Name: Noções Básicas de Histologia e Detecção de Morte Celular em Tecido de Abelhas Melíferas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda técnicas de imunohistoquímica para detectar apoptose e necrose em tecidos de abelhas melíferas. Este método avalia respostas celulares a pesticidas no intestino médio e glândulas hipofaringeanas.

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Agradeço o apoio da Agência Eslovena de Investigação, subvenção n.º P4-133.

1. Histologia básica para pesquisa de abelhas
<ol><li>Dissecção do tecido das abelhas melíferas NOTA: Para a dissecação de abelhas operárias, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz LED. A ampliação mais útil é ~20x.<ol><li>Manipulação e dissecação<ol><li>Pegue cuidadosamente uma abelha operária com fórceps e coloque-a no gelo (ou no congelador a -20 °C) durante 2 minutos para imobilizá-la22. Prenda a abelha na placa de Petri diagonalmente através da porção superior das costas do tórax duas vezes, da esquerda para a direita e da direita para a esquerda.</li>
			<li>Despeje soro fisiológico de insetos para cobrir o corpo. Coloque a placa de Petri sob o microscópio, foque e ajuste.</li>
			<li>Prepare os instrumentos (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		</ol></li>
		<li>Dissecção do intestino médio<ol><li>Comece com o abdômen inserindo um ponto da tesoura sob o tergito A5 (Figura 1) no centro do lado direito do corpo da abelha. Corte para o tergito A2.</li>
			<li>Mantenha a lâmina interna da tesoura paralela com o lado do corpo para evitar danificar os órgãos internos. Vire a tesoura para a esquerda e faça um corte; vire à direita e faça outro corte. Abra suavemente a parte esquerda do abdômen e fixe-a. Repita do outro lado.</li>
			<li>Usando fórceps com uma mão, puxe suavemente o estômago das abelhas para cima e, com uma tesoura na outra mão, corte no final do esôfago. Puxe o estômago e o intestino médio para longe do abdômen e corte no reto. Use uma pipeta com solução salina de insetos e remova quaisquer fezes ou partes do tecido.</li>
		</ol></li>
		<li>Dissecção de HPGs<ol><li>Imobilizar uma abelha operária no gelo, conforme descrito na etapa 1.1.1. Corte a cabeça e coloque-a na placa menor com as antenas voltadas para cima. Prenda a cabeça com dois pinos: um através do olho composto esquerdo e o segundo através do olho composto direito.</li>
			<li>Faça um corte no primeiro olho composto no lado interno dos pinos, continue até o labrum e, em seguida, faça outro corte do outro lado através do segundo olho composto (Figura 2).</li>
			<li>Corte as antenas. Retire a máscara e corte onde ainda estiver preso. Pegue a pinça e remova cuidadosamente as glândulas junto com o cérebro e parte dos olhos compostos.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Fixação, desidratação e incorporação de parafina NOTA: Use luvas de proteção.<ol><li>Coloque o tecido em frascos de penicilina, preenchidos 3/4 com 10% de formalina. Conservar no frigorífico a 4 °C.</li>
		<li>Após 24 h, desidratar o tecido em uma série de álcoois: 70%, 80%, 90%, 100%, por 1 h cada, 100% 2-propanol por 1 h, 100% 2-propanol por 12 h e, finalmente, 100% 2-propanol por 1 h.</li>
		<li>Coloque o tecido em histocassetes; marcá-los e colocá-los nas câmaras de vidro com 2-propanol e parafina (1:1) numa incubadora a 60 °C durante 24 h.</li>
		<li>Mover as histocassetes para outra câmara com parafina (I.) por mais 24 h. Repetir o procedimento com parafina fresca mais duas vezes (II. e III.), ambas por 24 h.</li>
