Name: Imagem de células B CD19+ em um modelo experimental de encefalomielite autoimune em camundongos usando tomografia por emissão de pósitrons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a quantificar células B CD19+ no sistema nervoso central usando imagem PET em camundongos com encefalomielite autoimune experimental. Esta técnica permite rastrear dinâmicas celulares in vivo com alta precisão.

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Somos gratos pelo apoio da instalação de imagem de pequenos animais SCi3 em Stanford e do Dr. Frezghi Habte por sua assistência técnica com o PET/CT. LC-MS é realizada pela equipe principal da instalação principal de Espectrometria de Massa da Universidade de Stanford (SUMS) e agradecemos a equipe por fornecer esse serviço. Agradecemos à Horizon Therapeutics por gentilmente fornecer o hCD19-mAb e a Jodi Karnell em particular por sua orientação técnica e apoio. Este trabalho foi financiado pelo NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).

<ol><li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).</li>
<li>Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inebilizumab%2C+a+B+cell-depleting+anti-CD19+antibody+for+the+treatment+of+autoimmune+neurological+diseases%3A+Insights+from+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).</li>
<li>Stevens, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+CD19+PET+tracer+for+detecting+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275(2020).</li>
<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
<li>Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+antigen-specific+antibody+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+recombinant+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).</li>
<li>Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+follicle-like+structures+in+multiple+sclerosis-With+focus+on+the+role+of+B+cell+activating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor.</a> Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).</li>
<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

O anticorpo CD19 foi fornecido pela Horizon Therapeutics.

