Name: A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a técnica peel-blot para preparação de amostras de crio-EM, separando camadas multicamadas em monocamadas. Este método reduz a espessura, aumenta a concentração e facilita o processamento de imagens de amostras biológicas.

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Parte deste trabalho foi apoiado pela subvenção do NIH HL090630 (ISK).

1. Etapas de preparação para a técnica peel-blot
NOTA: A preparação requer que os seguintes itens sejam colocados adjacentes uns aos outros.
<ol><li>Empilhe dois pedaços de papel de filtro de 20-25 μm de tamanho de poro (consulte Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloque uma película de parafina de ~8 cm x 10 cm de comprimento adjacente ao papel de filtro com o papel voltado para cima.</li>
	<li>Coloque um pedaço de papel de filtro submícron em cima de dois pedaços adicionais de papel de filtro #4 (Figura 1-1).</li>
	<li>Posicione a pinça anticapilar com a perna dobrada virada para cima e a perna reta voltada para baixo. Em seguida, selecione uma grade de 600 malhas com o lado liso/brilhante para cima. Coloque a pinça em uma placa de Petri ou outra superfície elevada para evitar o contato da grade limpa com outros itens.</li>
	<li>Retire o papel da película de parafina e puxe os lados (~ 5 mm) para criar uma pequena borda. Pipete duas gotas de 150 μL de solução de trealose a 4% ~1-2 cm de um lado curto do filme de parafina e ~1 cm de distância no filme de parafina.</li>
	<li>Em um banco separado ou no chão, despeje nitrogênio líquido em um pequeno recipiente de espuma de poliestireno (consulte Tabela de materiais). CUIDADO: Receba treinamento para o manuseio adequado usando luvas e um escudo facial, a fim de evitar a picada de gelo.</li>
	<li>Coloque um pequeno recipiente de grade crio-EM no nitrogênio líquido e cubra o recipiente de espuma de poliestireno com lenços sem fiapos.</li>
</ol>2. Colocando o filme de carbono na grade
<ol><li>Use a pinça Dumont #5 (ver Tabela de Materiais) para flutuar do filme de carbono da mica tocando um lado da mica em um leve ângulo para baixo (~20°-40°) em uma das gotas de solução de trealose e lentamente deixe a tensão da água levantar o filme de carbono movendo a mica para baixo. Solte a mica uma vez que o filme de carbono flutua na superfície da gota.</li>
	<li>Inspecione visualmente o filme de carbono para evitar o uso de carbono com danos na forma de fraturas.</li>
	<li>Insira a grade mantida pela pinça anticapilar em um ângulo (~20°-30°) em uma gota de trealose em uma posição adjacente e, em seguida, centralizada sob o filme de carbono. Pegue o filme de carbono (Figura 1-2).</li>
	<li>Mantenha a grade na mesma orientação e abaixe lentamente na superfície da segunda gota de trealose sem quebrar a tensão superficial da gota para remover o filme de carbono desnecessário que pode ter envolvido a borda da grade para o lado áspero.</li>
</ol>3. Separação de cristais 2D de várias camadas em camadas únicas
<ol><li>Gire a pinça anticapilar (ver Tabela de Materiais) e coloque-a em uma placa de Petri com o lado de carbono da grade voltado para baixo (Figura 1-3).</li>
	<li>Pipetar 1,3 μL da amostra para o menisco ligeiro de trealose no topo da grelha. Pipete a solução ~8-10 vezes para misturar e distribuir a trealose e a amostra em ambos os lados da grade.</li>
	<li>Durante a incubação da solução por 1 min, pipete uma ou mais gotas de 1,7 μL de solução de trealose no filme de parafina.</li>
	<li>Gire a grade de volta à sua posição original com o filme de carbono voltado para cima.</li>
	<li>Use a pinça anticapilar para pressionar a grade no papel de filtro submícron (Figura 1-4). Uma vez que a solução tenha sido absorvida pelo papel de filtro e o filme de carbono esteja deitado, aguarde 3s antes de levantar a grade e movê-la verticalmente para a gota de 1,7 μL de solução de trealose (Figura 1-5). Observação : repita esta etapa várias vezes para amostras altamente empilhadas ou a grade é preparada para vitrificação nas próximas etapas.</li>
	<li>Limpe a grade nos dois pedaços de papel de filtro e, em seguida, levante a grade do papel de filtro (Figura 1-6). Após aproximadamente 13 s, dependendo da umidade e do tampão de amostra, mergulhe a grade no nitrogênio líquido no pequeno recipiente de isopor e coloque a grade no recipiente de grade cryo-EM ou transfira-a diretamente para triagem crio-EM ou coleta de dados. NOTA: Para otimizar rapidamente o protocolo, manche negativamente a grade manchada por casca nesta etapa, em vez de mergulhá-la em nitrogênio líquido. Contamine negativamente a amostra aplicando 3 μL de acetato de uranila a 1% na grade, incube a grade por 30 s e a limpe com um pedaço rasgado de papel de filtro de tamanho de poro de 20-25 μm. Grades de cristais 2D vitrificados em trealose, tanino ou glicose são rotineiramente mergulhadas à mão para vitrificação, pois trealose, tanino e glicose impedem a formação de gelo cristalino a taxas usadas para mergulho manual2.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