		<li>Finalmente, prepare a estação de montagem e comece a incorporar o tecido em cera.<ol><li>Abra cada histocassete e remova a tampa. Encha o molde com cera e coloque cuidadosamente o tecido com pinça quente no meio do molde.</li>
			<li>Coloque o histocassete no molde e cubra-o ligeiramente com cera. Coloque imediatamente o molde na superfície fria da estação de montagem por alguns segundos e, em seguida, coloque-o na placa fria por alguns minutos até que a cera endureça e se separe do molde e da histocassete.</li>
		</ol></li>
		<li>Armazenar as amostras acabadas em uma caixa, longe de poeira e calor.</li>
		<li>Corte seções finas de 4 μm em um micrótomo: primeiro, duas seções anexadas uma à outra e, em seguida, uma separadamente. Transferir as secções com pinça e deixá-las flutuar em água destilada (42 °C) e, em seguida, recolha-as em lâminas limpas, colocando duas secções juntas no lado esquerdo do vidro da objetiva e a terceira no lado direito, permanecendo distintamente separadas. Deixe as lâminas marcadas durante a noite no dispositivo de aquecimento e, finalmente, guarde-as em uma caixa dedicada a amostras de histologia.</li>
	</ol></li>
	<li>Desparafinação e reidratação NOTA: Use luvas de proteção.<ol><li>Prepare nove frascos Coplin e coloque as seções em uma série de agentes de compensação (I., II., III.) por 5 minutos cada.</li>
		<li>Colocar em 2-propanol, etanol 96% (I., II.), álcool 90% e 80%, e água destilada por 3 min cada.</li>
	</ol></li>
	<li>Tingimento com hematoxilina e eosina NOTA: Use luvas de proteção.<ol><li>Prepare seis frascos de Coplin.</li>
		<li>Para coloração de hematoxilina e eosina (H &amp; E), coloque as seções desparafinadas e reidratadas em hematoxilina por 5 minutos e, em seguida, coloque-as cuidadosamente sob a água corrente da torneira por 2 minutos. Em seguida, coloque-os em água destilada por 1 min e eosina por 4 min (para eosina, o frasco Coplin não é necessário).</li>
		<li>Coloque as lâminas em etanol 96% por 1 min, depois 2-propanol por 2 min e, finalmente, no agente de compensação por 2 min.</li>
		<li>Adicione o meio de montagem e um vidro de cobertura e deixe-os secar. Observe sob um microscópio de luz.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig01.jpg"> Figura 1: Vista dorsal do corpo das abelhas. Tergites A1-A7. As instruções detalhadas sobre a dissecção de abelhas podem ser encontradas em Carreck et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig02v2.jpg"> Figura 2: Vista dorsal de HPGs, partes de olhos compostos ligados ao cérebro (não visíveis). Uma jovem abelha operária com idade entre 5 e 6 dias tem HPGs brancos rechonchudos e cremosos. Os ácinos estão localizados no cérebro e preenchem a área da cabeça com ramos que atingem a parte de trás do cérebro. Nas abelhas forrageadoras, essas glândulas são muito encolhidas e deixam apenas restos finos semelhantes a fios. Por esta razão, é melhor remover as glândulas juntamente com o cérebro para facilitar em procedimentos adicionais para evitar a perda do tecido. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Detecção de morte celular em cortes de tecido
<ol><li>Kit de detecção de apoptose (Ensaio A) NOTA: Siga o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de materiais).<ol><li>Prepare os frascos de Coplin.</li>
		<li>Após a desparafinagem e reidratação (ver passo 1.3), imergir as lâminas em solução de NaCl a 0,85% e, em seguida, em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (5 min).</li>
