Name: Desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes CRISPR/Cas9 mediados por lentivírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a gerar linhas de células musculares knock-out usando CRISPR/Cas9 mediado por lentivírus. Este método acelera o estudo da função gênica em mioblastos humanos de forma eficiente.

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Este trabalho foi financiado por subsídios da Associação Francesa contre les myopathies (AFM-Téléthon) e da Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Um grande passo no caminho para a caracterização de genes de função desconhecida envolvidos em patologias é o desenvolvimento de modelos celulares relevantes para estudar a função desses genes. O uso da edição de genes usando CRISPR/Cas9 é um campo de pesquisa em crescimento exponencial, e o desenvolvimento de modelos de knock-out como apresentado aqui está entre suas aplicações mais utilizadas. Nesse contexto, propomos aqui um protocolo versátil para desenvolver uma linha celular humana em qualquer gene de interesse, pe...

Com o progresso do sequenciamento genético e a identificação de mutações em genes de funções desconhecidas em um tecido específico, o desenvolvimento de modelos celulares relevantes para entender a função de um novo gene alvo e confirmar seu envolvimento nos mecanismos fisiodicos relacionados constitui uma ferramenta essencial. Além disso, esses modelos são de grande importância para futuros desenvolvimentos terapêuticos 1,2, constituindo uma alternativa interessante para o desenvolvimento de modelos animais nocautes em linha reta com as recomendações internacionais para redução do uso de animais na experimentação. A edição de genes usando CRISPR/Cas9 está entre as ferramentas mais poderosas disponíveis atualmente, o que permitiu o desenvolvimento de muitos modelos knock-out/knock-in, e a validação de genes direcionada usando CRISPR/Cas9 está entre as aplicações mais utilizadas do CRISPR/Cas93. O sucesso da edição de genes baseia-se na capacidade de introduzir as ferramentas CRISPR (o guia RNAs e o nuclease Cas9) no modelo de célula alvo, o que pode ser um desafio em muitas células difíceis de transfectar, como as células musculares4. Esse desafio pode ser superado com o uso do vírus, geralmente o lentivírus, que tem a grande vantagem de transduzir eficientemente muitos tipos de células e entregar seu transgene. Mas sua maior desvantagem é a integração do transgene no genoma da célula hospedeira, levando a uma possível alteração de genes localizados no local de integração e à expressão permanente do transgene, o que no caso do nuclease Cas9 resultaria em consequências prejudiciais5. Uma solução inteligente foi proposta por Merienne e seus colegas6, que consiste em introdução nas células de um guia-RNA visando o próprio gene Cas9, levando à inativação cas9. Uma adaptação dessa estratégia é apresentada aqui como um protocolo fácil de usar e versátil, permitindo eliminar praticamente qualquer gene em células difíceis de transfetar.
O objetivo do protocolo aqui apresentado é induzir a inativação de um gene de interesse em células musculares imortalizadas. Pode ser usado para eliminar qualquer gene de interesse.em diferentes tipos de células imortalizadas. O protocolo descrito aqui contém etapas para projetar os RNAs guia e sua clonagem em plasmídeos lentiviral, para produzir as ferramentas CRISPR em vetores lentivirais, para transdutar as células com os diferentes lentivírus, e para clonar as células para produzir uma linha celular homogênea editada.
Usando este protocolo, células musculares esqueléticas humanas imortalizadas foram desenvolvidas com a exclusão do receptor ryanodine tipo 1 (RyR1), um canal essencial de cálcio envolvido na liberação intracelular de cálcio e contração muscular7. O knock-out (KO) do gene foi confirmado no nível de proteína usando a mancha ocidental, e no nível funcional usando imagens de cálcio.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-CACNA1S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>CalPhos Kit de Transfecção de Mamíferos</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>Kit de transfecção</td></tr><tr>Anticorpo secundário <td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP</td>anti <td>IgG de</td></tr><tr><td>camundongo fácil de blot anti de coelho</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP Anticorpo</td></tr><tr><td>Fluo-4 direto</td><td>Molecular Probes</td><td>F10472</td><td>Imagem de cálcio</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Rabbit mAb&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td> <td># 2118</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Kit de ligação</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity com GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix para reação de PCR com alta fidelidade Taq polimerase e dNTPs</td></tr><tr><td>Anticorpo de cadeia pesada de miosina</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp; 740424</td><td>Kit Maxipreparation para purificação de plasmídeos</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>Purificação de DNA</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td><td>Kit para extração de DNA da célula</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Quimicamente Competente&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Células quimicamente competentes</td></tr><tr><td>Plasmídeo #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>Plasmídeo lentiviral que codifica o SpCas9 (para LV-Cas9)</td></tr> <tr><td>Plasmídeo # 87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Estrutura lentiviral para inserção de com guias (para alvo guia LV)</td></tr> <tr><td>Plasmídeo # 12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plasmídeo lentiviral que codifica embalagem lentiviral GAG POL</td></tr><tr><td>Plasmídeo # 8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Proteína envelope codificadora de plasmídeo lentiviral para produção de partículas retrovirais lentivirais e MuLV</td></tr><tr><td>V5 Tag Anticorpo Monoclonal</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&nbsp;</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Células ultracompetentes XL10-Gold</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Células quimicamente competentes</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Enzima de restrição</td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes crispr/cas9 mediados por lentivírus