O peel-blot é um método poderoso para superar o empilhamento e a espessura de cristais 2D de várias camadas e amostras semelhantes para coleta de dados crio-EM e processamento de imagens. Uma decisão sobre o uso do peel-blot será baseada em parâmetros biológicos da amostra e também exigirá avaliação assim que um modelo crio-EM 3D estiver disponível. A importância biológica dos contactos e a potencial flexibilidade das regiões de contacto serão particularmente importantes nesta avaliação.
O núm...

A técnica peel-blot foi desenvolvida com o objetivo de separar cristais bidimensionais empilhados de proteínas de membrana em camadas únicas para obter amostras adequadamente finas para coleta de dados crio-EM 2D e 3D e facilitar o processamento de imagens1. O protocolo é igualmente adequado para outros tipos de amostras multilamelares, bem como para alcançar altas concentrações de amostra de qualquer tipo de amostra na grade sem aumentar a espessura em Z.
A redução das camadas de amostra para uma camada é alcançada pela aplicação de uma combinação de pressão capilar e forças de cisalhamento em um protocolo que se estende substancialmente e modifica o método de retroinjeção2. Uma primeira etapa de blotting resulta em sanduíche apertado e aderência ao filme de carbono e uma barra de grade em ambos os lados da amostra de várias camadas durante a mancha em submícron, em vez do tamanho do poro de papel de filtro de 20-25μm no método de retroinjeção. A separação, ou descamação, de uma camada individual ocorre ao forçar a separação das camadas ensanduichadas uma vez que a grade é pressionada verticalmente em uma gota de trealose, forçando o filme de carbono para longe da barra de grade (Figura 1). O reposicionamento do filme de carbono para longe do ponto de contato original com a barra de grade ocorre na próxima etapa, quando a grade é novamente manchada em papel de filtro submícron. O número de iterações dessas etapas pode ser otimizado para amostras específicas. Além disso, o protocolo pode ser usado para aumentar as concentrações da amostra, evitando a agregação em Z. Devido à dependência da aderência à barra de grade e ao filme de carbono, bem como à separação forçada, essa abordagem pode não ser adequada para moléculas altamente frágeis, como certas proteínas delicadas e / ou instáveis e complexos proteicos.
A técnica peel-blot não requer equipamentos especializados nem suprimentos caros. A aplicabilidade a amostras específicas exigirá, no entanto, considerações cuidadosas sobre os parâmetros biológicos. A decisão é mais fácil para os cristais 2D, pois o filme de carbono é necessário para garantir a planicidade, mas a manipulação através da técnica peel-blot pode afetar a integridade biológica da amostra ou a ordem cristalina. A adequação da técnica peel-blot a partículas individuais é restrita e pode ser testada para aquelas que requerem filme de carbono e são estáveis à manipulação. Espécimes com interações biológicas críticas entre camadas podem não ser adequados para caracterização com a ajuda da técnica peel-blot devido à interrupção de tais interações.
A técnica peel-blot ("peel-blot") é mais rapidamente otimizada por testes e triagem com coloração negativa ou amostras não coradas por MET à temperatura ambiente. Uma vez que o número ideal de iterações de peel-blot tenha sido identificado, o tempo para controlar a espessura antes da vitrificação pode ser determinado.

