).</li>
<li>Chen, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+of+cervical+heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice.</a> Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).</li>
<li>Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+mouse+cervical+heart+transplantation+using+a+cuff+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique.</a> Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuff+anastomosis+of+both+renal+artery+and+vein+to+minimize+thrombosis%3A+a+novel+method+of+kidney+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cuff anastomosis of both renal artery and vein to minimize thrombosis: a novel method of kidney transplantation in mice.</a> Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 56-60 (2022).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heterotopic+cervical+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice.</a> Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).</li>
<li>Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+technique+for+heterotopic+vascularized+cervical+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice.</a> Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).</li>
<li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cervical+heart+transplantation+model+using+a+modified+cuff+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).</li>
<li>Ratschiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+cervical+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Heterotopic cervical heart transplantation in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52907(2015).</li>
<li>Mao, X., Xian, P., You, H., Huang, G., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+cuff+technique+for+mouse+cervical+heterotopic+heart+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A modified cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation model.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e63504(2022).</li>
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<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+monocytic+cells+in+regressing+atherosclerotic+plaques+by+intravital+2-photon+and+positron+emission+tomography-based+imaging-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (5), 1030-1036 (2018).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+transplant+acceptance+is+facilitated+by+early+events+in+the+graft+and+is+associated+with+lymphoid+neogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung transplant acceptance is facilitated by early events in the graft and is associated with lymphoid neogenesis.</a> Mucosal Immunology. 5 (5), 544-554 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Krupnick, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+lung+transplantation+as+experimental+methodology+to+study+transplant+and+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology.</a> Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).</li>
<li>Westhofen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterotopic+heart+transplantation+in+mice+as+a+small+animal+model+to+study+mechanical+unloading+-+Establishment+of+the+procedure%2C+perioperative+management+and+postoperative+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring.</a> PLoS One. 14 (4), 0214513(2019).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+cuff+technique+for+murine+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of the cuff technique for murine heart transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61103(2020).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Utilizando esta técnica, o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo pode ser realizado em menos de 40 minutos por um microcirurgião experiente e em aproximadamente 60 minutos por um microcirurgião de nível básico. Embora o transplante cardíaco cervical tenha sido estudado em numerosos modelos animais, um modelo de camundongo continua sendo o padrão-ouro devido a múltiplas cepas genéticas bem definidas, capacidades de alteração genética e disponibilidade de numerosos reagentes, incluindo anticorpos monoclo...