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Uma importante aplicação de repetições palindômicas interespaçadas interespaçadas (CRISPR)/Cas 9 é o desenvolvimento de linhas celulares knock-out, especificamente para estudar a função de novos genes/proteínas associados a uma doença, identificada durante o diagnóstico genético. Para o desenvolvimento dessas linhas celulares, duas questões principais devem ser desemaranhadas: inserção das ferramentas CRISPR (o Cas9 e o guia RNA) com alta eficiência nas células escolhidas, e restrição da atividade Cas9 à exclusão específica do gene escolhido. O protocolo descrito aqui é dedicado à inserção das ferramentas CRISPR em células difíceis de transfeito, como células musculares. Este protocolo baseia-se no uso de lentivírus, produzidos com plasmídeos disponíveis publicamente, para os quais todas as etapas de clonagem são descritas para atingir um gene de interesse. O controle da atividade cas9 tem sido realizado usando uma adaptação de um sistema descrito anteriormente chamado KamiCas9, no qual a transdução das células com um lentivírus codificando um guia de RNA visando o Cas9 permite a abolição progressiva da expressão Cas9. Este protocolo tem sido aplicado ao desenvolvimento de uma linha de células musculares humanas RYR1-knock out, que tem sido ainda caracterizada no nível proteico e funcional, para confirmar o nocaute deste importante canal de cálcio envolvido na liberação de cálcio intracelular muscular e no acoplamento excitação-contração. O procedimento descrito aqui pode ser facilmente aplicado a outros genes em células musculares ou em outras células difíceis de transfeito e produzir ferramentas valiosas para estudar esses genes em células humanas.

Este protocolo foi aplicado a míbios imortalizados de um sujeito saudável15 (as chamadas células HM, para míbios humanos), em que o RyR1 foi anteriormente caracterizado16, a fim de derrubar o gene RYR1 codificando a proteína RyR1. O design dos guias RNA foi feito para excluir a sequência que abrange parte do exon 101 e intron 101 do gene. A exclusão de parte do exon 101 está prevista para resultar em interrupção do quadro de leitura. Além disso, o exon 101 codifica...

O protocolo descreve como gerar myoblasts knock-out usando CRISPR/Cas9, desde o design de guide-RNAs até a clonagem celular e caracterização dos clones knock-out.

Desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes CRISPR/Cas9 mediados por lentivírus