		<li>Coloque as lâminas em paraformaldeído a 4% 2 x 15 min.</li>
		<li>Coloque as lâminas planas no recipiente e adicione 100 μL de uma solução de proteinase K (20 μg/mL) e, em seguida, deixe-as por 10-30 min.</li>
		<li>Coloque os slides no PBS (5 min).</li>
		<li>Coloque as lâminas em paraformaldeído a 4% em PBS (5 min).</li>
		<li>Mergulhe os slides em PBS (2 x 5 min).</li>
		<li>Coloque as lâminas planas no recipiente, adicione 100 μL de tampão de equilíbrio e deixe-as por 5-10 min.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de mistura de reacção TdT. Coloque toalhas de papel dentro do recipiente, ao redor dos escorregadores, umedeça as toalhas com água e, em seguida, cubra com filme plástico. Incubar lâminas durante 60 min a 37 °C.</li>
		<li>Coloque as lâminas de volta no rack de coloração e mergulhe em 2x citrato salino-sódico (SSC) por 15 min.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas 3 x 5 min em PBS, depois em peróxido de hidrogênio a 0,3% por 3-5 min e, em seguida, em PBS novamente, 3 x 5 min.</li>
		<li>Novamente, coloque as lâminas planas no recipiente, adicione 100 μL de Streptavidin HRP (peroxidase de rábano) e deixe por 30 minutos (cubra com filme plástico).</li>
		<li>Mergulhe os slides 3 x 5 min em PBS.</li>
		<li>Colocar as lâminas planas no recipiente e adicionar 100 μL de solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Procure um fundo castanho claro.</li>
		<li>Devolva as corrediças ao rack e lave-as várias vezes em água (duplamente destiladas).</li>
		<li>Monte as lâminas sob tampas de vidro no meio de montagem e deixe planas para secar.</li>
		<li>Observe sob um microscópio de luz.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de detecção de apoptose (Ensaio B) NOTA: Siga o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de materiais).<ol><li>Prepare frascos de Coplin.</li>
		<li>Preparar a proteinase K (20 μg/ml diluídos em PBS).</li>
		<li>Após a desparafinagem e reidratação das secções (passo 1.3), colocar as lâminas em PBS durante 5 min.</li>
		<li>Colocar as lâminas planas no recipiente e adicionar proteinase K (20 μg/ml, 60 μL por provete de 5 cm²).</li>
		<li>Lave as lâminas 2 x 2 min em água destilada.</li>
		<li>Têmpera em peroxidase endógena (em peroxidase de hidrogênio a 3%) à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave as lâminas 2 x 5 min com PBS ou água.</li>
		<li>Coloque as lâminas planas no recipiente e aplique o tampão de equilíbrio (75 μL/5 cm2) por 10 s à temperatura ambiente.</li>
		<li>Limpe cuidadosamente ao redor do tecido.</li>
		<li>Adicionar a enzima TdT (desoxinucleotidil transferase terminal) a cada secção e incubar numa câmara humidificada durante 1 h a 37 °C. Coloque toalhas de papel dentro da bandeja, ao redor das lâminas, umedeça as toalhas com água e cubra-as com filme plástico.</li>
		<li>Após a incubação, coloque os corpos de prova no rack e deixe-os em tampão stop/wash (10 min).</li>
		<li>Aqueça o conjugado antidigoxigenina à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave as lâminas em PBS (3 x 1 min).</li>
		<li>Limpe cuidadosamente ao redor do tecido.</li>
		<li>Adicionar duas gotas de conjugado Anti-Digoxigenina-Peroxidase (65 μL/5 cm²) às secções e incubar durante 30 minutos num recipiente humidificado.</li>
		<li>Após a lavagem em PBS 4 x 2 min, prepare o substrato de peroxidase resistente ao trabalho e bata suavemente o excesso de líquido e aspirar ao redor da seção.</li>
