Name: Construção de um Modelo de Organ-On-A-Chip de Células Musculares Lisas da Aorta Humana para Recapitulação da Deformação Biomecânica na Parede Aórtica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda a construir um modelo organ-on-a-chip com células musculares lisas da aorta humana para simular deformações biomecânicas. Esta plataforma inovadora permite triagem de fármacos e medicina personalizada em doenças aórticas.

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Os autores reconhecem que este trabalho foi apoiado por doações da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (20ZR1411700), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81771971) e do Programa de Vela de Xangai (22YF1406600).

Espécimes aórticos humanos foram utilizados para isolamento primário do HASMC sob a aprovação do Hospital Zhongshan, Comitê de Ética da Universidade de Fudan (NO. B2020-158). Espécimes de aorta foram coletados de pacientes submetidos à cirurgia de aorta ascendente no Hospital Zhongshan, Universidade de Fudan. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os pacientes antes da participação.
1. Isolamento primário das células musculares lisas da aorta humana
<ol><li>Lavar a região lateral direita da aorta ascendente com PBS estéril, 1x-2x.</li>
	<li>Remova as camadas íntima e adventícia do tecido com duas pinças oftálmicas e retenha a camada média para colher as células.</li>
	<li>Coloque a camada média sobre um prato de cultura de 10 cm e corte-a em pedaços pequenos (2-3 mm) com uma tesoura. Adicionar 5 mL de meio de cultura de células musculares lisas (SMCM) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Mova o pequeno tecido para o frasco de cultura com um conta-gotas estéril, espalhando o tecido uniformemente. Descarte o meio de cultura o máximo possível e, em seguida, inverta a garrafa de cabeça para baixo.</li>
	<li>Adicione 2 mL de SMCM no frasco de cultura invertido e coloque-o na incubadora (5% de CO 2) a 37 °C por 1-2 h, depois vire-o lentamente para o lado direito e adicione mais2 mL de SMCM.</li>
	<li>Após 5-7 dias de incubação, troque o SMCM por 4 mL de SMCM fresco. Geralmente, as células musculares lisas esporádicas saem em aproximadamente 2 semanas.</li>
	<li>Descarte lentamente o SMCM e adicione-o lentamente ao mudar o meio. Transportar o frasco de cultura lentamente ao se mover para uma estação de microscópio; caso contrário, os tecidos flutuarão e as células crescerão lentamente.</li>
	<li>Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, lavar com 2 mL de PBS, digerir com 2 mL de tripsina a 0,25% e dividi-las em dois novos frascos de cultura com 4 mL de SMCM fresco.</li>
	<li>Identificar as células através de uma análise de imunofluorescência de quatro diferentes marcadores específicos para células musculares lisas (CNN1, SM22)14.</li>
</ol>2. Preparação do chip PDMS
<ol><li>Para polimerizar o PDMS, adicionar o agente de cura (componente B) à base (componente A) a uma relação de peso de A: B = 10:1 p/p e misturar o complexo completamente por 5 min; o volume depende da necessidade do estudo.</li>
	<li>Coloque o gel PDMS preparado em um tanque de extração a vácuo por 30-60 min e mantenha a pressão abaixo de -0,8 mPa. NOTA: A alta pressão levará à extração insuficiente de pequenas bolhas dentro do gel PDMS que afetarão a próxima etapa da fabricação de chips.</li>
	<li>Usando o software de design assistido por computador (CAD), projete o molde com uma estrutura de estrutura externa de 100 mm × 40 mm × 8 mm e uma estrutura de estrutura externa de 70 mm × 6 mm × 4 mm.</li>
	<li>Personalize os moldes das três camadas usando uma máquina de gravação de controle numérico computadorizado de alta precisão. Esculpir a estrutura dos moldes e os microcanais usando placas de polimetilmetacrilato (PMMA) e, em seguida, colá-los em outra placa de PMMA.</li>
	<li>Despeje o gel PDMS preparado em um molde com um × de 100 mm × estrutura externa de 6 mm e 70 mm × canal de 6 mm × 4 mm e, em seguida, reticule a 70 °C por 1-2 h.</li>
	<li>Retire as placas PDMS reticuladas do molde e corte as membranas PDMS comercializadas em seções de 100 mm × 40 mm.</li>
	<li>Trate as três placas PDMS preparadas e duas membranas PDMS com plasma de oxigênio por 5 min para ativação da superfície PDMS. Aplique as seguintes configurações específicas: ar ambiente como gás de processo; pressão ajustada para -100 kPa; atual definido para 180--200 Ma; tensão ajustada para 200 V; tempo de processo até 5 min.</li>