Este artigo descreve um método simplificado para obtenção de imagens de células B CD19+ humanas em um modelo de EM em camundongos usando CD19-PET. Devido à apresentação heterogênea da EM e às diferentes respostas aos tratamentos, seu manejo na clínica pode ser desafiador e novas abordagens para seleção e monitoramento terapêutico são extremamente necessárias. A imagem por PET pode servir como uma ferramenta poderosa para monitorar a progressão da doença e a resposta individual à terapia de depleção de células B. Além da SM, a imagem por PET-CD19 pode ser usada para monitorar a depleção de células B após o tratamento em subtipos de linfomas e leucemia ou outras doenças mediadas por células B. Este protocolo e dados representativos mostram a utilidade da imagem de células B em doenças neurológicas.
Para estudar células B CD19+ humanas no contexto da EM, escolhemos o modelo MOG1-125 EAE dependente de células B7. Semelhante a outros modelos de EAE, esse modelo apresenta sintomas de paralisia progressiva e infiltração de células imunes no SNC. No entanto, o modelo MOG1-125 é único por ser um modelo conduzido por células B: camundongos contêm números variados de células B no espaço subaracnóideo nas meninges, tronco cerebral, parênquima e ventrículos. Esses linfócitos podem estar esparsamente espalhados por essas regiões e/ou formar estruturas semelhantes a folículos, o que também é observado em humanos comEM8,9. Além de usar camundongos virgens como controles, um kit de indução completo somente com adjuvante de Freund (CFA) pode ser usado (ou seja, uma emulsão de indução idêntica à que é dada a camundongos EAE sem a proteína MOG). No modelo de camundongo EAE, a barreira hematoencefálica (BHE) é disfuncional e permite a passagem de entidades maiores, como anticorpos. O radiotraçador CD19-mAb só se ligará e permanecerá no SNC se as células B estiverem presentes; o traçador voltará a circular para o pool sanguíneo se as células B não estiverem presentes. Demonstramos isso usando contagem gama e autorradiografia ex vivo de tecidos do SNC por perfusão antes de medir os níveis de radioatividade nos tecidos. Também demonstramos isso em publicações anteriores relatando o uso de radiotraçadores PET baseados em mAb (ou seja, abordagens de imagem imunoPET) para detectar células B no SNC 1,2.
O quelante DOTA foi utilizado por ter sido utilizado em exames clínicos de PET com peptídeos e anticorpos marcados com cobre-64, e nosso objetivo é traduzir o hCD19-mAb para exames clínicos de imagem de pacientes com EM. O DOTA tem afinidade de ligação adequada ao cobre-64 in vivo. A estabilidade in vivo é muito importante porque 64livre vai para o fígado e pode obscurecer o sinal do radiotraçador ligado; Assim, é importante medir o sinal no fígado para calcular o sinal relativo em comparação com outros órgãos. O músculo é tipicamente tomado como um tecido de controle, mas no caso do EAE, pode haver inflamação presente nos músculos. A meia-vida de 64é de 12,7 h, o que dá tempo suficiente para o DOTA-hCD19-mAb se ligar ao seu alvo, garantindo que o sinal possa ser medido por PET. Ao preparar o conjugado, reações de teste em pequena escala (75-125 μg) devem ser realizadas para determinar a quantidade de DOTA a ser adicionada ao mAb para produzir a relação DOTA/mAb desejada (por exemplo, uma reação de 6-10 vezes o excesso de DOTA-NHS-éster por mol mAb pode fornecer um conjugado de 1-2 DOTA/mAb). O tempo de reação e a temperatura (por exemplo, 2-4 h ou durante a noite a 4 °C ou temperatura ambiente) também influenciam a relação DOTA/mAb e devem ser otimizados. Uma titulação com cobre não radioativo pode ser realizada para calcular o número de DOTAs por mAb; no entanto, recomendamos a realização de MALDI-MS e/ou LC-MS para resultados mais confiáveis e precisos.
A razão DOTA/mAb calculada é um valor médio para uma determinada amostra e alguma variação é esperada. Para MALDI, várias tomadas são tomadas por amostra para os mAbs conjugados e não conjugados. Em seguida, calculamos a razão entre conjugado e não conjugado para determinar o número médio de DOTA/mAb. A relação DOTA/mAb é importante porque muitos quelantes interromperão a ligação de anticorpos e muito poucos levarão a marcação radiológica inconsistente e sinal baixo. A razão deve ser muito próxima entre os lotes de conjugado para manter a intensidade de sinal consistente e a cinética de ligação; Idealmente, o mesmo lote de conjugado deve ser usado para todos os experimentos dentro de um estudo particular. Uma técnica promissora para reduzir os efeitos potenciais sobre a imunorreatividade devido à possível superconjugação é utilizar a conjugação sítio-específica10 , em que a conjugação do quelante é sítio-seletiva sobre os glicanos de cadeia pesada do anticorpo, garantindo, assim, a adição de 1 quelante por mAb.
As condições da reação de radiomarcação devem ser otimizadas para garantir a mais alta eficiência de marcação e rendimento, uma vez que diferenças no anticorpo, razão DOTA/mAb e atividade molar de 64, entre outras condições, afetarão a marcação radioativa. O uso da razão conjugada ideal de 64para mAb pode permitir que o radiotraçador seja usado sem purificação, reduzindo o tempo necessário para a marcação radiológica e a perda devido à coluna de fluxo de gravidade e ao decaimento radioativo. Uma atividade molar consistente e confiável também pode ser alcançada quando a mesma razão conjugada de 64para mAb é usada, o que é especialmente importante ao comparar resultados em várias coortes de camundongos ou estudos de imagem. As condições da ITLC também podem ser modificadas para se adequar a cada usuário. Se a purificação for necessária, uma alíquota deve ser guardada para HPLC e/ou espectrofotometria UV/Vis para que a atividade molar possa ser calculada.
É importante ressaltar que o uso de anticorpos radiomarcados para exames de imagem pode ser um desafio. É essencial que o anticorpo utilizado para o radiotraçador seja biologicamente inerte para não ter efeito fisiológico. Além disso, como os anticorpos têm uma longa residência sanguínea, deve-se esperar tempo suficiente para a circulação, ligação e depuração de um determinado mAb para garantir um sinal-para-fundo adequado sem comprometer a qualidade da imagem. Normalmente, esperar por 20-48 h por um mAb marcado com 64 é suficiente, mas deve-se obter imagens em 2, 4, 6, 12, 24, 48 h após a injeção ao avaliar um novo traçador PET mAb para determinar o melhor ponto de tempo para a obtenção de imagens em um determinado modelo de roedor. O mesmo vale para a aquisição de imagens ARG com a maior relação sinal-fundo. As imagens representativas deste protocolo foram obtidas 18-20 h após a injeção, embora outros momentos possam ser usados dependendo do radioisótopo utilizado. Diferentes anticorpos que se ligam a diferentes epítopos de CD19 produzirão resultados variados e devem ser rigorosamente caracterizados.