		<li>Cobrir as seções com substrato de peroxidase (75 μL/5 cm²) e corar por 5 min. Coloque uma lâmina sob o microscópio e determine o tempo de coloração ideal.</li>
		<li>Lave as lâminas em um suporte de coloração em água destilada (3 x 1 min).</li>
		<li>Incubar as lâminas em água destilada por 5 min.</li>
		<li>Contra-mancha usando hematoxilina por 2 min.</li>
		<li>Coloque o escorregador sob água corrente da torneira por 3 min.</li>
		<li>Lave o escorregador em água destilada.</li>
		<li>Monte as lâminas sob tampas de vidro no meio de montagem e deixe planas para secar.</li>
		<li>Observe sob um microscópio de luz.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de detecção de apoptose (Ensaio C) NOTA: Siga o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de materiais).<ol><li>Prepare os frascos de Coplin.</li>
		<li>Descerar e reidratar as secções de tecido (ver passo 1.3).</li>
		<li>Incubar o tecido com proteinase K (15-30 min a 37 °C).</li>
		<li>Coloque as corrediças de volta no rack e enxágue 2x em PBS.</li>
		<li>Cobrir com 50 μL de «mistura de reacção TUNEL». Coloque as toalhas de papel molhadas dentro do recipiente, cubra-as com filme plástico e deixe-as por 60 min a 37 °C.</li>
		<li>Enxaguar 3x com PBS.</li>
		<li>Coloque as lâminas no recipiente e seque a área ao redor da amostra de tecido.</li>
		<li>Adicionar 50 μL de Converter-AP à amostra e incubar num recipiente humidificado durante 30 minutos a 37 °C.</li>
		<li>Enxaguar 3x em PBS.</li>
		<li>Adicione 50-100 μL de solução de substrato e deixe por 10 min no escuro. NOTA: Observe a coloração sob um microscópio de luz.</li>
		<li>Lave as lâminas 3x com PBS.</li>
		<li>Contra-manchar transferindo seções para hematoxilina por 2 minutos e, em seguida, enxaguar cuidadosamente em água corrente da torneira por 5 minutos.</li>
		<li>Monte as lâminas sob as tampas de vidro em um meio de montagem aquoso e deixe-as planas para secar.</li>
		<li>Observe sob um microscópio de luz. Avalie as células afetadas (positivas) contando de 70 a 100 células em cada amostra do intestino médio ou HPGs sob um microscópio de luz.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+the+salivary+gland+of+the+blow+fly+Calliphora+vomitoria%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+Techniques%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria.</a> Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).</li>
<li>D'Arcy, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%3A+a+review+of+the+major+forms+of+apoptosis%2C+necrosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy.</a> Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).</li>
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<li>Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+apoptosis+and+necrosis+in+monolayer+cultures+by+TUNEL+and+trypan+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining.</a> BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).</li>
<li>Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+using+a+modified+in+situ+TUNEL+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).</li>
<li>Gregorc, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29+larvae+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut.</a> Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).</li>
<li>Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+honey+bee+%28Apis+mellifera%29+larvae+treated+with+oxalic+or+formic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid.</a> Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).</li>
</ol>