	<li>Faça furos nas três lajes PDMS usando um perfurador de furo de 1 mm para fazer a entrada e saída de ar e microcanais médios no chip PDMS.</li>
	<li>Unir três lajes PDMS e duas membranas PDMS juntas na ordem: laje PDMS canal de ar (camada superior) - membrana PDMS - laje PDMS de canal médio (camada média) - membrana PDMS - laje PDMS canal de ar (camada inferior). Execute esta etapa sob um microscópio estereoscópico a 4x para sobrepor totalmente os microcanais de ar com os microcanais médios.</li>
	<li>Coloque o chip PDMS montado em uma incubadora de 70 °C por 1 h.</li>
	<li>Prepare várias mangueiras de látex de 1 mm de diâmetro interno e 3 cm de comprimento. Insira uma agulha de aço inoxidável de 1 mm de diâmetro externo e 1 cm de comprimento em uma extremidade da mangueira preparada e, em seguida, insira um Luer na outra extremidade da mangueira para criar o tubo conectado ao ar e aos microcanais médios do chip PDMS.</li>
	<li>Insira os tubos preparados nas saídas e entradas do ar e microcanais médios no chip PDMS.</li>
</ol>3. Tratamento de superfície de cavaco PDMS e esterilização
<ol><li>Infundir 2 ml de colagénio de rato de 80 mg/ml no microcanal médio do chip PDMS utilizando uma seringa de 2 ml e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Após a incubação, retire o colágeno do canal e recupere com uma seringa de 2 mL. Coloque os cavacos PDMS revestidos de colagénio numa incubadora a 60 °C durante a noite.</li>
	<li>Coloque os chips PDMS em um esterilizador UV por mais de 1 h. Coloque os chips PDMS esterilizados em uma bancada ultralimpa em preparação para o experimento celular.</li>
</ol>4. Semeadura de células no chip PDMS e processo de alongamento de células
<ol><li>Cultura 4 x 10 5 células musculares lisas humanas primárias (HASMCs) de pacientes usando meio de células musculares lisas (SMCM) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora de CO2 a5% a 37 °C.</li>
	<li>Quando a densidade do CMASA atingir 80%, descarte o SMCM e lave as células com 2 mL de PBS.</li>
	<li>Digerir as células usando 1 mL de tripsina a 0,25% por 2 min e centrifugar a 100 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de SMCM fresco. Use 8 mL de SMCM para cultivar as células em um prato de cultura de 10 cm.</li>
	<li>Calcule o número de células usando um citômetro e use as células em uma concentração final de 2 x 105 células/mL.</li>
	<li>Despeje lentamente 2 mL de PBS no microcanal médio do chip PDMS revestido de colágeno e esterilizado e descarte posteriormente usando uma seringa de 2 mL.</li>
	<li>Despeje lentamente um total de 2 mL de 2 x 105 células/mL de suspensão HASMC no microcanal médio do chip PDMS usando uma seringa de 2 mL. Em seguida, feche o Luer na entrada e saída do chip PDMS. Colocar o chip PDMS numa incubadora (5% CO2) a 37 °C durante 1 dia.</li>
	<li>Depois que as células estiverem conectadas à membrana PDMS no chip PDMS, quase após 24 h, conecte a saída do microcanal de ar no chip PDMS ao sistema controlador de vácuo. Quando a célula está ligada, uma forma celular alongada e normal pode ser vista sob o microscópio, contrastando com as células redondas suspensas.</li>
	<li>Ligue a válvula solenoide e a bomba de vácuo. Abra o regulador de vácuo e ajuste o nível de pressão para 10 kPa para 7,18 ± deformação de 0,44% e 15 kPa para 17,28 ± deformação de 0,91%.</li>
	<li>Após a definição dos parâmetros do sistema de controle, coloque os cavacos PDMS em uma incubadora (5% CO2) a 37 °C e estique por 24 h.</li>
</ol>5. Preparação do sistema de controlo mecânico
<ol><li>Prepare várias válvulas solenoides, filtros de vácuo, reguladores de vácuo, uma bomba de vácuo, uma bomba peristáltica e um controlador lógico programável (PLC) que controle a válvula solenoide.</li>
	<li>Programe o controlador PLC e defina o intervalo de tempo liga/desliga para 1 Hz. Conecte as válvulas solenoides ao controlador programado.</li>
	<li>Conecte a entrada da bomba de vácuo aos filtros de vácuo e, em seguida, conecte a saída dos filtros de vácuo aos reguladores de vácuo. Conecte a saída dos reguladores de vácuo às válvulas solenoides e, finalmente, conecte a saída das válvulas solenoides às saídas dos microcanais de ar dos chips PDMS.</li>
	<li>Conecte a saída da bomba peristáltica à entrada do microcanal médio do chip PDMS e a entrada da bomba peristáltica à saída do chip PDMS de microcanal médio para substituição do meio de cultura e manuseio de medicamentos.</li>
	<li>Ajuste a amplitude da deformação pelo regulador e a frequência da deformação pelo microcontrolador.</li>
</ol>