Ao analisar o sinal da medula espinhal, é importante posicionar os ratos de costas na cama de varredura para reduzir o movimento causado pela respiração. Além disso, a colocação supina pode ajudar a endireitar a coluna vertebral em camundongos que têm curvatura espinhal aumentada devido à progressão da doença EAE. Outro aspecto importante a ser considerado quando se pretende detectar sinal na coluna vertebral e na medula espinhal é evitar a injeção de MOG1-125 no flanco, pois os locais de injeção podem ligar o traçador devido à resposta imune associada nessas áreas. A proximidade do local da injeção pode interferir na análise da medula espinhal; Assim, as injeções no tórax são preferíveis para a aplicação aqui descrita.
As técnicas de análise de imagem utilizadas são específicas para exames de imagem do SNC. Uma ferramenta de atlas cerebral dentro do software de análise de imagens fornece resultados reprodutíveis e confiáveis, desde que o registro de PET e TC seja preciso. Usar o atlas cerebral 3D semi-automatizado e ajustá-lo para se ajustar ao crânio de cada rato permite ROIs consistentes entre os animais. Como atualmente não existe uma abordagem automatizada ou semi-automatizada para analisar o sinal na medula espinhal, as ROIs manuais devem ser desenhadas. Notavelmente, ao quantificar as células B CD19+ (ou qualquer tipo de célula presente na medula óssea e na medula espinhal), é fundamental eliminar ao máximo o sinal proveniente da coluna vertebral e da medula óssea. A razão para isso é que camundongos virgens são conhecidos por conter mais células B CD19+ em sua medula óssea do que camundongos EAE, nos quais as células B saem da periferia para se infiltrar no SNC 5,11. Este sinal da medula óssea pode obscurecer o verdadeiro sinal na medula espinhal.
Para delinear o verdadeiro sinal da medula espinhal e, ao mesmo tempo, minimizar a contribuição do sinal da coluna vertebral e da medula óssea, o limiar de Otsu da imagem de TC pode ser usado para fazer uma ROI imutável para a coluna vertebral. Uma ROI da medula espinhal separada pode então ser facilmente desenhada dentro da coluna vertebral. A mesma técnica também pode ser aplicada para medir a medula óssea no fêmur. Este é um método muito útil para obter informações sobre a ligação do traçador na medula espinhal. No entanto, devido à resolução espacial relativamente baixa da PET e a questões relacionadas ao efeito de volume parcial ao escanear pequenas regiões anatômicas de camundongos, o uso de técnicas confirmatórias ex vivo adicionais (por exemplo, contagem gama, ARG) permite a validação da ligação do radiotraçador na medula espinhal sem a presença de sangue, líquido cefalorraquidiano ou sinal de transbordamento da coluna vertebral.
O sinal na medula espinhal cervical/torácica tende a variar nos camundongos EAE, dependendo da gravidade da doença e de quantas células B infiltram durante a resposta imune adaptativa. Essa variação no número de células B que se infiltram, bem como a pequena quantidade de células B no SNC em comparação com aquelas na medula óssea pélvica/espinhal de camundongos virgens, pode tornar a quantificação in vivo do tecido da medula espinhal desafiadora em camundongos. Dada a resolução espacial do PET em imagens de pequenos animais, o sinal da medula óssea pode transbordar para o sinal da medula espinhal. A biodistribuição ex vivo e a autorradiografia completadas aqui ajudam a validar o sinal PET das vértebras versus tecido da medula espinhal. Os camundongos são perfundidos antes da dissecção para remover qualquer traçador não ligado no pool de sangue para que os resultados da contagem gama e da autorradiografia reflitam o traçador que está realmente ligado em cada órgão, em vez do traçador que está no pool de sangue nesse órgão.
Radiotraçadores circulam através do sangue, e com traçadores de anticorpos, especificamente, muitas vezes há radiotraçador não ligado presente no sangue por semanas após a injeção inicial. Uma vez que estamos fazendo imagens do cérebro e da medula espinhal, que têm muitos vasos sanguíneos, é importante entender qual parte do sinal é realmente devido à ligação do traçador no cérebro/tecido de interesse versus o presente no pool sanguíneo. Assim, é necessário dividir o sinal cerebral por sinal no pool coração/sangue. No cenário clínico, as mesmas técnicas de análise de imagem do limiar de Otsu das vértebras e ROIs dos tecidos da medula espinhal podem ser usadas para quantificação. Dado o maior volume de tecido em humanos em comparação com camundongos, deve haver significativamente menos impacto dos efeitos parciais de volume, levando a uma melhor precisão e negando a necessidade de técnicas ex vivo para confirmar os achados in vivo . O uso de PET na clínica permitirá que os médicos personalizem a terapia para cada paciente, dependendo de sua carga individual de células B.
O ARG é particularmente útil para a aquisição de imagens de alta resolução para permitir um delineamento mais preciso da localização espacial da ligação do traçador em pequenas regiões, como tronco cerebral e cerebelo. Os mesmos cortes e/ou cortes adjacentes podem ser guardados para coloração imunoistoquímica para confirmar a presença de células B. Previamente coramos tecidos do SNC com CD45R/B220 (Figura Suplementar S1) para correlacionar o número de células B com o sinal PET eARG5,9. A coloração pode então ser comparada espacialmente com os resultados da ARG para verificar se o sinal do radiotraçador corresponde ao padrão de coloração. As células B podem estar presentes em grupos ou difusamente por todo o tronco cerebral; A sensibilidade do PET é suficientemente alta para medir o sinal, o que é encorajador para a tradução clínica. Para ARG da medula espinhal, a remoção da medula espinhal das vértebras garante que o sinal medido seja devido à ligação do traçador no tecido da medula espinhal em vez da medula óssea e/ou sangue, o que pode obscurecer as imagens de PET devido a efeitos parciais de volume.
Semelhante à ARG, a contagem gama ex vivo permite a quantificação do sinal radioativo em órgãos individuais. Para esta técnica em particular, é importante medir o peso úmido dos tecidos e garantir que eles estejam no fundo de seus respectivos tubos antes de colocá-los no contador gama. Os tubos devem ser marcados com o número do rato e tecido, de modo a que o tubo correto seja utilizado; O tubo é então pesado em uma balança calibrada e os órgãos são inseridos até o décimo mais próximo de um micrograma (0,0001 mg). Alguns tecidos são extremamente pequenos e a diferença na massa do tubo antes e depois será da ordem de 0,0001 mg. Os tecidos devem ser pesados imediatamente após a dissecção para evitar perda de umidade, o que resulta em uma massa menor. Após a pesagem, os tubos do cérebro e da medula espinhal devem ser preenchidos com PBS para evitar a secagem antes de congelar esses tecidos para ARG.