Abbott et al. publicaram1 a primeira descrição do transplante cardíaco abdominal heterotópico em ratos em 1964. Essas técnicas cirúrgicas foram refinadas e simplificadas por Ono et al., em 19692. Corry et al. descreveram pela primeira vez um método para transplante cardíaco abdominal heterotópico em camundongos em 1973; semelhante aos modelos de ratos relatados anteriormente, envolveu enxerto no abdome do hospedeiro com revascularização por anastomoses end-to-side da artéria pulmonar do doador e aorta ascendente para a veia cava inferior e aorta abdominal do receptor, respectivamente3. O transplante cardíaco cervical heterotópico em ratos foi descrito por Heron em 1971 com manguitos de Teflon feitos de cateteres intravenosos de 16 G (1,6 mm de diâmetro externo)4. Chen5 e Matsuura et al.6 relataram posteriormente transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos em 1991, cujas técnicas diferiam principalmente em seu método de re-anastomose. A abordagem de Chen envolveu anastomoses suturadas da aorta ascendente do doador para a artéria carótida do receptor e da artéria pulmonar do doador para a veia jugular externa do receptor5. Devido à habilidade técnica avançada necessária para essas anastomoses microcirúrgicas suturadas, uma quantidade significativa de tempo e experiência foi necessária para alcançar uma alta taxa de sucesso. Matsuura et al. descreveram um método utilizando uma técnica de manguito sem sutura, semelhante à utilizada por Heron, que envolveu anastomoses de ponta a ponta utilizando a colocação extraluminal de manguitos. Confeccionou manguitos de Teflon a partir de cateteres intravenosos de 22 G (0,8 mm de diâmetro externo) e 24 G (0,67 mm de diâmetro externo) e colocou-os sobre a veia jugular externa e a artéria carótida comum do receptor, respectivamente6. Esses manguitos foram então colocados dentro da artéria pulmonar e da aorta do doador e fixados amarrando uma ligadura de sutura ao redor da conexão. Esta abordagem traduziu-se numa melhor taxa de sucesso. Mais importante ainda, resultou em um encurtamento do tempo necessário para completar ambas as anastomoses cervicais, reduzindo assim o tempo isquêmico quente do enxerto para menos de um terço do que utiliza o método de sutura abdominal. Além disso, como os manguitos são colocados ao redor da superfície externa do vaso, não há corpo estranho exposto à luz do vaso, o que reduz em grande parte a possibilidade de trombose após a cirurgia7. Enquanto isso, a utilização da técnica do manguito fornece suporte ao redor dos vasos no local da anastomose sem a necessidade de sutura, o que reduz o risco de sangramento após a revascularização6.
Numerosas revisões desta técnica foram propostas. Para acomodar o curto comprimento da artéria carótida comum do camundongo (aproximadamente 5 mm), Tomita et al.8 desenvolveram uma modificação dessa técnica com um manguito arterial menor (0,6 mm de diâmetro externo), omitindo suturas de retenção e puxando a artéria diretamente através do manguito com pinça fina. Wang et al. simplificaram ainda mais essa abordagem, colocando manguitos 22 G e 24 G na artéria pulmonar direita do doador e na artéria carótida comum direita do receptor, respectivamente9. Vários relatos descreveram modificações nessas abordagens, incluindo o uso de manguitos especializados, grampos microcirúrgicos, dilatadores de vasos e cardioplegia10,11,12. Notavelmente, todos esses métodos envolvem a circulação retrógrada do sangue através do coração, com o sangue fluindo da artéria carótida comum receptora para a aorta doadora, as artérias coronárias, o seio coronário, esvaziando então para o átrio direito e saindo da artéria pulmonar para a veia jugular externa receptora.
Em comparação com o enxerto no abdômen, o transplante cardíaco cervical oferece múltiplas vantagens. Como mencionado anteriormente, a exposição cervical permite uma revascularização mais rápida e tempos isquêmicos quentes mais curtos6. O método cervical também é menos invasivo e está associado a menores tempos de recuperação pós-operatória, pois evita uma laparotomia6. É importante ressaltar que anastomoses de ponta a ponta com manguitos podem ser realizadas em vez de anastomoses de ponta a ponta, o que diminui o risco de complicações como sangramento anastomótico. A abordagem abdominal também representa um risco aumentado de desenvolver complicações trombóticas na aorta abdominal ou veia cava inferior, levando a isquemia da medula espinhal e paralisia dos membros posteriores. A localização cervical superficial do transplante permite fácil acesso à avaliação da viabilidade do enxerto por palpação, eletrocardiografia e imagens invasivas ou não invasivas. Embora os enxertos cervicais retomem a atividade cardíaca espontânea após a reperfusão, eles não afetam significativamente os parâmetros sistólicos e diastólicos do receptor. Este modelo fornece informações valiosas para o estudo das respostas celulares após o transplante, como lesão de isquemia-reperfusão e rejeição do enxerto. Além disso, este modelo oferece uma abordagem ideal para permitir imagens pós-transplante, como microscopia intravital de dois fótons ou tomografia por emissão de pósitrons (PET). Para tanto, nosso laboratório já relatou métodos de imagem de tecidos e órgãos em movimento em camundongos, incluindo batimento de corações murinos e enxertos de arco aórtico após transplante cervical heterotópico para visualizar o tráfico de leucócitos durante lesão de isquemia-reperfusão e dentro de placas ateroscleróticas, respectivamente13,14,15 . Além disso, devido à sua localização superficial e facilidade de exposição, esse modelo é adequado para o retransplante cardíaco16.
Este relato descreve uma técnica que permite o fluxo sanguíneo laminar com a colocação externa dos manguitos vasculares nos vasos de onde se origina o fluxo sanguíneo. Isso permite uma transição suave do fluxo sanguíneo de um vaso para o outro, evitando a exposição da borda do vaso distal no lúmen vascular. Além disso, a técnica utiliza um manguito maior de 20 G, em vez de manguitos de 22 G usados anteriormente, para a artéria pulmonar doadora para garantir amplo retorno do fluxo sanguíneo para o receptor.