<ol><li>Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection%3A+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14%2C000+cases+from+1987+to+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li>
<li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+arterial+remodeling%3A+lessons+from+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li>
<li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP%2FTAZ+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li>
<li>Fabre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+a+manuscript+series+on+the+characterization+and+use+of+microphysiological+systems+%28MPS%29+in+pharmaceutical+safety+and+ADME+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications.</a> Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).</li>
<li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans%3F+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902(2018).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organs-on-chips+for+disease+modelling%2C+drug+development+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li>
<li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li>
<li>Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+liver+models+on+a+microplatform%3A+well-defined+culture%2C+engineering+of+liver+tissue+and+liver-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip.</a> Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).</li>
<li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li>
<li>Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-on-a-chip+based+on+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Heart-on-a-chip based on stem cell biology.</a> Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).</li>
<li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Netherlands+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).</li>
<li>Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ%2Fbody-on-a-chip+devices+at+the+convergence+of+biology+and+microengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+cancer-on-a-chip+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Construction of cancer-on-a-chip for drug screening.</a> Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+organ-on-a-chip+to+improve+cell+capture+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mechanical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency.</a> International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705(2021).</li>
<li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301(2017).</li>
<li>Mohammed, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+devices%3A+improvement+of+surface+quality+of+CO2+laser+machined+poly+%28methylmethacrylate%29+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021(2017).</li>
<li>Tsao, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+microfluidics%3A+Simple%2C+low-cost+fabrication+process+bridging+academic+lab+research+to+commercialized+production%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production.</a> Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).</li>
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<li>Stefanadis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-diameter+relation+of+the+human+aorta.+A+new+method+of+determination+by+the+application+of+a+special+ultrasonic+dimension+catheter%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter.</a> Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).</li>
<li>Williams, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influences+on+vascular+smooth+muscle+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function.</a> Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).</li>
<li>Abudupataer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta+smooth+muscle-on-a-chip+reveals+impaired+mitochondrial+dynamics+as+a+therapeutic+target+for+aortic+aneurysm+in+bicuspid+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease.</a> eLife. 10, 69310(2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Com o rápido desenvolvimento da tecnologia microfluídica, modelos OOC que podem replicar a função biológica e a estrutura de um ou mais órgãos in vitro surgiram nos últimos anos para aplicações em biologia, medicina e farmacologia15. A OCO pode simular funções-chave do microambiente fisiológico humano, essenciais para explorar os mecanismos da doença e promover a tradução pré-clínica de medicamentos 8,16. Embora o OOC ainda esteja...