O autor não tem conflitos de interesse.

Em organismos vivos, a morte celular é definida como apoptose ou necrose25 e pode ser acompanhada de autofagia26. A diferença entre células apoptóticas e necróticas é que a apoptose é uma forma de morte celular programada e aparece em células normais, enquanto a necrose ocorre devido a condições letais (por exemplo, acidente, doença)27,28. A apoptose pode ser detectada usando kits de ensaio baseados na técnica TUNEL...

As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) são, entre outros polinizadores silvestres, os mais importantes polinizadores das plantas agrícolas. Ao longo de milhares de anos, o ambiente em mudança influenciou as abelhas a adaptar sua morfologia, fisiologia, comportamento e tolerância a vários patógenos e parasitas. Portanto, as abelhas desenvolveram uma gama altamente diversificada de espécies e subespécies em todo o mundo1. Esses resultados são consistentes com achados anteriores, de que há variação genética na estrutura do trato digestivo da abelha, mas também sugerem que as alterações do intestino médio são devidas a fatores ambientais 2,3.
O trato digestivo da abelha tem três partes principais: intestino anterior, intestino médio (ventrículo) e intestino posterior4. O ventrículo é um órgão essencial para a digestão do pólen e néctar/mel; no intestino posterior, o controle osmótico ocorre por meio da absorção de água e íons2. As glândulas hipofaríngeas (HPGs) das operárias das abelhas estão localizadas na cabeça e sintetizam e secretam componentes de geleia real para alimentar a ninhada, a rainha e os membros da colônia. Seu tamanho muda com a idade e as tarefas e depende de uma nutrição adequada (pólen de qualidade). Enfermeiros trabalhadores com idade entre 6 e 18 dias realizam a criação de ninhadas, e o tamanho dos HPGs aumenta 5,6. Nas abelhas forrageiras, os HPGs degeneram e apenas secretam enzimas importantes para converter os açúcares complexos em açúcares simples (α-glucosidases, leucina arilamidase, invertase) no mel7.
As abelhas são expostas a vários estressores bióticos e abióticos8, e o trato digestivo pode ser afetado por vários estimulantes negativos. A primeira barreira que protege o organismo de patógenos é a membrana peritrófica no intestino médio, que consiste na mucosa intestinal para proteção contra patógenos4. O desenvolvimento e a função dos HPGs dependem da dieta, da idade e da condição dacolônia9, e são afetados por inseticidas, acaricidas 10 e patógenos11,12,13. Os resíduos de acaricidas na colmeia devido ao tratamento de controle de varroa e os agrotóxicos do ambiente afetam abelhas forrageiras e abelhas enfermeiras14,15. A maior ameaça às colônias de abelhas é o ácaro Varroa destructor, tanto como vetor de vírus que contribuem para a perda de colônias16 quanto como consumidor do corpo gordo do hospedeiro (importante órgão vital nas abelhas), o que, consequentemente, afeta o corpo do indivíduo e as funções da colônia17.
No entanto, habitats intensivos de terras agrícolas podem fornecer um suprimento de alimentos a curto prazo para as abelhas. Por conseguinte, os regimes agro-ambientais devem aumentar a disponibilidade de flores de mel nas paisagens agrícolas18. Para avaliar a morfologia de diferentes subespécies 6,19,20,21 ou os efeitos subletais desses fatores nos níveis celular ou tecidual, especialmente intestino médio e HPGs, métodos histológicos e imuno-histoquímicos são práticos e suficientemente precisos para serem utilizados em pesquisas histológicas em abelhas.

<table><tbody><tr><td>Kit de peroxidase 2-Propanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag (detecção de apoptose in situ da peroxidase ApopTag)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7100</td><td>Ensaio B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Controles positivos incluídos no S7101</td></tr><tr><td>Cobre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>o sistema TUNEL Colorimétrico DeadEnd</td><td>Promega</td><td>G7360</td><td>Ensaio A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação&nbsp; (para dissecação de abelhas)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td></td><td>destilada</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>de incorporação</tr><tr><td>EnVision System kit de fosfatase alcalina</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>álcool Etanol</td><td></td><td></td><td>95% (ou menos puro), 90%, 80%</td></tr><tr><td>Meio de montagem Faramount, aquoso</td><td>Mesa</td> de <td>achatamento média de montagem</td>Dako <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&nbsp; (para dissecação de abelhas)</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11294-00</td><td>Padrão #4</td></tr><tr><td>Formalina 10%</td><td></td><td></td><td>Formaldeído</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoChoice Clearing Agent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Clearing agent</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxidase 3%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insect pins&nbsp; (para dissecação de abelhas)</td><td>Entosphinx</td><td>44594</td><td>Pinos de inseto em aço inoxidável - branco, tamanho 2</td></tr><tr><td>ISCDDK, AP (Kit de Detecção de Morte Celular In Situ, Fosfatase Alcalina)</td> <td>Ensaio</td><td>11684809910</td><td>Roche C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf</td></tr><tr><td>KH2PO4Relógio de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>laboratório</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td><td></td><td></td> de microscópio <td>A caixa com as lâminas deve ser preservada em um filme plástico para evitar poeira</td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estação modular de incorporação de tecidos</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 4%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetas</td><td></td><td></td><td>1,5 mL; 3 mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri&nbsp; (para dissecação de abelhas)</td><td></td><td></td><td>Preenchido com silício de condensação&nbsp; (Xantopreno L azul e ativador líquido universal plus)</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>21627</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Ringers&nbsp; (para dissecação de abelhas)</td><td></td><td></td><td>7,5 g de NaCL, 2,38 g de Na2HPO4, 2,72 g KH2PO4, 1 L de água destilada</td></tr><tr><td>Tesoura (para dissecação de abelhas)</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>1406-09, 14061-09</td><td>Reta e curva, 9 cm</td></tr><tr><td>Ativador universal de líquido plus&nbsp; (para dissecação de abelhas)</td><td>Relojoeiro Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>' s (para dissecação de abelhas)</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Pincel</td><td></td><td></td> de aquarela <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr> 2x <tr><td>Xantoprene L azul&nbsp; (para dissecação de abelhas)</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

