Imagem por Tomografia por Emissão de Pósitrons do Tráfico Celular: Um Método de Radiomarcação Celular

Este protocolo descreve um método stepwise para radiomarcação de células e zircônio-89-DBN e seu rastreamento não invasivo por PET. Esta técnica também fornece um método confiável e estável para radiomarcação de células por uma conjugação covalente de zircônio-89-DBN ao meio primário das proteínas de superfície celular. Médicos e cientistas que trabalham com terapias celulares para doenças neurológicas e vários tipos de câncer acharão esse protocolo fundamental para entender a farmacocinética das terapias baseadas em células por meio de imagens PET não invasivas.

O protocolo detalhado fornece orientação aos novos usuários para aprender e adotar esta técnica de radiomarcação. Nós adicionais incluídos nas etapas críticas ajudarão a solucionar problemas para um novo usuário. Para começar, prepare uma coluna com aproximadamente 100 miligramas de resina hidroxamato e ative-a lavando a coluna com oito mililitros de acetonitrila anidra pura seguida de uma lavagem com cinco a seis mililitros de ar.

Passe dois mililitros de ácido clorídrico 0,5 normal para a coluna. Depois de passar uma descarga adicional de cinco a seis mililitros de ar, carregue lentamente a solução contendo zircônio-89 e ítrio natural na resina de hidroxamato. Lavar o ítrio natural não ligado da resina hidroxamato com 20 mililitros de dois ácidos clorídricos normais, seguidos de 10 mililitros de água deionizada.

Para iludir o zircónio sob a forma de hidrogenofosfato de zircónio-89, adicione 0,5 mililitros de tampão fosfato de dipotássio de potássio 1,2 molar à coluna e deixe-a descansar na coluna durante 30 minutos. Adicione mais 1,5 mililitros de tampão 1,2 molar para eluir o zircônio da coluna. Em seguida, pegue cerca de 120 microlitros de hidrogenofosfato de zircônio-89 formulado no tampão e neutralize a solução com HEPES-KOH e carbonato de potássio para atingir um pH de 7,528.

Adicione quatro microlitros de cinco milimolares DFO-Bn-NCS recém-preparados a cerca de 285 microlitros de hidrogenofosfato de zircônio-89 neutralizado. E misture a solução por pipetagem. Depois de isolar o zircónio do ítrio, adicionar 0,5 mililitros de ácido oxálico molar à coluna e deixá-lo descansar na coluna durante um minuto para eluir o zircónio sob a forma de oxalato de zircónio-89.

Adicione mais 2,5 mililitros de ácido oxálico molar à coluna. Para converter o oxalato de zircônio-89 em cloreto de zircônio-89, lave a coluna de troca de ânions com seis mililitros de acetonitrila, seguida de uma lavagem com cinco a seis mililitros de ar. Em seguida, lave a coluna com 10 mililitros de soro fisiológico seguido de outra lavagem de ar.

Lentamente, carregar a solução contendo oxalato de zircônio-89 na coluna de troca aniônica ativada antes de relavá-la com ar. Em seguida, lave a coluna com 50 mililitros de água deionizada para remover o íon oxalato não ligado. Para iludir o zircónio sob a forma de cloreto de zircónio-89, adicione 0,1 mililitros de um ácido clorídrico normal à coluna e deixe-a descansar na coluna durante um minuto.

Eluir o zircônio da coluna com um adicional de 0,4 mililitros de um ácido clorídrico normal. Secar o cloreto de zircónio-89 escapado num frasco para injetáveis em forma de V, colocando-o num bloco de aquecimento a 65 graus Celsius sob um fluxo constante de gás azoto durante 10 a 30 minutos e, em seguida, reconstituir o cloreto de zircónio-89 seco em água. Preparar 500 microlitros de suspensão celular com aproximadamente 6 milhões de células em 500 microlitros de HBSS tamponado com HEPES em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicionar aproximadamente 100 microlitros do zircônio-89-DBN formulado.

Misture o zircônio-89-DBN e a suspensão celular pipetando suavemente a solução para cima e para baixo com uma micropipeta. Incubar as células e a mistura de zircônio-89-DBN em um agitador a cerca de 550 RPM a 25 a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos para marcação celular. Executar TLC radioativo na reação de marcação radioativa da célula usando solvente TLC radioativo recém-preparado.

Calcule a porcentagem de radioatividade em Rf igual a 0,01 a 0,02 usando a equação mostrada na tela. Em um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro, misture cerca de 100 microlitros do zircônio-89-DBN formulado com cerca de 500 microlitros de HBSS tamponado com HEPES para usá-lo como um controle sem célula para correção de fundo. Calcule a porcentagem de radioatividade em Rf igual a 0,01 a 0,02 usando a equação mostrada na tela e, em seguida, calcule a marcação efetiva da célula subtraindo as duas porcentagens de radioatividade calculadas.

Após a confirmação da conclusão da radiomarcação, adicionar 600 microlitros de meio completo apropriado para células resfriadas para realizar a têmpera da reação de radiomarcação. Centrifugar as células a 96G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. E descartar o sobrenadante.

Ressuspenda suavemente as células peletizadas em 500 microlitros do meio resfriado, pipetando o meio para cima e para baixo com uma micropipeta. Centrifugar as células a 96G por 10 minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante. Em seguida, calcule a eficiência final da marcação radiológica após todas as lavagens usando a equação mostrada na tela.

Para garantir a qualidade das células radiomarcadas, inspecionar visualmente a suspensão final das células radiomarcadas e, se não houver aglomerações, realizar um teste de viabilidade de exclusão do azul de tripano usando solução de azul de tripano a 0,4% preparada em PBS dentro de uma hora após a marcação radiológica e as etapas de lavagem. A eficiência de quelação do DFO-Bn-NCS para zircônio-89 usando hidrogenofosfato de zircônio-89 e cloreto de zircônio-89 é diferente quando medida por CCD radioativo. A estabilidade de várias células radiomarcadas com zircônio-89 ao longo de sete dias é mostrada aqui.

A retenção da radioatividade do zircônio-89 pelas células radiomarcadas mostrou-se estável em todas as células estudadas, com efluxo desprezível observado ao longo de sete dias após a marcação. As eficiências de radiomarcação celular em diferentes tipos celulares com zircônio-89-DBN são mostradas nesta tabela. A eficiência de marcação radiocelular varia de 20 a 50% como um rendimento não corrigido observado no pellet de células radiomarcadas após a lavagem.

A etapa mais crítica deste protocolo é a adição de DFO-Bn-NCS à mistura quelante e a avaliação da qualidade das células radiomarcadas. A aplicação desta técnica ajudará a compreender a farmacocinética das terapias baseadas em células. Também levantaria questões sobre qualquer necessidade clínica de alterar o perfil de depuração das terapias celulares.