O aneurisma e dissecção da aorta torácica (DAAT) é uma dilatação ou delaminação localizada da parede aórtica associada a alta morbidade e mortalidade1. As células musculares lisas da aorta humana (HASMCs) desempenham um papel vital na patogênese do TAAD. Os HASMCs não são células terminalmente diferenciadas, e os HASMCs retêm alta plasticidade, permitindo que eles mudem fenótipos em resposta a diferentes estímulos2. As CMSAP são submetidas principalmente à tensão de tração rítmica in vivo, sendo este um dos principais fatores reguladores das alterações morfológicas, diferenciação e funções fisiológicas do músculo liso 3,4. Portanto, o papel da cepa cíclica no estudo das CMHS não pode ser ignorado. No entanto, as culturas convencionais de células 2D não podem replicar a estimulação biomecânica da cepa cíclica experimentada pelos HASMCs in vivo. Além disso, a construção de um modelo de TAAD animal não é adequada para alguns tipos de TAAD, como o TAAD relacionado à válvula aórtica bicúspide (BAV). Além disso, a lacuna de espécies entre estudos clínicos em humanos e experimentos com animais não pode ser ignorada. Dificulta a tradução farmacêutica na prática clínica. Assim, há uma necessidade urgente de sistemas mais complexos e fisiológicos para simular o ambiente biomecânico in vivo na pesquisa de doenças da aorta.
Experimentos com animais usados em pesquisa biomédica e desenvolvimento de medicamentos são caros, demorados e eticamente questionáveis. Além disso, os resultados de estudos em animais frequentemente não conseguem prever os resultados obtidos em ensaios clínicos em humanos 5,6. A falta de modelos pré-clínicos humanos e a alta taxa de falha em ensaios clínicos têm resultado em poucos medicamentos eficazes para a clínica, o que tem aumentado os custos com a assistência à saúde7. Assim, é urgente encontrar outros modelos experimentais que complementem os modelos animais. As técnicas de microfabricação e microfluídica se desenvolveram muito nos últimos anos, fornecendo novas técnicas para o estabelecimento de modelos de organoides em um chip que corrigem as desvantagens das técnicas tradicionais de cultura de células 2D e estabelecem um modelo in vitro mais realista, de baixo custo e eficiente para estudos fisiológicos e desenvolvimento de medicamentos. Usando dispositivos microfluídicos, os órgãos em chips são estabelecidos para cultivar células vivas em câmaras do tamanho de micrômetros com diferentes estímulos para replicar as principais funções de um tecido ou órgão. O sistema consiste em microcanais microfluídicos únicos ou múltiplos, com um tipo de célula cultivada em uma câmara perfundida replicando funções de um tipo de tecido ou diferentes tipos de células cultivadas em membranas porosas para recriar interfaces entre diferentes tecidos. Os organoides microfluídicos combinados com células derivadas de pacientes têm a vantagem única de preencher a grande diferença de espécies entre os modelos de doenças de camundongos e humanos e superar as desvantagens da cultura tradicional de células 2D para pesquisa de mecanismos de doenças e descoberta de medicamentos. Com o rápido desenvolvimento da microfluídica nos últimos anos, os pesquisadores perceberam a utilidade de modelos in vitro organ-on-a-chip (OOC) replicando parâmetros biológicos complexos in vivo 8. Esses organoides microfluídicos simulam ambientes biomecânicos in vitro, como deformação cíclica, tensão de cisalhamento e pressão líquida, proporcionando um ambiente de cultura celular tridimensional (3D). Até o momento, vários modelos de OCO foram estabelecidos para simular estímulos biomecânicos em órgãos como o pulmão9, rim 10, fígado 11, intestino12 e coração 13, mas estes não têm sido amplamente aplicados ao estudo da doença aórtica humana.
Neste estudo, apresentamos um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip (HASMC-OOC) que pode controlar as forças mecânicas biomiméticas e os ritmos aplicados aos HASMs primários derivados de pacientes com TAAD. O chip consiste em placas espessas de três camadas de polidimetilsiloxano (PDMS) gravadas com canais e duas membranas PDMS altamente flexíveis comercializadas. Os HASMCs são cultivados nas membranas do PDMS. O canal no meio do chip é preenchido com um meio de cultura para cultura celular. Os canais superior e inferior do chip são conectados a um sistema de fornecimento de pressão de vácuo que pode controlar o ritmo e a frequência da tensão de tração mecânica das membranas PDMS. A deformação rítmica experimentada pelos HASMCs pode ser simulada no HASMC-OOC, replicando o microambiente biomecânico de tecido ou órgão não funcionalmente alcançável com sistemas de cultura 2D convencionais. Com a vantagem de imagens de alta resolução, em tempo real e microambiente biomecânico, as atividades bioquímicas, genéticas e metabólicas das células vivas podem ser estudadas para o desenvolvimento de tecidos, fisiologia de órgãos, etiologia da doença, mecanismos moleculares e identificação de biomarcadores, doenças cardiovasculares e doenças da aorta. Combinado com células específicas de tecidos e pacientes, esse sistema pode ser usado para triagem de drogas, medicina personalizada e testes de toxicidade. Este modelo HASMC-OOC fornece uma nova plataforma in vitro para estudar a patogênese da doença aórtica.

