Seleção In Vitro de Aptamers para Diferenciar Vírus Infecciosos de Não-Infecciosos

Este protocolo descreve como selecionar aptâmeros de DNA que possam distinguir vírus infecciosos versus vírus não infecciosos, a fim de obter moléculas sensoriais capazes de informar a infectabilidade de amostras clínicas ou ambientais. Esta técnica pode ser aplicada para obter aptâmeros seletivos para muitos outros vírus, incluindo vírus emergentes, porque não requer conhecimento prévio das estruturas ou sequências do vírus. Esta técnica permite o desenvolvimento de sensores aptâmeros para diagnóstico clínico e monitoramento ambiental de vírus infecciosos para detectar se alguém é contagioso ou se um método de desinfecção ambiental funciona como pretendido.

A seleção pode ser um processo difícil, principalmente para quem é novo nela. É importante otimizar as condições de PCR e monitorar o progresso da seleção com qPCR. Quem demonstrará o procedimento será Marcos Gramajo, aluno de pós-graduação do meu laboratório.

Para começar, projete a biblioteca e os primers iniciais de fita simples ou SS-DNA. Obter o DNA oligos de fontes comerciais com purificação padrão de dessalinização. Purificar a biblioteca e os primers de SS-DNA em eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante a 10% seguida de precipitação com etanol.

Em seguida, obter uma solução estoque de vírus infecciosos e não infecciosos ou prepará-los conforme descrito no manuscrito do texto. Para a desnaturação da biblioteca de SS-DNA, misturar 10 microlitros de 100 micromolares da biblioteca SS-DNA com 240 microlitros de tampão SELEX. Aqueça a mistura a 95 graus Celsius por 15 minutos em um banho seco e, em seguida, coloque o tubo no gelo por 15 minutos.

Misturar 250 microlitros da biblioteca SS-DNA em tampão SELEX com 50 microlitros de vírus infeccioso para seleção positiva. Incubar durante duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 400 microlitros de uma sequência milimolar T20 a um filtro de 0,5 mililitro para bloquear os locais não específicos.

Incubar os filtros por 30 minutos. Centrifugar o filtro a 14.000 G durante 10 minutos para remover a solução T20. Em seguida, lave o filtro três vezes com tampão SELEX para remover o excesso de sequências T20.

Em seguida, adicione a mistura de vírus infecciosos da biblioteca SS-DNA ao filtro bloqueado de 100 quilodalton e centrífuga para lavar as sequências não ligadas. Lave o filtro três vezes adicionando 400 microlitros de tampão SELEX e centrifugação. Mantenha a fração no filtro e descarte o fluxo.

Para eluir as sequências ligadas, troque o tubo de coleta do filtro centrífugo e adicione 300 microlitros de tampão SELEX contendo ureia de oito molares ao filtro. Aqueça o filtro a 95 graus Celsius por 15 minutos e, em seguida, centrifugue para coletar o fluxo contendo as sequências eluídas. Uma vez feito, lave os materiais com 10% de água sanitária.

Em seguida, adicione a solução de vírus infeccioso SS-DNA coletada na etapa anterior a um filtro bloqueado de 10 quilodaltons, centrifuga a 14.000 G por 15 minutos e descarte o fluxo. Lave o filtro três vezes com 300 microlitros de tampão SELEX para remover a ureia por centrifugação e descartar o fluxo. Recupere a solução no filtro virando-a de cabeça para baixo em um tubo de coleta limpo e centrifugando por cinco minutos.

Meça o volume final da solução recuperada usando uma pipeta e rotule-a como uma amostra Round 1A. Pegue 90% da amostra da Rodada 1A como um modelo na primeira rodada e execute o PCR usando condições otimizadas. Para recuperar o SS-DNA usando esferas magnéticas modificadas com estreptavidina ou MB, divida o produto em alíquotas de 50 microlitros e adicione-as a tubos de microcentrífuga contendo 50 microlitros MB. Incubar o tubo durante 30 minutos com agitação ligeira à temperatura ambiente.

Em seguida, coloque o tubo no rack magnético para isolar o MB e remover o sobrenadante por pipetagem. Lave o MB duas vezes adicionando 200 microlitros de ligação e tampão de lavagem ao tubo. Em seguida, remova o tubo do rack magnético e toque-o antes de ressuspender o MB para uma solução homogênea por pipetagem.