A EM é um distúrbio neurológico imunomediado; A apresentação única em cada paciente pode tornar o manejo desafiador tanto para os pacientes quanto para os clínicos1. A doença em si é caracterizada pela presença de lesões desmielinizantes e infiltração de células imunes no cérebro e na medula espinhal, resultando em comprometimento físico e cognitivo2. O paradigma tradicional de que a EM é uma doença mediada por células T foi desafiado pela primeira vez em um ensaio clínico de fase II de rituximabe3, uma terapia direcionada ao subconjunto CD20+ de células B. Desde então, foram desenvolvidas terapias adicionais com células B que têm como alvo CD194, um biomarcador de células B pan-B que é expresso em uma gama mais ampla de células B, o que pode ser diagnóstico e terapeuticamente vantajoso. Além disso, os métodos existentes para avaliar a eficácia do tratamento (isto é, monitorar o número de recidivas e a atividade da ressonância magnética [RM]) não permitem medidas precoces de resposta, colocando os pacientes em risco significativo de danos ao SNC devido à seleção e otimização da terapia subótima. Assim, há uma necessidade crítica de estratégias para monitorar células imunes específicas, como as células B CD19+ , em tempo real no SNC e na periferia de pacientes com EM.
A imagem por PET é uma técnica de imagem robusta que permite a visualização in vivo de corpo inteiro de um determinado alvo de interesse, como CD19. Enquanto coletas de sangue, registros de taxas de recidiva e monitoramento de lesões por meio de ressonância magnética fornecem instantâneos sobre a eficácia do tratamento, a imagem PET pode permitir que pesquisadores e clínicos monitorem a eficácia de uma terapia em todo o corpo. Essa abordagem proativa para o monitoramento terapêutico permite que os médicos avaliem a eficácia da medicação em tempo real, permitindo ajustes rápidos conforme necessário. O monitoramento da localização e densidade das populações celulares associadas à doença também permite a avaliação longitudinal da gravidade usando informações anatômicas específicas do paciente. Portanto, é essencial estabelecer métodos analíticos reprodutíveis para utilizar de forma confiável todo o potencial da imagem por PET em ambientes clínicos e pré-clínicos.
Este trabalho descreve métodos (Figura 1) para realizar imagens de PET, contagem gama ex vivo e autorradiografia (ARG) de células B CD19+ com um anticorpo monoclonal (mAb) anti-humano CD19 marcado com 64, conhecido como 16C4-TM (64-hCD19-mAb), no modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) de MS induzida em camundongos transgênicos expressando CD19 humano (hCD19) usando a glicoproteína 1-125 de oligodendrócitos de mielina recombinante humana (MOG1-125). Também fornecemos métodos para avaliar a ligação do radiotraçador de forma precisa e reprodutível no cérebro e na medula espinhal, ambos locais críticos de patogênese frequentemente gravemente afetados neste e em outros modelos neurodegenerativos. Essas técnicas permitem a investigação não invasiva do papel das células B na patologia da doença e têm o potencial de serem traduzidas clinicamente para avaliar a eficácia de terapias anti-células B na EM.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL 50 kDa MWCO Filtro centrífugo</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>filtro centrífugo</td></tr><tr><td>64-CuCl3</td><td>Universidade de Washington em St. Louis; Universidade de Wisonsin, Madison; ou outro fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner</td><td>Eckert & de Autorradiografia Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>Alumínio, 8" x 10"</td></tr><tr><td>Filme de Autorradiografia</td><td>&nbsp; GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>Tela de Armazenamento de Fósforo BAS-IP SR 2025 E Super Resolução, 20 x 25 cm, somente tela</td></tr><tr><td>Cateter de Agulha</td><td>Borboleta SAI Infusion Technologies</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-ester</td><td>Macrocíclicos</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>de Indução Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>Geiger Counter</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>Scanner PET/CT GNEXT</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Contador Automático de Gama Hidex</td><td></td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Coluna</td><td>Phenomenex</td><td>&nbsp; 00H-2146-K0</td><td>5 &mu; m SEC-s3000 400 &Aring;, coluna Illustra NAP-5 de 300 x 7,8 mm</td></tr><tr><td></td><td>Coluna de gravidade de DNA Cytiva</td><td>17085301</td><td></td></tr><tr><td>Imagem</td> J Software <td>de análise NIH</td><td></td><td></td> ARG</tr><tr><td>Tubos de coleta de ligação de proteínas baixas (1,5 mL)</td><td>Espectrofotômetro Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td> Micro<td>/nano-espectrofotômetro UV-Vis</td> da <td>Thermo Scientific</td><td>840281400</td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 0,2 mL, para</td> imageador de fósforo <td>Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td>Typhoon de grau de DNA</tr><tr><td>9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>Versão 4 Patch 3</td><td>Software de Análise PET; deve adquirir o complemento do atlas cerebral</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>Coluna de dessalinização</td></tr></tbody></table>