<table><tbody><tr><td>4% de paraformaldeído</td><td>Beyotime</td><td>P0099-100ml</td><td>Usado para imobilização celular</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350-marcado com Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0408</td><td>Anticorpos usados para imunocoloração de</td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Beyotime</td><td>ST025-20g</td><td></td></tr><tr><td>Cálcio AM/PI</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>CNN1</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab46794</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PDMS flexível comercial </td><td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td><td>KYQ-200</td><td></td></tr><tr><td>F-actin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>M8318</td><td></td></tr><tr><td>Mangueiras</td><td>Runze Fluid</td><td>96410</td><td>1 mm de diâmetro interno; 3 mm de diâmetro externo; 1 mm de espessura da parede; Endereço do site oficial: https://www.runzefluidsystem.com</td></tr><tr><td>Linha de células musculares lisas da aorta humana CRL1999</td> Número do lote <td>ATCC</td><td>:70019189</td><td></td></tr><tr><td>Imagem J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>Download grátis: https://fiji.sc</td><td>Plataforma de imagem usada para identificar a intensidade da fluorescência</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Garante que a temperatura, a umidade e a exposição à luz sejam exatamente as mesmas durante todo o experimento .</td></tr><tr><td>Luer</td><td>Runze Fluid</td><td>RH-M016</td><td>Endereço do site oficial: https://www.runzefluidsystem.com.</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mouse colágeno</td><td>Sigma</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Plasma de oxigênio&nbsp;</td><td>Pipeta de Pasteur do instrumento</td><td>HM-Plasma5L</td><td></td>de Changzhou Hongming</tr><tr><td></td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Beyotime</td><td>C0221A</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>Antibiódicos usados para impedir a contaminação bacteriana das pilhas durante a cultura.</td></tr><tr><td>bomba peristáltica</td><td>Kamoer</td><td>F01A-STP-B046</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Controlador PLC</td><td>Zhejiang Jun Teng (BenT) Fábrica CNC</td><td>BR010-11T8X2M</td><td>A configuração detalhada do programa pode ser encontrada em suplementar. Endereço do site oficial: files.http://www.btcnc.net</td></tr><tr><td>polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>SMCM</td><td>ScienCell</td><td>Cat 1101</td><td></td></tr> válvula <tr><td>solenóide</td><td>SMC (China)</td> <td>VQZ300</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300841</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Beyotime</td><td>ST795</td><td>Para penetrar nas membranas celulares</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>10296010</td><td>usado para extração de RNA</td></tr><tr><td>tripsina</td><td>Filtro</td><td>de vácuo Sigma 15400054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SMC (China)</td> <td>ZFC5-6</td><td>Endereço do site oficial: bomba de</td></tr><tr><td>vácuo</td> https://www.smc.com.cn <td>Kamoer</td><td>KVP15-KL-S</td><td></td></tr><tr><td>regulador de vácuo</td><td>AirTAC</td><td>GVR-200-06</td><td></td></tr> <tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Nome</td><td>Forward (5 'a 3')</td><td>Reverso (5' a 3')</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td><td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td><td></td></tr><tr><td>CNN1</td><td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td><td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td><td></td></tr></tbody></table>

construção de um modelo de organ-on-a-chip de células musculares lisas da aorta humana para recapitulação da deformação biomecânica na parede aórtica