noções básicas de histologia e detecção de morte celular em tecido de abelhas melíferas

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) dentro da colmeia (enfermeiras e outras abelhas da colmeia) e fora da colmeia (forrageiras) estão expostas a mudanças climáticas e climáticas, vários pesticidas, patógenos e desnutrição, entrando principalmente pela boca e afetando principalmente os tratos digestivos das abelhas adultas. Para entender e prevenir os efeitos de tais estressores externos e internos nas abelhas, um método de pesquisa útil é o método imuno-histoquímico. Um protocolo básico é descrito para preparar o intestino médio (ventrículo) e as glândulas hipofaríngeas (HPGs) de abelhas adultas para análise histológica. Uma metodologia detalhada é descrita para avaliar o nível de dano celular e distinguir necrose de morte celular programada (apoptose) como um processo natural de regeneração tecidual. Os resultados do tratamento de abelhas adultas com ácido oxálico e pesticidas (inseticida e acaricida) e a determinação da morte celular no ventrículo e HPGs são apresentados. Os prós e contras da metodologia também são discutidos.

Detecção de morte celular no intestino médio Abelhas operárias recém-surgidas (Apis mellifera carnica) do apiário experimental do Instituto Agrícola da Eslovênia em Liubliana foram tratadas individualmente com ácido oxálico (OA) a 3%23. O OA é frequentemente usado na apicultura para controle de destruidores de Varroa . Após o tratamento, as abelhas operárias (três de cada grupo) foram imobilizadas sobre gelo. O intestino médio foi dissecado e fixado em formali...

Métodos imuno-histoquímicos são úteis na pesquisa de abelhas para detectar e avaliar o nível de apoptose e necrose no intestino médio e nas glândulas hipofaríngeas de abelhas adultas.

Noções Básicas de Histologia e Detecção de Morte Celular em Tecido de Abelhas Melíferas