imagem de células b cd19+ em um modelo experimental de encefalomielite autoimune em camundongos usando tomografia por emissão de pósitrons

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

A esclerose múltipla (EM) é a doença desmielinizante mais comum do sistema nervoso central (SNC) que afeta adultos jovens, muitas vezes resultando em déficits neurológicos e incapacidade à medida que a doença progride. Os linfócitos B desempenham um papel complexo e crítico na patologia da EM e são alvo de várias terapêuticas em ensaios clínicos. Atualmente, não há como selecionar com precisão os pacientes para terapias específicas com células B ou quantificar de forma não invasiva os efeitos desses tratamentos sobre a carga de células B no SNC e órgãos periféricos. A tomografia por emissão de pósitrons (PET) tem um enorme potencial para fornecer informações quantitativas altamente específicas sobre a distribuição espaço-temporal in vivo e a carga de células B em indivíduos vivos.
Este trabalho relata métodos para sintetizar e empregar um traçador PET específico para células B CD19+ humanas em um modelo bem estabelecido de MS em camundongos conduzido por células B, a encefalomielite autoimune experimental (EAE), que é induzida com glicoproteína humana recombinante de oligodendrócitos 1-125. Aqui são descritas técnicas otimizadas para detectar e quantificar células B CD19+ no cérebro e na medula espinhal usando imagens PET in vivo . Além disso, este artigo relata métodos simplificados para contagem gama ex vivo de órgãos relevantes para a doença, incluindo medula óssea, medula espinhal e baço, juntamente com autorradiografia de alta resolução da ligação do traçador CD19 em tecidos do SNC.