<table><tbody><tr><td>Gravatas de seda trançada 6-0</td><td>Henry Schein Inc</td><td>7718729</td><td></td></tr><tr><td>0,75% Esfoliante de iosina de proviodona</td><td>Priority Care Inc</td><td>NDC 57319-327-0</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de nylon 10-0</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>AK-0106</td><td></td></tr><tr><td>655-nm Q-dots não direcionados</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Pharmco Products Inc</td><td>111000140</td><td></td></tr><tr><td>Gravatas de seda trançada 8-0</td><td>Henry Schein Inc</td><td>1005597</td><td></td></tr><tr><td>pinça Adson</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91127-12</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c e C57BL/6 camundongos (6-8 semanas)</td><td>Coagulador bipolar Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Valleylab Inc</td><td>SurgII-20, E6008/E6008B</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de carprofeno (Rimadyl)</td><td>Transpharm</td><td>35844</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno (Rimadyl) comprimido mastigável oral</td><td>Transpharm</td><td>38995/37919</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio 2P personalizado executando o software de aquisição ImageWarp</td><td>A & B Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont no. 5 fórceps</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola estilo vannas fina</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>Sun Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha Halsey</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito braçadeira ponta curva</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91309-12</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus ventilador de mouse modelo 687</td><td>Harvard Apparatus</td><td>MA1 55-0001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de heparina (100 U/mL)</td><td>Abraxis Pharmaceutical Products</td><td>504031</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Cetamina Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(50 mg/kg)</td><td>Wyeth</td><td>206205-01</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio&mdash; Leica Wild M651 &vezes; 6&ndash; Tesoura</td> de mola extra fina <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td>Moria de 40 ampliações</tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Ohio vaporizador de isoflurano</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000i</td><td></td></tr><tr><td>Qdots</td><td>ThermoFisher</td><td>1604036</td><td></td></tr><tr><td>S& T SuperGrip Fórceps ponta angular</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>S & T SuperGrip Forceps ponta reta</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina normal estéril (0,9% (peso / volume) cloreto de sódio</td><td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>Pontas Q estéreis (mini aplicadores cônicos com ponta de algodão de 3 polegadas)</td> <td>Puritan Medical Company LLC</td><td>823-WC</td><td></td></tr><tr><td>Surflow 20 gauge 1/4 de polegada Teflon angiocatheter</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>SR-OX2032CA</td><td></td></tr><tr><td>Angiocateter de Teflon Surflow 24 gauge 3/4 de polegada</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>R-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>ThermoCare Small Animal ICU System (configurações de recuperação 3 L/min O2, 80 &deg; C, 40% de umidade)</td><td>Thermocare Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VetBond</td><td>Santa Cruz Biotechnology SC361931</td><td>NC0846393</td><td></td></tr><tr><td>xilazina (10 mg/kg)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo utilizando manguitos vasculares

Mouse Heterotopic Cervical Cardiac Transplantation Utilizing Vascular Cuffs

Modelos murinos de transplante cardíaco são frequentemente utilizados para estudar a lesão de isquemia-reperfusão, as respostas imunes inatas e adaptativas após o transplante e o impacto das terapias imunomoduladoras na rejeição do enxerto. O transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos foi descrito pela primeira vez em 1991 usando anastomoses suturadas e posteriormente modificado para incluir técnicas de manguito. Essa modificação permitiu melhores taxas de sucesso e, desde então, houve vários relatórios que propuseram melhorias técnicas adicionais. No entanto, a tradução para uma utilização mais difundida permanece limitada devido à dificuldade técnica associada às anastomoses do enxerto, que requer precisão para alcançar o comprimento e o calibre adequados dos manguitos para evitar torção anastomótica vascular ou tensão excessiva, o que pode resultar em danos ao enxerto. O presente protocolo descreve uma técnica modificada para a realização de transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos que envolve a colocação do manguito na artéria carótida comum do receptor e na artéria pulmonar do doador em alinhamento com a direção do fluxo sanguíneo.