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

Este protocolo é útil em muitos estudos biológicos e toxicológicos de abelhas tratadas com pesticidas. Ajuda a detectar as respostas celulares do tecido das abelhas melíferas dos acaricidas que são utilizados em colónias de abelhas para o tratamento contra os ácaros Varroa. É uma ferramenta poderosa para a detecção de efeitos sub-pouco sobre o tecido em combinação com o comportamento de abelhas ou outros insetos benéficos.Para começar, pegue cuidadosamente uma abelha operária com fórceps e coloque-a no gelo ou no congelador a menos 20 graus Celsius por dois minutos para imobilizá-la. Prenda a abelha na placa de Petri diagonalmente através da porção superior traseira do tórax duas vezes da esquerda para a direita e da direita para a esquerda. Pobre soro fisiológico de insetos para cobrir o corpo.Coloque a placa de Petri sob o estereomicroscópio, foque e ajuste. Para dissecar o intestino médio, comece com o abdômen inserindo um ponto da tesoura sob o tergito A5 no centro do lado direito do corpo da abelha. Corte para o tergito A2. Mantenha a lâmina interna da tesoura paralela com o lado do corpo para evitar danificar os órgãos internos.Vire a tesoura para a esquerda e corte. Abra suavemente a parte esquerda do abdômen e fixe-a. Usando fórceps com uma mão, puxe suavemente o estômago das abelhas para cima e, com uma tesoura na outra mão, corte no final do esôfago.Puxe o estômago e o intestino médio para longe do abdômen e corte no reto. Use uma pipeta com solução salina de insetos e remova quaisquer fezes ou partes do tecido. Para dissecção das glândulas hipofaríngeas, imobilize uma abelha operária no gelo, conforme descrito anteriormente.Corte a cabeça e coloque-a em uma placa menor com a antena voltada para cima. Prenda a cabeça com dois pinos, um através do olho composto esquerdo e o segundo através do olho composto direito. Faça um corte no primeiro olho composto no lado interno dos pinos, continue até o labrum e, em seguida, faça outro corte do outro lado no segundo olho composto.Corte as antenas. Retire a máscara e corte onde ainda estiver preso. Pegue a pinça e remova cuidadosamente as glândulas junto com o cérebro e parte dos olhos compostos.Para coloração de hematoxilina e eosina, coloque as seções desparafinadas e reidratadas em hematoxilina por cinco minutos. Em seguida, coloque-os cuidadosamente sob água corrente da torneira por dois minutos. Em seguida, coloque-os em água destilada por um minuto e eosina por quatro minutos.Coloque as lâminas de etanol a 96% por um minuto, depois 2-propanol por dois minutos e, finalmente, no agente de compensação por dois minutos. Adicione o meio de montagem e um vidro de cobertura e deixe-os secar. Observe sob um microscópio de luz.Prepare frascos de Coplin. Prepare proteinase-K. Após a desparafinagem e reidratação das seções, coloque as lâminas em PBS por cinco minutos.Coloque as lâminas planas no recipiente e adicione proteinase-K. Lave as lâminas em água destilada. Têmpera em peroxidase endógena à temperatura ambiente.Lave as lâminas com PBS ou água. Coloque as lâminas no recipiente e aplique o tampão de equilíbrio por 10 segundos à temperatura ambiente. Depois de limpar o tecido, adicione a enzima desoxinucleotidil transferase terminal a cada seção e incube em uma câmara umidificada por uma hora a 37 graus Celsius.Antes da incubação, coloque toalhas de papel umedecidas dentro da bandeja ao redor das lâminas e cubra-as com filme plástico. Após a incubação, coloque os espécimes no rack e deixe-os em buffer stop-wash. Depois de lavar as lâminas em PBS e limpar ao redor dos tecidos, adicione duas gotas de conjugado quente anti-digoxigenina peroxidase às seções e incube por 30 minutos em um recipiente umidificado.Após a lavagem em PBS, prepare o substrato de força de trabalho peroxidase, cubra as seções com substrato de peroxidase e core por cinco minutos. Coloque a lâmina sob o microscópio e determine o tempo de coloração ideal. Depois de lavar as lâminas em um suporte de coloração e água destilada, incubar as lâminas em água destilada por cinco minutos.Contra-coloração usando hematoxilina por dois minutos. Lave as lâminas colocando-as sob água corrente da torneira por três minutos e, em seguida, em água destilada. Monte as lâminas sob as lâminas de cobertura de vidro e o meio de montagem e deixe plana para secar.Observe sob um microscópio de luz. A porcentagem de células afetadas foi calculada usando um microscópio de luz. Os resultados indicaram que o tratamento com ácido oxálico afetou significativamente as células do intestino médio.A imunocoloração mostrou produtos de reação vermelhos ou marrons positivos nos núcleos apoptóticos das glândulas hipofaríngeas. O produto de reação positiva após o tratamento com imidaclopride ou coumaphos foi determinado na maioria das células glandulares. Ao levantar a máscara da cabeça de abelha, tome cuidado para não danificar ou retirar as partes das glândulas hipofaríngeas.Esta técnica detecta alterações subclínicas nas abelhas e também é adequada para a detecção de outros efeitos ambientais nas abelhas e em alguns outros organismos vivos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Abelhas pode ser condicionado em um paradigma de aprendizado apetitivo olfativo (PER-condicionado). Usando odores como estímulos, estabelecemos um método em que o comportamento é gravado simultaneamente imagens de cálcio é usado para medir a atividade do odor evocado nos neurônios do corpo de...