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Este protocolo permite o desenvolvimento de nocaute celular muscular em qualquer gene, a fim de estudar melhor a função deste gene no músculo. A vantagem é que é barato e mais rápido do que o desenvolvimento de animais nocautes para estudar qualquer gene. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, para estudar o envolvimento de um gene recém-identificado em uma miopatia.Se a técnica descrita aqui for aplicada às células iPS, pode levar ao desenvolvimento de células eliminatórias para qualquer gene em qualquer tipo de células. Para começar a agrupar-se regularmente repetições palindômicas curtas interespaçadas ou exclusão genética mediada pelo CRISPR, primeiro use ferramentas de navegador de genoma como ensembl. org para identificar o gene alvo, juntamente com as sequências de DNA em ambos os lados dele.Para obter a lista dos exons genéticos, primeiro clique na transcrição da sequência de codificação de proteínas e, em seguida, em Exons. Em seguida, clique na sequência de download e selecione apenas sequência genômica para baixar a sequência de consenso completa de todo o gene. Role a lista dos exons e introns do gene para selecionar os alvos.Para projetar o RNA guia, selecione primeiro sequências nucleotídeas dos introns imediatamente rio acima e rio abaixo da sequência de destino. Em seguida, vá para um site como crispr.tefor. net e use as sequências selecionadas para projetar dois RNAs guia, cada 20 nucleotídeos de comprimento sem o Protospacer Adjacent Motif separado por algumas centenas de pares de base.Em seguida, determine a sequência de complemento reverso para cada RNA guia e peça os primers. Para construir RNA guia para clonagem de plasmídeos, primeiro execute um PCR com um conjunto de primers usando a receita e o programa descrito no texto, em seguida, separe os produtos PCR em gel de 1%agarose usando o buffer Tris-borate-EDTA. Em seguida, extirpa o fragmento do par de 300 bases e purificar usando um kit.Da mesma forma, depois de executar outro PCR com o outro conjunto de primer, purifique um fragmento de DNA longo de 400 bases em 20 microliters de tampão de elução. Para inserir as fitas guia RNA em uma espinha dorsal plasmida lentiviral, primeiro configure uma reação de digestão dupla do plasmídeo com as enzimas de restrição Xma 1 e Blp 1, conforme descrito no texto. Depois de incubar o tubo de reação a 37 graus Celsius por uma hora, incuba-o a 65 graus Celsius por 20 minutos, depois execute o produto de digestão em um gel de 1% de agarose e purifique o plasmid de cerca de 10 pares de quilobase usando um kit apropriado.Também quantifique o produto purificado medindo a densidade óptica. Para ligar o guia RNA com o plasmídeo, prepare uma mistura de reação com o guia purificado RNA, o DNA plasmídeo linearizado, enzima e água para um volume final de 10 microliters, em seguida, incubar o tubo de reação a 50 graus Celsius por 15 minutos para gerar o plasmídeo final, chamado pGuide. Para a produção de lentivírus, primeiro semente uma placa de 145 centímetros com 1 milhão de células HEK 293 em DMEM com alta glicose e piruvato suplementado com 10% FBS e 1%penicilina ou estreptomicina.Em seguida, cresça as células a 37 graus Celsius por três dias em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. No quarto dia verifique as células para garantir 60 a 65% de confluência. Em seguida, prepare a solução de transfecção constituída pelo plasmídeo de interesse, a codificação plasmida do envelope do vírus, a embalagem lentiviral plasmid psPAX2 e fosfato de cálcio.Ajuste o volume final para 1000 microliters com água. Em seguida, adicione a solução de transfecção dropwise a um mililitro de 2X HBS sob agitação e incubar em temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos. Depois disso, adicione a solução dropwise às células.Para uma distribuição homogênea da solução de transfecção, incline suavemente a placa em todas as direções e, em seguida, incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% por pelo menos cinco horas. Em seguida, remova a mídia das placas e lave as células com PBS para se livrar dos reagentes de transfecção, em seguida, adicione 12 mililitros de meio fresco. Após 48 horas de incubação a 37 graus Celsius, acumule a mídia de todas as placas em um tubo.Coloque o tubo em um balde selado e centrífuga a 800 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, depois filtre o supernascer usando um filtro de 0,45 micrômetro e centrifugar o filtrado a 68, 300 vezes G por duas horas a quatro graus Celsius, usando um rotor de balde balançando. Depois de remover o supernasce, mantenha os tubos de cabeça para baixo em uma toalha de papel em um armário de segurança por cinco a 10 minutos para a remoção máxima do líquido das pelotas. Adicione 100 microliters de meio de proliferação hec e mantenha os tubos a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas.Em seguida, resuspende a pelota por pipetação. Depois de coletar todas as pelotas resuspended, faça alíquotas de 10 ou 25 microliters, em seguida, armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius depois de encaixar o congelamento em hidrogênio líquido. Para a transdução myoblast, primeira semente cada poço de uma placa de 96 poços com 100 microlitros de meio de proliferação contendo 10.000 células myoblast.No dia seguinte, adicione volumes pré-calculados de guias LV e LV Cas9 às células em um gabinete de segurança. Após cinco dias de incubação, solte as células do poço adicionando trippsina. Depois de contar os números de células, transfira as células de poços com confluência de 40 a 50% para uma nova placa.Após cinco horas de incubação, adicione volumes calculados de LV killer em uma multiplicidade de infecção de 20 e incubar por cinco a 10 dias ou pelo menos duas passagens no meio. Para caracterização funcional dos clones editados por genes por imagem de cálcio, placa 50.000 células no centro de um prato de 35 milímetros revestido de laminina. Para induzir a diferenciação, adicione o meio de diferenciação conforme descrito no texto.Após seis dias de incubação, tire o meio de cultura e delineie as células com uma caneta hidrofóbica. Em seguida, adicione 50 microliters de Fluo-4 Direct, diluídos um-para-um em meio de diferenciação, aos miotubos diferenciados. Depois de incubar os pratos a 37 graus Celsius por 30 minutos, lave as células duas vezes com tampão krebs suplementado com um miligrama por mililitro de glicose.Em seguida, use um microscópio de fluorescência invertida ou um microscópio confocal com um objetivo de 10X para medir as variações de fluorescência a uma taxa de um quadro por segundo durante 90 segundos e escolher um campo com pelo menos 10 miotubes. Depois de remover o tampão krebs adicional, estimule as células com dois mililitros de cloreto de potássio para despolarização de membrana ou dois mililitros de metacresol florocloro ou 4CmC ou estimulação direta RyR1. Visualize a variação da fluorescência após a estimulação, em seguida, quantifique a variação de fluorescência em cada miotube.Este protocolo poderia ser usado com sucesso para eliminar o gene RyR1 dos míobios humanos, o que resultou em DNA genômico mais curto nas células. O nocaute de RyR1 também foi confirmado no nível da proteína, pois a proteína RyR1 não pôde ser detectada nas células-alvo por manchas ocidentais. A ausência de atividade RyR1 em miótubos diferenciadas das células eliminatórias ryR1 foi verificada ainda por imagens de cálcio Fluo-4 após estimulação direta de RyR1 por 4CmC ou estimulação indireta por despolarização de membrana induzida por cloreto de potássio.A sequência que será suprimida deve ser necessária para a previsão de uma proteína funcional. Esta técnica é ideal para o desenvolvimento de ferramentas pós-genômicas para estudar o envolvimento de novos genes em doenças musculares.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

