A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas

A técnica peel-blot permite a separação de amostras biológicas crio-EM de várias camadas e concentradas em camadas únicas para reduzir a espessura, aumentar a concentração e facilitar o processamento da imagem. As concentrações das amostras podem ser aumentadas antes da preparação da grade, e o peel-blot pode ser ajustado para resultar em uma distribuição densa de espécimes de camada única para uma coleta de dados altamente eficiente. Para começar, empilhe dois pedaços de papel de filtro de 20 a 25 micrômetros de tamanho de poro e coloque um longo filme de parafina adjacente a ele com o papel voltado para cima.

Coloque um pedaço de papel de filtro submícron em cima de dois pedaços adicionais de papel de filtro. Posicione a pinça anticapilar com a perna dobrada virada para cima e a perna reta voltada para baixo e selecione uma grade de malha 600 com o lado liso ou brilhante para cima. Coloque a pinça em uma placa de Petri ou outra superfície elevada para evitar o contato da grade limpa com outros itens.

Retire o papel do filme de parafina e puxe os lados para criar uma pequena borda. Pipeta duas gotas de 150 microlitros para solução de 4% de trealose a cerca de um a dois centímetros de um lado curto do filme de parafina. As duas gotas devem estar a cerca de um centímetro de distância.

Em seguida, em um banco separado ou no chão, despeje nitrogênio líquido em um pequeno recipiente de espuma de poliestireno e coloque um pequeno recipiente de grade crio-EM no nitrogênio líquido. Cubra o recipiente de espuma de poliestireno com toalhetes sem fiapos. Para flutuar o filme de carbono da mica, use Dumont 5 Forceps e toque um lado da mica em um leve ângulo para baixo em uma das gotas de solução de trealose.

Mova a mica para baixo para deixar a tensão da água levantar o filme de carbono lentamente. Solte a mica uma vez que o filme de carbono flutua na superfície da gota. Inspecione visualmente o filme de carbono para evitar o uso de carbono com danos na forma de fraturas.

Insira a grade mantida pela pinça anticapilar em um ângulo de 20-30 graus em uma queda de trealose em uma posição adjacente e, em seguida, centralize a grade sob o filme de carbono. Pegue o filme de carbono, mantenha a grade na mesma orientação e abaixe lentamente a grade na superfície da segunda gota de trealose sem quebrar a tensão superficial da gota. Isso removerá o filme de carbono desnecessário que pode ter envolvido a borda da grade para o lado áspero.

Gire a pinça anticapilar e coloque-a em uma placa de Petri com o lado de carbono da grade voltado para baixo. Pipetar 1,3 microlitros da amostra para o menisco de trealose ligeira no topo da grade. Em seguida, pipete a solução aproximadamente 8-10 vezes para misturar e distribuir a trealose e a amostra em ambos os lados da grade.

Pipetar uma ou mais gotas de 1,7 microlitros de solução de trealose para a película de parafina enquanto incuba a solução de trealose da amostra na grelha durante um minuto. Gire a grade de volta à sua posição original com o filme de carbono voltado para cima e pressione a grade no papel de filtro submícron usando a pinça anticapilar. Uma vez que a solução tenha sido absorvida pelo papel de filtro e o filme de carbono esteja deitado, aguarde três segundos antes de levantar a grade e movê-la verticalmente para a gota de 1,7 microlitro de solução de trealose.

Essas etapas podem ser repetidas entre uma a três reiterações ou mais, dependendo da amostra. Coloque a grade nos dois pedaços de papel de filtro e, em seguida, levante a grade do papel de filtro. Após aproximadamente 13 segundos, dependendo da umidade e do tampão de amostra, mergulhe a grade no nitrogênio líquido no pequeno recipiente de isopor e coloque-a no recipiente de grade crio-EM ou transfira-a diretamente para triagem crio-EM ou coleta de dados.

Uma amostra de cristal 2D de leucotrieno C4 sintase humana submetida ao método peel-blot é mostrada aqui. A região à esquerda da seta foi amplamente reduzida a cristais 2D de camada única em uma região de contato entre o filme de carbono e a barra de grade que foi manchada e depois deslocada. A região à direita da seta não foi afetada pela mancha de casca.

A metade inferior da imagem representa as regiões com grandes bicamadas lipídicas fosfolípticas de camada única, resultantes da aplicação da mancha de casca. A metade superior não estava em uma zona de contato entre a barra de grade e o filme de carbono e, portanto, continha lipossomas completos com duas bicamadas fosfolipídicas. O quadrado da grade de uma grade de malha 400 mostra a pegada da barra de grade e as regiões descascadas resultantes, bem como as regiões que não estavam em contato com uma barra de grade ou submetidas a menos iterações de descascamento.

Essas imagens mostraram o apagamento de uma grade EM preparada pela injeção traseira em um papel de filtro submícron usando filme de carbono muito fino. As imagens são quadros únicos no contato inicial com a membrana, 1.000 milissegundos após o contato e 2.000 milissegundos após o contato. A seta indica quadrados de grade onde a pressão capilar rompeu o filme de carbono.

Evitar fraturas no filme de carbono e combinar papel de filtro submícron com uma gota de trealose de 1,7 microlitro para sucção e, em seguida, separar as camadas são etapas fundamentais. As amostras descascadas são utilizadas para a coleta de dados crio-EM de alta resolução, seguidas de processamento de imagem para a determinação da estrutura. O peel-blot permite a determinação estruturada de cristais 2D de proteína de camada única que anteriormente eram muito espessos para o crio-EM.

Além disso, pode concentrar várias amostras em camadas únicas em filme de carbono.