Este modelo de transplante cardíaco heterotópico cervical de camundongos tem sido utilizado para realizar mais de 1.000 transplantes em nosso laboratório, com uma taxa de sobrevida de aproximadamente 97%. A taxa de sucesso é ligeiramente maior do que relatos anteriores utilizando outras técnicas de transplante cardíaco heterotópico cervical em camundongos10,11,20. Isso poderia ser atribuído ao manguito maior de 20 G colocado na ...

Modelos de transplante cardíaco de camundongos representam valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo da imunologia do transplante. O presente protocolo detalha o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongos que envolve a colocação de manguitos na artéria carótida comum do receptor e no tronco da artéria pulmonar do doador para permitir o fluxo sanguíneo laminar.

Transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo utilizando manguitos vasculares

Murine models of cardiac transplantation are frequently utilized to study ischemia-reperfusion injury, innate and adaptive immune responses after ...

Nossa colocação do manguito vascular permite o fluxo sanguíneo laminar e utilizamos um manguito maior para a artéria pulmonar doadora para garantir amplo retorno sanguíneo aos receptores. Essas modificações utilizadas neste protocolo diminuem a probabilidade de fluxo sanguíneo turbulento e formação de trombos e resultam em melhores taxas de sobrevivência. Este método fornece informações valiosas para o estudo de respostas imunes após o transplante, como lesão de isquemia reperfusão e rejeição do enxerto.Além disso, nossa técnica permite um monitoramento ou retransplante pós-transplante mais fácil. Demonstrando este procedimento será o Dr. Wen Jun Li, um microcirurgião especialista em nosso laboratório que desenvolveu esta técnica. Prepare a área cirúrgica raspando o cabelo do peito e do abdômen usando uma navalha elétrica.Administrar 100 unidades de heparina por via intravenosa na veia peniana para machos ou veia jugular externa para machos e fêmeas. Coloque os ratos em decúbito dorsal com os membros dianteiros por cima. Fixe os membros anteriores e posteriores com fita cirúrgica e desinfete a pele com iodo a 0,75% e etanol a 70%.Realizar uma incisão para a laparoesternotomia mediana do umbigo ao ângulo esternal, seguida de uma toracotomia bilateral ao longo de cada margem costal. Dobre a parede torácica anterior sobre o pescoço para exposição total do mediastino. Extirpar o timo e expor a veia cava inferior intratorácica.Para perfusão retrógrada, injete 1,5 mililitros de solução salina de quatro graus Celsius na veia cava inferior intratorácica com a agulha orientada superiormente em direção ao enxerto. Ligue a veia cava superior usando um 8-0 sutura de seda e dividir distalmente. Repita a perfusão retrógrada injetando mais 1,5 mililitros de solução salina de quatro graus Celsius através da veia cava inferior.Ligue a veia cava inferior usando um 8-0 sutura de seda e dividir distalmente. Dissecar o arco aórtico e o tronco da artéria pulmonar para a retirada do enxerto e transecto ambos distalmente. Ligue as veias pulmonares na superfície posterior do coração usando uma sutura de seda 6-0 e divida distalmente.Realize a preparação do enxerto removendo o coração do doador da cavidade torácica. Coloque o coração excisado em um recipiente de plástico cheio de solução salina heparinizada de quatro graus Celsius por um a dois minutos. Transferir o enxerto para um balão de plástico estéril cheio de gelo para colocação do manguito.Coloque um manguito angiocateter de calibre 20 milímetros de comprimento sobre a artéria pulmonar para o manguito doador. Usando pinça fina, dobre suavemente as bordas da artéria de volta sobre o manguito. Prenda o recipiente dobrado ao manguito usando uma gravata de nylon 10-0.Armazenar o coração do doador em solução salina heparinizada ou outra solução de preservação a quatro graus Celsius. Prepare a área cirúrgica raspando o cabelo da área cervical usando uma navalha elétrica. Aplique pomada oftálmica estéril não medicamentosa nos olhos para evitar a secagem da córnea.Coloque o animal em decúbito dorsal com os membros