Os avanços recentes na capacidade de manipular geneticamente as linhas celulares somáticas possuem grande potencial para pesquisas básicas e aplicadas. Aqui, apresentamos duas abordagens para CRISPR / Cas9 gerado produção knockout e triagem em linhas de células de mamíferos, com e sem o uso de marcadores selecionáveis.

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).

Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

À medida que os protocolos relacionados ao CRISPR se tornam cada vez mais úteis e acessíveis, complicações e obstáculos ainda podem surgir em condições experimentais específicas. Este protocolo descreve a criação de uma linha de células humanas nocaute serina/treonina-proteína quinase 1 (RIPK1/RIP1) que interage com o receptor usando CRISPR/Cas9 e destaca os possíveis desafios encontrados durante esse processo.

Geração de uma linha celular RIP1 knockout U937 usando o sistema CRISPR-Cas9

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

A linhagem celular THP-1 é amplamente utilizada como modelo para investigar as funções de monócitos/macrófagos humanos em várias áreas de pesquisa relacionadas à biologia. Este artigo descreve um protocolo para engenharia eficiente baseada em CRISPR-Cas9 e isolamento de clone de célula única, permitindo a produção de dados fenotípicos robustos e reprodutíveis.

Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

Os detalhes são apresentados sobre como o mapeamento de QTL com um mapa genético baseado em seqüências genômicas inteiras pode ser usado para identificar um gene de resistência a drogas em Toxoplasma gondii e como isso pode ser verificado com o sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente um alvo genômico, neste caso o Gene de resistência a drogas.

Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Aprenda a gerar linhas de células musculares knock-out usando CRISPR/Cas9 mediado por lentivírus. Este método acelera o estudo da função gênica em mioblastos humanos de forma eficiente.

Desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes CRISPR/Cas9 mediados por lentivírus

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