Aprendizagem associativa aversiva e formação de memória emparelhando dois produtos químicos em Caenorhabditis elegans

O aprendizado e a memória são vitais para que os animais sobrevivam e se reproduzam, navegando eficientemente em ambientes em constante mudança. É também um dos principais assuntos estudados em neurociência. Caenorhabditis elegans é um organismo atraente para o estudo da aprendizagem e da memória devido à simplicidade do seu sistema nervoso.

Seus diagramas de fiação química e elétrica também são completamente reconstruídos. A análise comportamental de Caenorhabditis elegans é extremamente complicada e é afetada por uma série de parâmetros, como tensões químicas, mecânicas e de temperatura. Para começar, prepare um meio de crescimento de nematoides de seis centímetros, ou placas NGM, espalhando 0,2 mililitros de uma cultura líquida de E.coli OP50 em um meio Luria-Bertani e incubando-os à temperatura ambiente por não mais de 24 horas.

No primeiro dia, escolha e coloque cinco animais gravídicos bem alimentados em cada placa NGM de seis centímetros com um catador de vermes de platina e deixe-os colocar cerca de 50 ovos por três horas à temperatura ambiente para obter uma população sincronizada de animais adultos. Para parar a postura de ovos, remova os animais pais das placas com um colhedor de minhocas de platina. Cultive os animais à temperatura ambiente por cerca de cinco dias para atingir o estágio adulto maduro, não o estágio adulto jovem.

Após cinco dias, recolher cerca de 200 animais adultos num coletor de animais, lavando cada placa com um mililitro de gelatina aquosa a 0,25%, o que impedirá a adesão dos animais à superfície de plásticos, como pontas de pipeta. Em seguida, lave os animais movendo suavemente o coletor para cima e para baixo duas vezes em 10 mililitros de água destilada duplamente. Repita o processo duas vezes.

Mergulhe suavemente o coletor de animais contendo cerca de 200 animais em 40 mililitros de uma mistura de 1%1-propanol e ácido clorídrico a pH 4 em um prato cristalizador por um segundo. Lave os animais no coletor imergindo muito suavemente o coletor uma vez em um poço de sua placa de cultura de tecido de 6 poços contendo 10 mililitros de água destilada duplamente. Em seguida, coloque o coletor em um gramado E.coli OP50 em uma placa NGM de seis centímetros por 10 minutos para que os animais descansem.

Em seguida, lave os animais no coletor com 10 mililitros de água destilada duplamente, movendo suavemente o coletor para cima e para baixo. Repita esta lavagem três vezes e prossiga para o ensaio de quimiotaxia. Lavar sequencialmente os animais num coleccionador com mistura de propanol e água destilada duplamente, uma vez cada um, tal como demonstrado anteriormente.

Em seguida, coloque o coletor em um gramado E.coli OP50 em um ágar NGM em uma placa de Petri de seis centímetros por 10 minutos para os animais descansarem. Em seguida, lave os animais três vezes, movendo suavemente o coletor para cima e para baixo duas vezes em 10 mililitros de água destilada dupla para evitar a contaminação bacteriana e prossiga para o ensaio de quimiotaxia. Prepare placas de trado para o ensaio de quimiotaxia em placas de Petri de plástico de seis centímetros.

Em seguida, use uma ponta de pipeta serrada com uma abertura de mais de um milímetro para transferir os animais do coletor para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros contendo um mililitro de gelatina aquosa a 0,25%. Depois que os animais se instalarem no fundo do tubo por gravidade, remova o sobrenadante do tubo. Ressuscite os animais em um mililitro de tampão de ensaio de quimiotaxia e deixe-os se acalmar por gravidade no fundo do tubo por cerca de um minuto.

Em seguida, remova o máximo de sobrenadante possível por pipetagnação. Em seguida, observe diagonalmente quatro microlitros de 1-propanol 5% aquoso em dois lugares e, em seguida, observe quatro microlitros de água destilada dupla em dois outros lugares na placa de Petri. Em seguida, use uma ponta de pipeta serrada com uma abertura de um milímetro para detectar seis microlitros da suspensão animal em um tampão de ensaio de quimiotaxia contendo cerca de 60 animais no centro de três placas.

Remova o líquido, tanto quanto possível, com um pavio de tecido de laboratório sem tocar nos animais. Coloque uma tampa na placa e deixe que os animais se movam livremente na placa por 10 minutos à temperatura ambiente. Para parar a quimiotaxia, transfira esta placa para uma placa de Petri de vidro no gelo por três minutos.

Em seguida, coloque o prato em uma geladeira até contar o número de animais no prato. Conte o número de animais em quatro seções, exceto aqueles no círculo central sob um microscópio estéreo, e calcule o índice de quimiotaxia usando a equação. A partir dos valores do índice de quimiotaxia, calcule os valores do índice de aprendizagem como a diferença entre o valor do índice de quimiotaxia dos animais de referência e o valor do índice de quimiotaxia dos animais condicionados.

No ensaio de quimiotaxia, os animais condicionados com a mistura de 1-propanol e ácido clorídrico não são atraídos por 5%1-propanol manchado em placas de ágar, enquanto animais ingênuos e de referência foram atraídos por 5%1-propanol. Os animais condicionados pelo treinamento espaçado com uma mistura de 1-propanol aquoso e ácido clorídrico não foram mais atraídos para 5%1-propanol em comparação com os animais tratados com 1%1-propanol ou ácido clorídrico, ou apenas água destilada duplamente. Estudar o efeito das mutações na memória revelou que a formação da memória de curto e longo prazo dependia dos genes que desempenhavam papéis essenciais no condicionamento clássico dos animais.

Após cada condicionamento, os animais devem ser suavemente lavados apenas uma vez com água destilada duplamente. Depois que a memória de longo prazo é formada usando o procedimento, a imagem de cálcio e a eletrofisiologia podem identificar circuitos neuronais responsáveis pela memória. Através de análises genéticas e de neurônio único, os processos de armazenamento e recuperação de memória podem ser abordados em níveis moleculares e de célula única.