O hCD19-mAb foi conjugado ao DOTA e radiomarcado com 64como mostra a Figura 2. EAE e camundongos virgens de pesquisa foram submetidos à PET/CT (Figura 3) 18-24 h após a injeção com 64-DOTA-hCD19-mAb. As imagens de PET/CT foram co-registradas usando o software de análise PET, e os tecidos do SNC foram analisados usando ROIs manuais ou um atlas cerebral 3D semi-automatizado. A ligação do radiotraçador nas ROIs (Figura 4) foi maior em camundongos EAE do que em camundongos virgens. A contagem gama ex vivo e a ARG mostraram ligação aumentada na medula espinhal (segmentos torácicos lombar e cervical) e no cérebro (somente ARG) de camundongos EAE em comparação com virgens (Figura 5 e Figura 6). A contagem gama ex vivo de camundongos perfundidos também mostrou diminuição da ligação do radiotraçador em órgãos periféricos, incluindo baço, fêmur e medula óssea (Figura 5), consistente com células B saindo da periferia e infiltrando o SNC neste modelo de EAE.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg"> Figura 2: Esquema de conjugação e radiomarcação para geração de 64 anticorpos monoclonais CD19 marcados com, 16C4-TM mAb (64-DOTA-hCD19-mAb), além de dados de controle de qualidade. (A) Reação do éster de DOTA-NHS com anticorpo monoclonal hCD19 para produzir conjugado hCD19-DOTA (não em escala) e marcação radioativa com 64-CuCl3 para produzir 64-DOTA-hCD19-mAb. (B) Cromatógrafo ITLC representativo. O pico em 40-60 cm é o anticorpo radiomarcado; unbound 64-CuCl3 viaja com a fase móvel e estaria presente de 200 a 240 cm. Não há 64-CuCl3 livre detectável neste cromatógrafo. (C) As especificações de controle de qualidade do anticorpo radiomarcado. Abreviaturas: éster DOTA-NHS = éster mono-N-hidroxisuccinimida do ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetracético; ITLC/HPLC = cromatografia em camada delgada instantânea/cromatografia líquida de alta eficiência; MALDI/LC-MS = dessorção/ionização/cromatografia líquida assistida por matriz/espectrometria de massas; CPM = contagens por minuto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg"> Figura 3: Fotografias demonstrando como proteger camundongos em uma cama impressa em 3D dentro do scanner PET para permitir imagens de alta qualidade da medula espinhal e do cérebro, minimizando o movimento . (A) Cama com scanner de quatro ratos impressa em 3D (também conhecida como "hotel do rato") equipada com elementos de aquecimento e tubos de anestesia. (B) Camundongos anestesiados em decúbito dorsal para maximizar a retidão da coluna vertebral; A posição da cama de cada mouse é registrada. (C) Ratos colados firmemente em toda a cabeça para minimizar o movimento no cérebro e através da barriga para minimizar o movimento da respiração, sem afetar a respiração. (D) Mouse bed posicionado dentro do scanner e colado no leito de digitalização. A tubulação de anestesia foi conectada do scanner ao leito e o isoflurano ajustado para 2%. A respiração em camundongos foi monitorada para garantir o nível adequado de isoflurano antes de fechar a porta do scanner. Abreviação: PET = Tomografia por emissão de pósitrons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg"> Figura 4: Imagem da medula espinhal e análise do cérebro e resultados usando o software de análise PET . (A) i) ROIs (rosa e bronzeado ) desenhadas na coluna para separar as vértebras lombares e cervicais e preparar a imagem para o limiar de Otsu. ii ) As vértebras da coluna vertebral (turquesa e vermelha) foram segmentadas usando Otsu Thresholding. iii ) As vértebras foram então tornadas imutáveis no menu de ROI 3D, e a medula espinhal dividida em ROIs cervical/torácica (roxa) e lombar (marinha). iv) A ROI vertebral foi removida, restando ROIs medulares e atlas cerebral representativo aplicados. (B) Análise representativa dos resultados da PET de várias regiões do SNC representadas como %ID/g normalizadas para a ROI do coração dentro de cada animal. A aquisição do PET foi um exame estático de 10 min via PET/CT. Regiões cerebrais quantificadas usando uma abordagem semi-automatizada de atlas cerebrais, mostrada no painel A. iv) Resultados representativos mostram significância ou tendência a aumento significativo na ligação do traçador no cérebro e na medula espinhal torácica. Estatística realizada por meio do teste t de Student (*: p &lt; 0,0332). Abreviações: PET = Tomografia por emissão de pósitrons; ROIs = regiões de interesse; SNC = sistema nervoso central; TC = tomografia computadorizada; %ID/g = percentagem de dose injetada por grama de tecido; EAE = encefalomielite autoimune experimental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg"> Figura 5: Quantificação representativa da contagem gama ex vivo em vários órgãos em camundongos EAE e virgens expressa em %ID/g. Após o PET scan, os camundongos foram perfundidos com PBS para remover o radiotraçador presente no sangue, livre ou ligado às células B CD19+ residentes no sangue, e os órgãos rapidamente dissecados e pesados para ter um peso preciso de cada órgão. A ligação do traçador é significativamente diminuída no baço e na medula óssea em camundongos EAE em comparação com os virgens de estudo. Observa-se aumento da ligação do radiotraçador nos segmentos lombar e cervical/torácico da medula espinhal de camundongos EAE. O cérebro não mostra aumento significativo no sinal do radiotraçador, embora esteja tendendo a um aumento significativo. Estatística realizada pelo teste t de Student (*: p &lt; 0,0332; ****: p &lt; 0,0001). Abreviações: PET = Tomografia por emissão de pósitrons; %ID/g = percentagem de dose injetada por grama de tecido; EAE = encefalomielite autoimune experimental; PBS = solução salina tamponada com fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg"> Figura 6: Imagens ARG ex vivo mostram 64ligações de-DOTA-hCD19-mAb em cortes cerebrais sagitais e medula espinhal inteira de EAE em comparação com camundongos virgens. Filmes digitais de armazenamento de fósforo foram escaneados usando um imageador de fósforo após serem expostos a amostras de tecido radioativo por aproximadamente 10 meias-vidas (127 h ou 5 dias). As imagens resultantes revelam sinal visualmente mais alto no cérebro de camundongos EAE em comparação com seções cerebrais de camundongos virgens, o que é esperado devido às regiões conhecidas por conter células B neste modelo5. Especificamente, há aumento do sinal traçador no tronco cerebral, cerebelo e ventrículos de seções cerebrais de camundongos EAE. Este aumento no sinal para seções cerebrais de camundongos EAE espelha o que foi encontrado na quantificação PET de todo o cérebro detalhada acima. Da mesma forma, há um aumento na ligação do radiotraçador nos segmentos da medula espinhal cervical/torácica e lombar em comparação com a medula espinhal virgen, refletindo o que foi encontrado usando a contagem gama ex vivo . Abreviações: PET = Tomografia por emissão de pósitrons; EAE = encefalomielite autoimune experimental; Vent = ventrículos; Cb = cerebelo; BS = tronco encefálico; TSc = medula torácica e cervical combinadas; LSc = medula lombar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar S1: Coloração de tecidos do SNC de tecido cerebral de camundongos virgens e EAE com CD45R/B220. Células B são observadas no tronco encefálico, meninges e substância branca de camundongos EAE (n = 7 EAE, n = 5 camundongos virgens, média de quatro fatias por animal). Esse número é de 5. Barras de escala = 5 mm (aumento baixo [1x]) em imagens sagitais do cérebro, 100 μm (aumento alto [20x]) no tronco encefálico, meninges e substância branca cerebelar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl%20Fig%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este artigo detalha a metodologia para radiomarcação de um anticorpo monoclonal anti-CD19 humano-específico e como usá-lo para quantificar células B no sistema nervoso central e tecidos periféricos de um modelo de esclerose múltipla em camundongos usando imagens PET in vivo, contagem gama ex vivo e abordagens de autorradiografia.