<table><tbody><tr><td>Grades de 600 mesh</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>Pinça anticapilar</td><td>Ted Pella</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>Carbono para revestir mica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-EM</td><td></td><td></td><td>As grades Cryo-EM podem ser rastreadas a 120 kV ou 200 kV.&nbsp; Os dados de alta resolução são coletados a 300 kV.</td></tr><tr><td>Pinça Dumpont #5 Ted</td><td>Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de grade para armazenamento crio-EM</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mica de nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Ted</td><td>Pella</td><td>56</td><td>A mica é revestida de carbono e cortada em quadrados que são ligeiramente maiores do que uma grade TEM.&nbsp; A espessura do carbono pode exigir otimização para evitar carbono fino que se quebra facilmente após várias manchas de casca.</td></tr><tr><td>Mancha</td><td></td><td></td> negativa <td>1-2% de acetato de uranila é adequado para muitas amostras.&nbsp; Outras manchas, como o ácido fosfotúngstico, podem ser substituídas.</td></tr>Recipiente de poliestireno <tr><td>parafilme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Usado para vitrificar a grade de casca-borrão.<td></td><td></td><td> Um contêiner de transporte de poliestireno pode ser reciclado para esse fim e forrado com papel alumínio.</td></tr><tr><td>Papel de filtro submicrométrico</td><td>MilliporeSigma</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>Qualquer TEM operado a uma tensão de aceleração de 80-120 kV será adequado para triagem de grades manchadas negativamente.</td></tr><tr><td>Trealose</td><td></td><td></td><td>Prepare a solução de trealose a 4%.</td></tr><tr><td>Whatman #4 papel de filtro</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>Isso corresponde ao 20-25 &mu; papel de filtro do tamanho do poro de m no protocolo.</td></tr></tbody></table>

a técnica peel-blot: um método de preparação de amostras crio-em para separar camadas individuais de amostras biológicas multicamadas ou concentradas

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

A técnica de preparação de grade crio-EM peel-blot é um método de retroinjeção significativamente modificado com o objetivo de alcançar uma redução nas camadas de amostras de várias camadas. Essa remoção de camadas antes do congelamento por imersão pode ajudar a reduzir a espessura da amostra para um nível adequado para a coleta de dados crio-EM, melhorando a planicidade da amostra e facilitando o processamento da imagem. A técnica peel-blot permite a separação de membranas multilamelares em camadas únicas, de cristais 2D em camadas em cristais individuais e de estruturas empilhadas em forma de folha de proteínas solúveis para também serem separadas em camadas únicas. A alta espessura da amostra desses tipos de amostras frequentemente apresenta problemas insuperáveis para a coleta de dados crio-EM e processamento de imagem crio-EM, especialmente quando o estágio do microscópio deve ser inclinado para a coleta de dados. Além disso, grades de altas concentrações de qualquer uma dessas amostras podem ser preparadas para uma coleta de dados eficiente, uma vez que a concentração da amostra antes da preparação da grade pode ser aumentada e a técnica peel-blot ajustada para resultar em uma distribuição densa de amostra de camada única.

Um experimento bem-sucedido de peel-blot resultará em camadas únicas de amostras em concentrações muitas vezes altas. É de se esperar que algumas regiões na maioria dos quadrados de grade ainda contenham várias camadas, especialmente em menor número de iterações dos passos de peel-blot. A maioria dos quadrados de grade, no entanto, conterá extensas regiões de camadas únicas, como observado para cristais 2D de leucotrieno humano C4 sintase (Figura 2) e lipossomas (adicionados na etapa 3.2</...

A técnica peel-blot é um método de preparação de grade crio-EM que permite a separação de amostras biológicas multicamadas e concentradas em camadas únicas para reduzir a espessura, aumentar a concentração da amostra e facilitar o processamento da imagem.