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Técnicas convencionais de cultura de células bidimensionais e modelos animais têm sido utilizados no estudo do aneurisma e dissecção da aorta torácica humana (TAAD). No entanto, o TAAD humano às vezes não pode ser caracterizado por modelos animais. Há uma aparente lacuna de espécies entre estudos clínicos em humanos e experimentos com animais que podem dificultar a descoberta de drogas terapêuticas. Em contraste, o modelo convencional de cultura celular é incapaz de simular estímulos biomecânicos in vivo. Para este fim, a microfabricação e as técnicas microfluídicas se desenvolveram muito nos últimos anos, fornecendo novas técnicas para o estabelecimento de modelos de organoides em um chip que replicam o microambiente biomecânico. Neste estudo, um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip (HASMC-OOC) foi desenvolvido para simular os parâmetros fisiopatológicos da biomecânica da aorta, incluindo a amplitude e a frequência da tensão cíclica experimentada pelas células musculares lisas da aorta humana (HASMCs) que desempenham um papel vital no TAAD. Nesse modelo, a morfologia dos CMHHs tornou-se alongada, alinhada perpendicularmente à direção da deformação e apresentou fenótipo mais contrátil em condições de deformação do que em condições convencionais estáticas. Isso foi consistente com a orientação celular e o fenótipo nas paredes aórticas humanas nativas. Além disso, usando TAAD (BAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica bicúspide (BAV-TAAD) e HASMCs primários derivados de TAAD (TAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica tricúspide, estabelecemos modelos de doença BAV-TAAD e TAV-TAAD, que replicam as características do HASMC no TAAD. O modelo HASMC-OOC fornece uma nova plataforma in vitro que é complementar aos modelos animais para explorar ainda mais a patogênese do TAAD e descobrir alvos terapêuticos.

O modelo HASMC-OOC consiste em um sistema de controle de vácuo, um sistema circulante e chips PDMS, e o projeto esquemático do modelo HASMC-OOC (Figura 1). O sistema de controle de vácuo consiste em uma bomba de vácuo, válvulas solenoides e um controlador PLC. Para atuar como o sistema circulante, uma bomba peristáltica foi usada para refrescar o meio de cultura celular e adicionar drogas. O chip PDMS foi composto por duas câmaras de vácuo e uma câmara média preenchida com SMCM para crescime...

Aqui, desenvolvemos um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip para replicar a cepa biomecânica in vivo de células musculares lisas na parede da aorta humana.

Construção de um Modelo de Organ-On-A-Chip de Células Musculares Lisas da Aorta Humana para Recapitulação da Deformação Biomecânica na Parede Aórtica