Imagem de células B CD19+ em um modelo experimental de encefalomielite autoimune em camundongos usando tomografia por emissão de pósitrons

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

Esta técnica utiliza imagens de PET para elucidar a distribuição e dinâmica in vivo das células B no sistema nervoso central. Nossa abordagem é benéfica para o estudo de doenças neurológicas, onde a medula afetada torna a análise mais desafiadora. Portanto, existem algumas vantagens principais para a nossa técnica.Primeiro, criamos uma nova ferramenta para rastrear um biomarcador de células B pan que nos permite capturar uma gama de subconjuntos de células B e visualizá-los in vivo. Em segundo lugar, nosso método de análise medular permite a quantificação altamente precisa e reprodutível dos sinais de PET nesta região. A grande coisa sobre a nossa técnica é que ela é agnóstica de doenças.Pode ser usado desde a imagem pré-clínica até a clínica por PET em qualquer cenário em que as células B e/ou a medula espinhal sejam de interesse. 18 a 24 horas após a marcação radiológica e a injeção do anticorpo no camundongo, prepare o camundongo para a varredura aplicando gel ocular nos olhos. Certifique-se de que a cama de varredura de quatro mouses esteja equipada com uma almofada de aquecimento com isoflurano ajustado de 1,5 a 2% Coloque o mouse em posição supina na cama de digitalização e puxe suavemente a cauda do mouse para endireitar a coluna.Quando o rato estiver em posição supina, tape-o com fita adesiva macia sobre a cabeça e a barriga para minimizar o movimento da respiração. Faça um registro da posição de digitalização de cada mouse em um bloco de anotações de laboratório. Depois de fixar o primeiro grupo, feche a cama e verifique a colocação do leito executando uma tomografia computadorizada.Clique em CT Center Field of View e, uma vez que a cama esteja em posição, execute o exame de tomografia computadorizada para garantir que a colocação está correta. Repita até que a posição do leito esteja satisfatória. Coloque uma pequena fita branca sobre a cama do scanner para marcar o posicionamento correto da cama para o restante do estudo.Abra o menu Controlador de movimento e clique em Campo de visão do centro de PET para mover os mouses para o anel PET. Uma vez que o leito esteja no anel PET, inicie a sequência de varredura clicando em Executar, e aguarde até que o scanner conclua automaticamente o PET scan, e passe do anel PET para a TC para aquisição da TC. Desde a encefalomielite autoimune experimental, ou EAE, os ratos têm curvatura pronunciada da coluna vertebral devido à progressão da doença, escaneá-los enquanto estão de costas ajuda a endireitar a coluna.Faça uma incisão pelo lado dorsal do animal e remova a pele e o pelo para expor a coluna vertebral. Corte ao longo de três planos transversais através da coluna vertebral no pescoço, diretamente sob a caixa torácica e no topo da pelve para separar a região lombar das regiões cervical e torácica. Remova cuidadosamente a coluna vertebral segmentada para obter duas peças, torácica lombar e cervical.Em seguida, isole a coluna lombar cortando cuidadosamente a coluna vertebral da extremidade pélvica até que a medula lombar seja visível. Para expulsar a medula espinhal lombar, use uma seringa deslizante preenchida com PBS e crie um selo entre a seringa e a coluna vertebral usando o polegar e o indicador. Empurre suavemente o PBS através da seringa para expulsar a medula espinhal para uma almofada absorvente e repita para a medula espinhal torácica cervical inserindo a seringa do lado cervical.Coloque os tecidos da medula espinhal em um tubo de contagem gama. Registre o peso seco e adicione PBS para garantir que o tecido esteja no fundo do tubo para evitar a secagem. Coloque o tubo no gelo até ficar pronto para a contagem.Para iniciar a análise das regiões de interesse na medula espinhal, abra a Ferramenta de Região de Interesse 3D no menu Navegação. No cabeçalho Regiões de interesse, use o sinal de mais na parte inferior do menu para criar seis regiões de interesse, região lombar de interesse, região torácica cervical de interesse, esqueleto lombar, esqueleto torácico, medula espinhal lombar, medula espinhal torácica. Para evitar interferência visual do sinal PET, clique em F3 para desligar o PET.Vá para a parte superior do Operador da Ferramenta de Região de Interesse 3D e clique no ponto sólido à direita do símbolo do cursor para abrir o Modo de Pintura 3D e o menu Erode/Dilatar. Selecione Esfera e altere o tamanho para 20 pixels. Da mesma forma, defina dilatar para mais cinco.Antes de prosseguir, vá para a parte inferior do menu e verifique se a região lombar de interesse está selecionada. Na TC, encontrar a vértebra L6 da coluna vertebral. Começando com uma vértebra acima de L6, desenhe uma região lombar áspera de interesse sobre as cinco vértebras acima dos quadris.Em seguida, mude para a região cervical torácica de interesse e trace o restante da coluna até a base do crânio. Depois de desenhar as regiões de interesse