A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

A técnica peel-blot permite a separação de amostras biológicas crio-EM de várias camadas e concentradas em camadas únicas para reduzir a espessura, aumentar a concentração e facilitar o processamento da imagem. As concentrações das amostras podem ser aumentadas antes da preparação da grade, e o peel-blot pode ser ajustado para resultar em uma distribuição densa de espécimes de camada única para uma coleta de dados altamente eficiente. Para começar, empilhe dois pedaços de papel de filtro de 20 a 25 micrômetros de tamanho de poro e coloque um longo filme de parafina adjacente a ele com o papel voltado para cima.Coloque um pedaço de papel de filtro submícron em cima de dois pedaços adicionais de papel de filtro. Posicione a pinça anticapilar com a perna dobrada virada para cima e a perna reta voltada para baixo e selecione uma grade de malha 600 com o lado liso ou brilhante para cima. Coloque a pinça em uma placa de Petri ou outra superfície elevada para evitar o contato da grade limpa com outros itens.Retire o papel do filme de parafina e puxe os lados para criar uma pequena borda. Pipeta duas gotas de 150 microlitros para solução de 4% de trealose a cerca de um a dois centímetros de um lado curto do filme de parafina. As duas gotas devem estar a cerca de um centímetro de distância.Em seguida, em um banco separado ou no chão, despeje nitrogênio líquido em um pequeno recipiente de espuma de poliestireno e coloque um pequeno recipiente de grade crio-EM no nitrogênio líquido. Cubra o recipiente de espuma de poliestireno com toalhetes sem fiapos. Para flutuar o filme de carbono da mica, use Dumont 5 Forceps e toque um lado da mica em um leve ângulo para baixo em uma das gotas de solução de trealose.Mova a mica para baixo para deixar a tensão da água levantar o filme de carbono lentamente. Solte a mica uma vez que o filme de carbono flutua na superfície da gota. Inspecione visualmente o filme de carbono para evitar o uso de carbono com danos na forma de fraturas.Insira a grade mantida pela pinça anticapilar em um ângulo de 20-30 graus em uma queda de trealose em uma posição adjacente e, em seguida, centralize a grade sob o filme de carbono. Pegue o filme de carbono, mantenha a grade na mesma orientação e abaixe lentamente a grade na superfície da segunda gota de trealose sem quebrar a tensão superficial da gota. Isso removerá o filme de carbono desnecessário que pode ter envolvido a borda da grade para o lado áspero.Gire a pinça anticapilar e coloque-a em uma placa de Petri com o lado de carbono da grade voltado para baixo. Pipetar 1,3 microlitros da amostra para o menisco de trealose ligeira no topo da grade. Em seguida, pipete a solução aproximadamente 8-10 vezes para misturar e distribuir a trealose e a amostra em ambos os lados da grade.Pipetar uma ou mais gotas de 1,7 microlitros de solução de trealose para a película de parafina enquanto incuba a solução de trealose da amostra na grelha durante um minuto. Gire a grade de volta à sua posição original com o filme de carbono voltado para cima e pressione a grade no papel de filtro submícron usando a pinça anticapilar. Uma vez que a solução tenha sido absorvida pelo papel de filtro e o filme de carbono esteja deitado, aguarde três segundos antes de levantar a grade e movê-la verticalmente para a gota de 1,7 microlitro de solução de trealose.Essas etapas podem ser repetidas entre uma a três reiterações ou mais, dependendo da amostra. Coloque a grade nos dois pedaços de papel de filtro e, em seguida, levante a grade do papel de filtro. Após aproximadamente 13 segundos, dependendo da umidade e do tampão de amostra, mergulhe a grade no nitrogênio líquido no pequeno recipiente de isopor e coloque-a no recipiente de grade crio-EM ou transfira-a diretamente para triagem crio-EM ou coleta de dados.Uma amostra de cristal 2D de leucotrieno C4 sintase humana submetida ao método peel-blot é mostrada aqui. A região à esquerda da seta foi amplamente reduzida a cristais 2D de camada única em uma região de contato entre o filme de carbono e a barra de grade que foi manchada e depois deslocada. A região à direita da seta não foi afetada pela mancha de casca.A metade inferior da imagem representa as regiões com grandes bicamadas lipídicas fosfolípticas de camada única, resultantes da aplicação da mancha de casca. A metade superior não estava em uma zona de contato entre a barra de grade e o filme de carbono e, portanto, continha lipossomas completos com duas bicamadas fosfolipídicas. O quadrado da grade de uma grade de malha 400 mostra a pegada da barra de grade e as regiões descascadas resultantes, bem como as regiões que não estavam em contato com uma barra de grade ou submetidas a menos iterações de descascamento.Essas imagens mostraram o apagamento de uma grade EM preparada pela injeção traseira em um papel de filtro submícron usando filme de carbono muito fino. As imagens são quadros únicos no contato inicial com a membrana, 1.000 milissegundos após o contato e 2.000 milissegundos após o contato. A seta indica quadrados de grade onde a pressão capilar rompeu o filme de carbono.Evitar fraturas no filme de carbono e combinar papel de filtro submícron com uma gota de trealose de 1,7 microlitro para sucção e, em seguida, separar as camadas são etapas fundamentais. As amostras descascadas são utilizadas para a coleta de dados crio-EM de alta resolução, seguidas de processamento de imagem para a determinação da estrutura. O peel-blot permite a determinação estruturada de cristais 2D de proteína de camada única que anteriormente eram muito espessos para o crio-EM.Além disso, pode concentrar várias amostras em camadas únicas em filme de carbono.

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Research

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