anteriores adjacentes ao corpo e a cabeça ligeiramente virada para a esquerda. Prenda os membros anteriores e posteriores com fita cirúrgica. Desinfete a pele com iodo a 0,75% e etanol a 70%.Depois de fazer uma incisão cervical da linha média da mandíbula inferior para o esterno, transecte o músculo esternocleidomastóideo direito. Extirpar o lobo direito da glândula inframandibular para criar espaço para o implante do enxerto. Amarre um nó escorregadio sobre a veia jugular externa proximal usando uma sutura de seda 6-0.Ligue a veia jugular externa distal e os ramos adjacentes usando um 8-0 sutura de seda. Sutura sob a veia e cubra com gaze. Faça uma incisão transversal através da parede anterior da veia jugular externa.Coloque uma sutura de nylon 10-0 através da borda da veia jugular externa proximal e do tecido subjacente para proteger a veia durante a inserção do manguito. Lige a artéria carótida comum direita distal usando um 8-0 sutura de seda logo inferior à bifurcação carotídea. Amarre um nó escorregadio sobre a artéria carótida comum proximal usando uma sutura de seda 6-0.Transectar a artéria distalmente entre as suturas. Em seguida, coloque um manguito angiocateter de calibre 24 de 0,6 mililitro de comprimento sobre a artéria carótida comum direita do receptor. Usando pinça fina, dobre suavemente as bordas da artéria de volta sobre o manguito.Prenda o recipiente dobrado ao manguito usando uma gravata de nylon 10-0. Coloque o coração do doador superior à área cervical direita. Goteje solução salina fria no enxerto cardíaco a cada poucos minutos durante a implantação.Coloque uma sutura de nylon 10-0 através da borda da aorta do doador e através de uma mordida superficial do tecido subjacente para fixar o enxerto no lugar. Lavar a aorta doadora com 0,5 mililitros de solução salina heparinizada a 0,9%. Insira o manguito comum da artéria carótida do receptor na aorta do doador.Proteja a anastomose com um 8-0 gravata de seda. Remova a sutura da âncora aórtica. Desaire a veia jugular externa lavando a veia jugular externa do receptor com 0,5 mililitros de solução salina heparinizada a 0,9%.Realizar anastomose da artéria pulmonar inserindo o manguito da artéria pulmonar doadora na veia jugular externa do receptor e segurar com um 8-0 gravata de seda. Remova a sutura da âncora da veia jugular externa e transecte a parede posterior restante da veia jugular externa para liberar o enxerto do tecido subjacente. Certifique-se de que o enxerto esteja devidamente orientado sem torção ou torção da anastomose.Solte os nós escorregadios na veia jugular externa do receptor, seguido pela artéria carótida comum para iniciar a reperfusão do enxerto cardíaco. A técnica demonstrada neste protocolo mostrou uma taxa de sobrevida de aproximadamente 97%Isso poderia ser potencialmente atribuído ao manguito maior de calibre 20 colocado na artéria pulmonar doadora para garantir amplo retorno do fluxo sanguíneo para o receptor. Além disso, o alinhamento do fluxo sanguíneo com a colocação do manguito na presente técnica minimiza o risco de trombose e turbulência anastomótica.O tempo médio de operação do receptor foi de aproximadamente 37 minutos, com um tempo médio de isquemia fria de 20 minutos. Para os estudos de sobrevida, os enxertos cardíacos foram avaliados diariamente por visualização direta e palpação digital dos batimentos cardíacos. Imagens intravitais de dois fótons foram realizadas logo após o transplante para avaliar o tráfico de leucócitos.É importante verificar se o enxerto está devidamente posicionado e orientado antes do fechamento da pele para evitar torções. Este método pode ser usado em modelos de retransplante para identificar células imunes residentes em enxertos transplantados que medeiam respostas aloimunes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O modelo de transplante de coração de murídeo cervical é bem adequado para imunológico, bem como estudos de lesão de reperfusão de isquemia. Nós modificamos o procedimento usando uma técnica cuff não sutura e realizou mais de 1.000 transplantes de sucesso com essa abordagem.  Aqui, nós fornecemos mais detalhes desta técnica para complementar o vídeo.