generalizadas, vá para a parte superior do operador e selecione o menu Algoritmos de segmentação. No menu suspenso, selecione Otsu Thresholding, selecione a região lombar de interesse para a entrada e verifique se o esqueleto lombar é escolhido na parte inferior do menu.No menu suspenso ao lado de Imagem, verifique se a tomografia computadorizada está selecionada, indicada aqui pelo número zero. Clique em Aplicar e repita o procedimento para a região cervical torácica de interesse e esqueleto torácico. Depois de usar o Otsu Thresholding para criar as regiões de esqueleto de interesse, retorne ao menu Navegação e exclua a região de interesse ou marque a coluna H para as regiões torácicas lombares e cervicais ásperas de interesse para ocultá-las.Marque a coluna I para ambas as regiões esqueléticas de interesse, para que elas não possam ser editadas. Finalmente, retorne ao topo da Ferramenta de Região de Interesse 3D e vá para o menu Pintura 3D para desenhar as regiões da medula espinhal de interesse. Selecione a ferramenta Esfera novamente e trace a medula espinhal dentro do esqueleto para o lombar e o torácico, garantindo que a região correta de interesse seja selecionada na parte inferior do menu.Para apagar qualquer região de interesse, clique em Comando/Controle e desenhe sobre a peça a ser apagada. Verifique a região da medula espinhal de interesse a partir dos três planos para garantir que nenhuma região de interesse seja desenhada fora da coluna vertebral. Se o sinal PET foi desligado, pressione F3 depois que as regiões da medula espinhal de interesse forem desenhadas para ligar o PET novamente, ou selecione o Visual Controller e clique na barra PET.Volte para o menu Navegação. Clique no ícone Grade para mostrar a tabela. Copie a tabela para o software de planilha e salve o arquivo.A imagem PET revelou ligação elevada do radiotraçador no cérebro e na medula espinhal torácica de camundongos EAE em comparação com os camundongos virgens. A contagem gama ex vivo mostrou ligação aumentada nos segmentos espinhal torácico lombar e cervical, e no cérebro de camundongos EAE em comparação com virgens. Imagens de autorradiografia ex vivo mostraram aumento da ligação do radiotraçador em cortes cerebrais sagitais, especificamente no tronco encefálico, cerebelo e ventrículos de camundongos EAE em comparação com camundongos virgens.Da mesma forma, um aumento da ligação do radiotraçador foi observado nos segmentos da medula cervical torácica e lombar de camundongos EAE em comparação com a medula espinhal virgen. Após a PET e a contagem gama, podemos investigar a relação entre o sinal do PET e o alvo de interesse através de técnicas de biologia molecular, como citometria de fluxo e imunohistoquímica. Nossa técnica abriu caminho para que os pesquisadores fizessem perguntas sobre o papel in vivo das células B em várias áreas de doenças, incluindo acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, outras doenças autoimunes e câncer.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra o método de indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) injetando peptídeos derivados de mielina com um adjuvante para ativar células T autorreativas, que migram para o cérebro. A toxina da coqueluche é administrada para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que essas células T e outras células imunológicas entrem no cérebro. Essas células imunes causam desmielinização, levando ao comprometimento da transmissão nervosa e ao...

Geração de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

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Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

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Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

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Este protocolo tem o objetivo de monitorar as alterações in vivo da mielina (desmielinização e remielinização) por meio da tomografia de emissão de pósitrons (PET) em um modelo animal de esclerose múltipla.

Tomografia de emissão de pósitrons para medição in vivo de conteúdo de mielina no modelo de rato de lysolecithin de esclerose múltipla

Este protocolo descreve a metodologia para rastreamento não invasivamente de células T geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico in vivo com uma plataforma clinicamente disponível.

Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.

Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

Aprenda a quantificar células B CD19+ no sistema nervoso central usando imagem PET em camundongos com encefalomielite autoimune experimental. Esta técnica permite rastrear dinâmicas celulares in vivo com alta precisão.

Imagem de células B CD19+ em um modelo experimental de encefalomielite autoimune em camundongos usando tomografia por emissão de pósitrons (Vídeo) | JoVE Journal

Imagem de células B CD19⁺ em um modelo experimental de encefalomielite autoimune em camundongos usando tomografia por emissão de pósitrons

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