Coloque o tubo novamente no rack magnético e retire o sobrenadante. Após a segunda lavagem, ressuspenda o MB em 100 microlitros de tampão SELEX e aqueça a solução a 95 graus Celsius por 10 minutos. Coloque imediatamente o tubo no rack magnético e colete o sobrenadante contendo o pool de SS-DNA.

Repita esta etapa de recuperação adicionando 50 microlitros de buffer SELEX. Meça o volume final da fração recuperada e rotule-a como Round 1X. Para a desnaturação do pool de SS-DNA, pegue 60% da amostra Round 1X e misture-a com 50 microlitros de tampão SELEX.

Aqueça a amostra em banho seco e, em seguida, coloque o tubo sobre gelo por 15 minutos. Em seguida, misturar o pool de SS-DNA desnaturado em tampão SELEX com 50 microlitros de cada vírus como etapa de contra-seleção e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Depois de bloquear os locais não específicos em filtros de centrífuga, adicione o pool de SS-DNA desnaturado da mistura incubado com uma solução de vírus a um filtro bloqueado de 100 quilodaltons.

Centrifugar o filtro a 14.000 G durante 10 minutos e recolher o fluxo. Pegue 300 microlitros de fração e misture com 50 microlitros de vírus infeccioso contendo 100 milhões de cópias por mililitro. Incubar durante duas horas à temperatura ambiente.

Prepare uma mistura mestre de qPCR padrão e diluições da biblioteca de SS-DNA purificada conforme descrito no texto. Execute o qPCR para determinar o ciclo de limite. Após a corrida, use uma curva padrão para quantificar a quantidade de SS-DNA em Round 1A e Round 1X.

Em seguida, calcule o rendimento de eluição como a quantidade de DNA ligado dividida pela quantidade inicial de DNA e plote o rendimento de eluição versus o número redondo. Finalmente, plote as curvas de fusão para diferentes rodadas. Para sequenciamento de alto rendimento, selecione um kit apropriado disponível comercialmente.

Prepare vários pools de rodadas de seleção representando alto, médio e baixo enriquecimento, bem como o pool final usando um par diferente de índices nos adaptadores para cada pool. Em seguida, envie a biblioteca final preparada para a instalação de sequenciamento. Para a análise de sequenciamento, as sequências foram desmultixadas pela facilidade de sequenciamento.

Remova os adaptadores de sequenciamento e primers de seleção usando o programa de linha de comando Cutadapt. Em seguida, use o programa FASTX-Toolkit para remover sequências de baixa qualidade. Em seguida, mescle os arquivos de sequência na direção inversa com aqueles na direção direta usando o FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ função complementar nos arquivos de direção inversa.

Em seguida, use o programa CAT interno para mesclar os arquivos em um único arquivo. Use o kit de ferramentas de análise FASTAptamer para analisar o enriquecimento de sequências em diferentes pools de seleção. Primeiro, para usar a contagem FASTAptamer e as funções de cluster FASTAptamer para agrupar sequências semelhantes em clusters.

Em seguida, use a função de enriquecimento FASTAptamer para obter informações sobre o enriquecimento de sequências e clusters. Identificar as sequências aptâmeras candidatas a partir das informações de enriquecimento obtidas através da análise de sequências. Selecione várias sequências de aptâmeros e realize a triagem inicial usando um ensaio de ligação.

Nesta análise, qPCR foi usado para monitorar o progresso do SELEX de aptâmeros específicos SARS-CoV-2 infecciosos. O rendimento de eluição aumentou inicialmente a cada rodada de SELEX e nivelou nas rodadas oito e nove. Comparando as curvas de fusão, observou-se uma mudança do pico a uma alta temperatura de fusão de 77 para 79 graus Celsius.

Além disso, nas duas últimas rodadas, um pico a uma baixa temperatura de fusão foi observado. A abundância relativa em leituras por milhão para o SARS2 AR10 sequenciado obtido ao longo de rodadas de seleção consecutivas é mostrada. A estrutura prevista de SARS2 AR10 mostrou uma estrutura secundária estruturada contendo uma região de loop do tronco que pode estar envolvida no reconhecimento do vírus.

Uma vez que os aptâmeros são obtidos, eles podem ser incorporados em ópticas elétricas, outro tipo de sensores, para desenvolver testes portais e rápidos de detecção de vírus que podem informar a infectividade do vírus. Vislumbramos que aptâmeros específicos para diferentes variantes ou estereótipos de vírus possam ser obtidos, possibilitando o monitoramento rápido de variantes que são a maior ameaça à sociedade.