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Este modelo estimula estímulos biomecânicos experimentados por células musculares lisas na aorta humana. Combinado com células derivadas de pacientes, este sistema pode ser usado para triagem de drogas e medicina personalizada de doenças da aorta. Este modelo pode imitar e controlar com precisão os parâmetros mecânicos nus das células musculares lisas na aorta humana, o que fornece uma nova plataforma in vitro para o estudo e patogênese de doenças da aorta.Demonstrando o procedimento estará Mieradilijiang Abudubat, um médico cartaz do nosso laboratório. Comece lavando a região lateral direita da aorta ascendente com pbs estéreis, uma ou duas vezes. Remova as camadas íntima e adventícia do tecido com duas pinças oftálmicas e retenha a camada média para colher as células.Coloque a camada de mídia em um prato de 10 centímetros e corte-a em pedaços de dois a três milímetros. Em seguida, adicione cinco mililitros de SMCM contendo 10%fbs e 1% de penicilina estreptomicina às amostras de tecido. Mova o pequeno tecido para o frasco de cultura com um conta-gotas estéril, espalhando o tecido uniformemente.Descartar o meio de cultura o máximo possível. Em seguida, inverta a garrafa de cabeça para baixo. Adicione dois mililitros de SMCM no frasco de cultura invertida e coloque-o na incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma a duas horas.Em seguida, vire-o lentamente para o lado direito e adicione mais dois mililitros de SMCM. Após cinco a sete dias de incubação, troque o SMCM por quatro mililitros de SMCM fresco. Descarte lentamente e adicione o SMCM ao alterar o meio.Geralmente, as células musculares lisas esporádicas saem em aproximadamente duas semanas. Transportar o frasco de cultura suavemente ao se mover para uma estação de microscópio. Caso contrário, os tecidos flutuarão e as células crescerão lentamente.Quando as células crescerem, divida-as em duas novas garrafas de cultura com quatro mililitros de SMCM fresco. Identificar as células através de uma análise de imunofluorescência de quatro marcadores específicos para células musculares lisas. Para polimerizar o PDMS, adicione o agente de cura ou o componente B à base ou ao componente A e misture o complexo por cinco minutos.O volume dependerá da necessidade do estudo. Coloque o gel PDMS preparado em um tanque de extração a vácuo por 30 a 60 minutos e mantenha a pressão abaixo de 0,8 mili pascals negativos. Usando software de design assistido por computador, projete o molde.Personalize os moldes das três camadas usando uma máquina de gravação de controle numérico computadorizado de alta precisão. Depois de esculpir a estrutura dos moldes e os microcanais usando placas de PMMA, cole-os em outra placa. Despeje o gel PDMS preparado em um molde projetado.Em seguida, cross-link a 70 graus Celsius por uma a duas horas. Retire as placas PDMS reticuladas do molde e corte as membranas PDMS comercializadas em seções de 100 milímetros por 40 milímetros. Faça furos nas três lajes de PDMs usando um perfurador de furo de um milímetro para fazer a entrada e saída de ar e microcanais médios no chip PDMS.Trate as três placas PDMS preparadas e duas membranas PDMS com plasma de oxigênio por cinco minutos para ativação da superfície do PDMs. Ajuste o ar ambiente para processar gás, a pressão para 100 kilopascals negativos, a corrente para 180 a 200 miliamperes de píeres, a tensão para 200 volts e o tempo de processamento para cinco minutos. Ligue três placas PDMS e duas membranas PDMS juntas sob um microscópio estereoscópico, de modo que a camada superior consista na laje PDMS do canal de ar e, em seguida, na membrana PDMS.O canal médio consiste na laje PDMS, depois na membrana PDMs e a camada inferior é a laje PDMS do canal de ar. Coloque o chip PDMS montado em uma incubadora de 70 graus Celsius por uma hora. Prepare várias mangueiras de látex de um milímetro de diâmetro interno e três centímetros de comprimento.Insira uma agulha de aço inoxidável de um milímetro de diâmetro externo e um centímetro de comprimento em uma extremidade da mangueira preparada. Em seguida, insira uma isca na outra extremidade da mangueira para criar o tubo conectado ao ar e aos microcanais médios do chip PDMS. Insira os tubos preparados nas saídas e entradas do ar e microcanais médios no chip PDMS.Infundir dois mililitros de 80 miligramas por mililitro de colágeno de rato no microcanal médio do chip PDMs, usando uma seringa de dois mililitros, e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, remova o colágeno do canal com uma seringa de dois mililitros. Coloque os chips PDMS codificados de colágeno em uma incubadora Celsius de 60 graus durante a noite.Coloque os chips PDMS em um esterilizador UV por mais de uma hora. Coloque os chips PDMS esterilizados