In vivo Ca 2 + - Imagem de Neurônios Corpo Mushroom durante o aprendizado olfativo no Honey Bee

Apresenta-se um protocolo simples de visualizar regiões de morte celular programada (PCD) em embriões de ratinho e de diferenciação estaminais embrionárias de culturas (ES) de células utilizando um corante altamente solúvel chamada Lyso Tracker.

Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Em trabalhadores da abelha do mel, o envelhecimento depende de comportamentos sociais, em vez de idade cronológica. Aqui nós mostramos como trabalhador-tipos com padrões muito diferentes de envelhecimento podem ser obtidas e analisadas para a senescência celular.

Obtenção de amostras com retardado, acelerado e invertida Envelhecimento no Modelo Bee Mel

Micropartículas verter à membrana celular (MPs) são vesículas biológicas activas que podem ser isolados e os seus efeitos patofisiológicos investigados em vários modelos. Descrevemos aqui um método para a geração de MPs derivadas de linfócitos T (LMPS) e para demonstrar o seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias respiratórias.

Geração de Lymphocytic micropartículas e Detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas

O tecido adiposo (TA) pode influenciar a homeostase de todo o corpo, portanto, entender os mecanismos moleculares de diferenciação e função dos adipócitos é importante. Fornecemos um protocolo para obter novos insights sobre esses processos, analisando a homeostase, diferenciação e exposição à hipóxia dos adipócitos como um modelo para a apoptose induzida de adipócitos.

Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

Drosophila é amplamente usado como um sistema modelo para estudar a neurodegeneração. Este protocolo descreve um método pelo qual a degeneração, como determinado pela formação de vacúolo no cérebro, podem ser quantificados. Ela também minimiza os efeitos devido ao procedimento experimental por meio de processamento e controlo de moscas e de seccionamento experimentais como uma amostra.

Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; Drosophila</em

O vaso dorsal abdominal da abelha e de outros insetos serve como o equivalente funcional do coração dos mamíferos e desempenha um papel importante no transporte de nutrientes, remoção de resíduos, função imunológica e muito mais. Aqui descrevemos um protocolo para a visualização e manipulação farmacológica da frequência cardíaca das abelhas.

Dissecção e Observação de Honey Bee Dorsal navio de Estudos da função cardíaca

Para testar os efeitos inibitórios dos agentes farmacológicos na fosfolipase C (PLC) em diferentes regiões do cérebro de abelhas, apresentamos um ensaio bioquímico para medir a atividade PLC nessas regiões. Este ensaio pode ser útil para comparar a atividade PLC entre os tecidos, assim como entre abelhas exibindo comportamentos diferentes.

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

Hipofaringe glândula acinus tamanho é uma medida robusta de nutrição de abelhas de mel de enfermeira. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para dissecar, coloração, imagem e medição ácinos de glândula enfermeira abelha hipofaringe.

Medição de hipofaringe glândula Acinus tamanho em trabalhadores de abelhas (Apis mellifera)

Apresentado aqui é um protocolo para usar o sistema CRISPR-Cas9 para reduzir a produção de uma proteína no cérebro de abelha adulta para testar a especificidade do anticorpo.

Testes anticorpos anti-RDL e Anti-mglutr1 em seções cerebrais de abelhas usando CRISPR-Cas9

Aprenda técnicas de imunohistoquímica para detectar apoptose e necrose em tecidos de abelhas melíferas. Este método avalia respostas celulares a pesticidas no intestino médio e glândulas hipofaringeanas.

Noções Básicas de Histologia e Detecção de Morte Celular em Tecido de Abelhas Melíferas

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