Murino Cervical Modelo de coração Transplante usando uma técnica Cuff Modificado

A técnica do manguito encurta e facilita o modelo de transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos, evitando anastomoses de sutura tecnicamente desafiadoras de pequenos vasos. Os detalhes técnicos mostrados neste vídeo devem permitir que as pesquisas estabeleçam esse modelo em seus laboratórios.

Heterotopic Cervical Transplante Cardíaco em Ratos

Aqui, apresentamos um protocolo de transplante heterotópico da aorta em camundongos usando a técnica de manguito não sutura em um modelo de urina cervical. Este modelo pode ser usado para estudar a patologia subjacente da vasculopatia aloenxerto crônica (CAV) e pode ajudar a avaliar novos agentes terapêuticos, a fim de evitar a sua formação.

Murine Modelo de Transplante de Aorta Cervical usando uma técnica de manguito não sutura modificada

Introduzimos uma abordagem interna do tubo da técnica de manguito para transplante de coração heterotópico cervical do rato para ajudar a everter o vaso sobre a braçadeira. Descobrimos que a cooperação entre dois cirurgiões experientes diminui significativamente o tempo de operação.

Otimização da Técnica de Manguito para Transplante de Coração de Murine

No presente protocolo, um modelo de transplante cardíaco em camundongos é utilizado para investigar o mecanismo de rejeição do enxerto cardíaco. Neste modelo heterotópico de transplante cardíaco, a eficiência da operação é melhorada, e a sobrevida dos enxertos cardíacos é garantida por uma anastomose cervical término-terminal do implante cardíaco usando uma técnica de Cuff modificada.

Técnica de Cuff Modificada para Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Cervical:

Este protocolo fornece informações técnicas para a reconstrução de vasos usando a técnica do manguito no transplante hepático ortotópico de camundongos.

Reconstrução Vascular com a Técnica do Manguito no Transplante Hepático Ortotópico de Camundongo

Este protocolo apresenta uma técnica de transplante cervical heterópico de coração heterópico sem manguito e baseada em sutura em camundongos, projetada para permitir a colocação confiável de um segundo enxerto cardíaco heterotópico para avaliação da tolerância imunológica específica do doador sob condições fisiológicas com interferência mínima de material estranho.

Modelo cervical sem sutura para transplante cardíaco heterotópico secundário para avaliar a tolerância imunológica específica do doador em camundongos

Este protocolo apresenta uma técnica simplificada de anastomose de sutura ponta a ponta para transplante cardíaco cervical murino, fornecendo um modelo robusto e reprodutível para o estudo da imunologia de transplantes.

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Aqui nós descrevemos o rato ortotópico membro-hind procedimento de transplante, o que parece ser o padrão...

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Este método para isolar células do sistema imunológico funcional do coração fornece uma alternativa aos métodos convencionais de digestão da colagenase, que causa a ativação de células imunes indesejadas, resultando em uma capacidade de resposta diminuiu dessas células. Nosso método de isolamento de rendimentos funcional cardíaca células do sistema imunológico, evitando os problemas associados com a digestão enzimática.

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Aprenda o transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos utilizando manguitos vasculares para melhorar o fluxo sanguíneo laminar e reduzir a formação de trombos. Este método aumenta as taxas de sobrevivência e facilita o monitoramento pós-transplante.

Transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo utilizando manguitos vasculares

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