em uma bancada ultra limpa em preparação para o experimento celular. Cultura de quatro vezes 10 para as cinco células musculares lisas aórticas humanas primárias de pacientes usando SMCM contendo 2%FBS e 1% de estreptomicina de penicilina em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%, fixada em 37 graus Celsius.Quando a densidade das células musculares lisas atingir 80%, descarte o SMCM e lave as células com dois mililitros de PPS. Digerir as células usando um mililitro de tripsina a 0,25% por dois minutos e centrifugar a 100 RCF por cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de SMCM fresco.Use oito mililitros de SMCM para cultivar as células em um prato de cultura de 10 centímetros. Usando um citômetro, calcule o número de células e prossiga com a concentração final de duas vezes 10 para as cinco células por mililitro. Despeje lentamente dois mililitros de PBS no microcanal médio do chip PDMS codificado e esterilizado com colágeno e depois descarte usando uma seringa de dois mililitros.Despeje lentamente dois mililitros de duas vezes 10 para as cinco células por mililitros de suspensão de células musculares lisas no microcanal de mídia do chip PDMS. Em seguida, feche a isca na entrada e saída do chip PDMS. Coloque o chip PDMS em uma incubadora, ajustado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por um dia.Após a incubação, quando as células estiverem ligadas à membrana PDMS no chip PDMS, conecte a saída do microcanal de ar no chip PDMS ao sistema controlador de vácuo. Uma forma celular normal alongada será vista sob o microscópio quando a célula estiver ligada. Contrastando com as células redondas suspensas.Ligue a válvula solenoide e a bomba de vácuo. Abra o regulador de vácuo e ajuste o nível de pressão dependendo das deformações. Em seguida, coloque os chips PDMS e uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.Prepare várias válvulas solenoides, filtros de vácuo, reguladores de vácuo, uma bomba de vácuo, uma bomba peristáltica e um PLC controlando a válvula solenoide. Programe o controlador PLC e defina o intervalo de tempo de desligamento para um hertz. Conecte as válvulas solenoides ao controlador programado.Conecte a entrada da bomba de vácuo aos filtros de vácuo e, em seguida, conecte a saída dos filtros de vácuo aos reguladores de vácuo. Conecte a saída dos reguladores de vácuo às válvulas solenoides. E, finalmente, conecte a saída das válvulas solenoides às saídas dos microcanais de ar dos chips PDMS.Conecte a saída da bomba peristáltica à entrada do microcanal médio do chip PDMS e a entrada da bomba peristáltica à saída do chip PDMS de microcanal médio para substituição do meio de cultura e manuseio de medicamentos. Ajuste a amplitude da deformação pelo regulador e a frequência da deformação pelo microcontrolador. A viabilidade da linhagem de células musculares lisas da aorta humana, CRL 1990, no chip PDMS, foi estimada usando um ensaio vivo e morto no terceiro e quinto dia de cultura celular.A viabilidade celular foi superior a 90% no terceiro e quinto dias. A coloração F-actina do citoesqueleto do LCR 1990, no chip PDMS, mostrou morfologia celular normal e células alinhadas perpendicularmente à cepa após alongamento por 24 horas. A imunofluorescência dos marcadores contráteis SM22 e CNN1 foi maior sob condições de deformação em comparação com as condições estáticas.Além disso, os genes SM22 e CNN1 foram regulados em condições de tensão das células musculares lisas. A coloração com actina F do BAV e TAV, aneurisma da aorta torácica e dissecção de células musculares lisas primárias da aorta humana derivadas do paciente, mostraram morfologia celular normal e células alinhadas perpendicularmente à direção da deformação após o alongamento por 24 horas. A fluorescência SM22 e CNN1 no aneurisma e dissecção da aorta torácica BAVTAAD e TAV foram maiores sob condições de deformação do que em condições estáticas.Semelhante aos níveis de expressão gênica de SM22 e CNN1, que também foram regulados positivamente em condições de deformação em comparação com condições estáticas. Deve-se prestar atenção ao princípio da esterilidade ao isolar o CMSA primário. Depois que os laboratórios PDMS e as membranas são tratados com plasma, as superfícies não devem ser sujas.Com base neste protocolo, as células endoteliais podem ser co-cultivadas com células musculares lisas e o estresse puro pode ser dado às células com tensão cíclica para simular ainda mais forças mecânicas.

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Research

JoVE Journal

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Construção de um Modelo de Organ-On-A-Chip de Células Musculares Lisas da Aorta Humana para Recapitulação da Deformação Biomecânica na Parede Aórtica

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